用于治疗或预防纤维增生性疾病的药物

文献发布时间：2023-06-19 11:06:50

技术领域

本发明涉及骨形态发生蛋白4（Bone Morphogenetic Protein 4, BMP4）的医药用途，具体涉及BMP4在纤维增生性疾病的治疗中的应用。

背景技术

纤维化（fibrosis）是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类疾病的终末期改变，也就是正常的组织被损坏后经过异常修复导致结构异常。

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一种病因不明、进展迅速、预后极差、致死率极高的间质性肺疾病，缺乏有效治疗方法。其典型病理特征为弥漫性肺间质胶原沉积、瘢痕形成，进行性、不可逆的肺泡结构破坏及弥漫性纤维化，多数病人因换气功能障碍而死于呼吸衰竭。该病的常见病因包括感染、粉尘、药物、吸烟和自身免疫性疾病等。

特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF），是一种病因不明的肺纤维化，也是肺纤维化中最常见和最严重的一种，有时呈急性恶化。IPF的特征是肺成纤维细胞/肌成纤维细胞过度增殖和胶原沉积，破坏肺部结构和功能。成纤维细胞和肌成纤维细胞在成纤维细胞灶中激活并聚集，产生过量的细胞外基质。IPF患者肺功能呈进行性下降，最终因呼吸衰竭死亡，确诊后的平均存活期仅为3-5年，5年病死率超过40%。

尽管对纤维化（包括肺纤维化）进行了大量的研究，但其病因和发病机制尚未完全清楚，至今仍缺乏有效的治疗手段。针对IPF的上市药物只有两个，分别是吡非尼酮和尼达尼布，但其都不能有效提高患者生存期，且治疗费用高。目前，肺移植是唯一能够有效延长生存期的治疗方法，但也受到诸多应用条件的限制。

因此，有必要提供更多能够有效治疗或预防纤维化的方法和手段。

发明内容

本发明的一方面提供BMP4蛋白在制备用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病的药物中的应用。在一些实施方式中，所述BMP4蛋白是游离的BMP4蛋白。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。在一些实施方式中，所述游离的BMP4蛋白是从天然来源纯化得到的，或者是通过基因工程方法得到的重组BMP4蛋白。

本发明的另一方面提供了一种治疗或预防对象的纤维增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的BMP4蛋白，其中所述BMP4蛋白是游离的BMP4蛋白。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。在一些实施方式中，所述游离的BMP4蛋白是从天然来源纯化得到的，或者是通过基因工程方法得到的重组BMP4蛋白。

本发明的另一方面提供了一种表达BMP4蛋白的重组载体，其包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ IDNO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。

本发明的另一方面提供了一种治疗或预防对象的纤维增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的重组载体，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ IDNO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

本发明的另一方面提供了本发明的重组载体在制备用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病的药物中的应用，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，该载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

本发明的另一方面提供了一种在对象中治疗或预防纤维增生性疾病的药物组合物，其中该药物组合物包含重组载体和药学上可接受的赋形剂，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ IDNO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

本发明的另一方面提供了一种治疗或预防对象的纤维增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含重组载体和药学上可接受的赋形剂，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ IDNO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

本发明的另一方面提供了本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病的药物中的应用，其中该药物组合物包含重组载体和药学上可接受的赋形剂，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO:29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

在一些实施方式中，本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物被施用于对象后引起BMP4蛋白在所述对象的细胞中表达增加。在一些实施方式中，本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物被施用于对象后引起

附图说明

图1：相对正常对照肺组织而言，IPF患者肺组织中BMP4的表达显著降低。A：蛋白条带图；B：条带灰度分析统计结果；C：mRNA表达情况统计结果；D：人肺组织切片免疫荧光图；Control：正常对照组，n=19；IPF：肺纤维化组，n=16。

图2：博莱霉素（Bleomycin，BLM）诱导小鼠肺组织中BMP4蛋白表达降低。A：条带灰度分析统计结果；B：蛋白条带图。

图3：

图4：

图5：

图6：

图7：

图8：

图9：BMP4过表达对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的预防和治疗作用的影响。（A）BMP4过表达对博来霉素诱导肺纤维化小鼠肺功能的影响；（B）BMP4过表达对博来霉素诱导肺纤维化小鼠肺病理的影响。

图10A：

图10B-10D：外源性加入BMP4重组蛋白对TGF-β1诱导的小鼠原代成纤维细胞转化的影响。

图11A-11C：

图11D-11F：外源性加入BMP4重组蛋白对TGF-β1诱导的小鼠原代成纤维细胞转化的影响。E、F：条带灰度分析统计结果，n=5。

图12：

具体实施方式

定义

在本发明中，术语“治疗”是指疗法上的以及预防性的措施，其阻止或减缓对象发生不期望的生理学改变或病症，例如肺部纤维化的发生或癌症进展。有利或期望的临床效果包括，但不限于，症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化（即不恶化）、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的减轻或缓和以及疾病的部分或全部治愈，而不论上述效果是否可检测到。“治疗”也可指与不治疗相比生存期延长。需要治疗的对象包括已患有该疾病或病症的对象，以及有可能患有该疾病或病症的对象，或要预防该疾病或病症的对象。

“对象”或“患者”、“个体”是指任何期望进行诊断、预后或治疗的对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物包括人、家畜、农畜、动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文所称的对象优选是人。

本文所用的术语“有治疗需要的患者”或“有治疗需要的对象”包括因施用本发明用于例如检测、诊断和/或治疗用途的多肽或其组合物而受益的对象，如哺乳动物对象。

如本文中所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明的药物或药物组合物单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。

在本发明中，“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定（即测量体系的限度）。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

本领域普通技术人员还应该理解，可以修饰基因的基因组，使得它们在核苷酸序列上与它们所衍生出的修饰的多核苷酸不同。例如，从指定的DNA序列衍生的多核苷酸或核苷酸序列可以是相似的，例如与起始序列具有一定的百分比同一性，例如它可以与起始序列60%、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。

此外，可以进行核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入，以在“非必需”区域进行保守取代或改变。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列，除了一个或多个单独的氨基酸取代、插入或缺失（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个单个氨基酸取代、插入或缺失）之外，其余部分可以与起始序列相同。在某些实施方式中，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个单独的氨基酸取代、插入或缺失。

骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins, BMPs）属于转化生长因子（TGF）家族，是一大类多功能生长因子，能影响肾、肺等器官胚胎发生和组织生成，并调节细胞增殖、转化、凋亡和ECM成分的分泌等。在肺发育和再生过程中，TGF-β1和BMP信号活性之间的平衡至关重要。

如本文所用，术语“BMP4”是指骨形态发生蛋白4，是BMP的一员，是肺发育过程中的关键因子之一。BMP4蛋白的氨基酸序列可以从NCBI获得，登录号为NP_001334841.1、NP_001334845.1、NP_001334843.1、NP_001193.2、NP_570911.2、NP_570912.2、NP_001334846.1、NP_001334842.1、以及NP_001334844.1。BMP4蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO: 1至SEQ ID NO: 3任一个所示。编码BMP4蛋白产物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4至SEQID NO: 9任一个所示。BMP4的信使RNA（mRNA）的NCBI序列登陆号为NM_001347912.1（SEQ IDNO: 19）、NM_001347916.1（SEQ ID NO: 20）、NM_001347914.2（SEQ ID NO: 21）、NM_001202.6（SEQ ID NO: 22）、NM_130850.5（SEQ ID NO: 23）、NM_130851.4（SEQ ID NO:24）、NM_001347917.1（SEQ ID NO: 25）、NM_001347913.2（SEQ ID NO: 26）、以及NM_001347915.2（SEQ ID NO: 27）。BMP4的DNA序列的NCBI序列登陆号为NC_000014.9（SEQ IDNO: 28），基因ID为652。BMP4在维持肺血管稳态中起重要作用，抑制BMP4能抑制低氧性肺动脉高压的病理改变。有研究表明，BMP4抑制人肺成纤维细胞增殖，诱导肺上皮细胞增殖和去分化。

编码BMP4的多核苷酸

本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸（核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）的聚合形式。这些术语包括单链、双链或三链DNA，基因组DNA、cDNA、基因组RNA、mRNA、DNA-RNA杂交体、或聚合物；该聚合物包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的，化学、生物化学修饰的，非天然或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团（通常可在RNA或DNA中发现），或经修饰或取代的糖或磷酸基团。或者，多核苷酸的主链可以包含合成亚单位的聚合物（例如氨基磷酸酯（phosphoramidate）），并且因此可以是寡聚脱氧核苷氨基磷酸酯（P-NH2）或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚体。

如本文所用，术语“编码”指这样的任何过程，借助该过程聚合物大分子或序列串中的信息被用来指导产生不同于第一分子或序列串的第二分子或序列串。如本文所用，所述术语被广泛使用，并且可以具有各种应用。在一个方面，术语“编码”描述了半保守DNA复制的过程，其中双链DNA分子的一条链被用作模板来通过DNA依赖性的DNA聚合酶来编码新合成的互补姐妹链。在另一个方面，术语“编码”是指这样的任何过程，借助该过程一个分子中的信息被用来指导产生与第一分子具有不同的化学性质的第二分子。例如，DNA分子可以编码RNA分子（例如，通过参与DNA依赖性的RNA聚合酶的转录过程）。而且，RNA分子可以编码多肽，如在翻译过程中那样。当用于描述翻译过程时，术语“编码”也延伸至编码氨基酸的三联体密码子。在一些方面，RNA分子可以编码DNA分子，例如通过参与RNA依赖性的DNA聚合酶的逆转录过程。在另一个方面，DNA分子可以编码多肽，其中应理解的是，在该情况下使用的“编码”包含转录和翻译过程。

如本文所用，术语“变体”是指在“非必需”区域进行保守取代或改变使其与序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、98%序列同一性的核苷酸或氨基酸序列。

同一性

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性能够通过比较每个序列中的位置来确定，该序列可以为了比较的目的而被比对。当比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列间同源性的程度是序列共有的匹配或同源位置的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列之一共享小于40％的同一性，但优选地小于25％的同一性。

多核苷酸或多核苷酸区域（或者多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”，意味着当比对时，在比较两个序列时该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。

病毒载体

病毒载体可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。病毒载体也可以称为载体、载体病毒粒子或载体粒子。病毒载体的实例包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。

逆转录病毒载体可以使衍生自或能够衍生自任何适合的逆转录病毒。大量的不同的逆转录病毒已经被鉴定。例子包括但不限于：鼠白血病病毒（MLV）、人T-细胞白血病病毒（HTLV）、小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）、劳氏肉瘤病毒（RSV）、Fujinami肉瘤病毒（FuSV）、莫洛尼鼠白血病病毒（Mo MLV）、FBR鼠骨肉瘤病毒（FBR MSV）、莫洛尼鼠肉瘤病毒（Mo-MSV）、Abelson鼠白血病病毒（A-MLV）、禽骨髓细胞瘤病毒-29（MC29）和禽红细胞增多症病毒（AEV）。

腺病毒是双链的线性DNA病毒，其不通过RNA中间体复制。腺病毒是双链的DNA无包膜病毒，其能够在体内、离体和体外转导大范围的人和非人来源的细胞类型。这些细胞包括呼吸道气道上皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、心肌细胞、滑膜细胞、原代乳腺上皮细胞和有丝分裂后终末分化的细胞（例如神经元）。腺病毒已被用作用于基因治疗和异源基因表达的载体。大（36kb）基因组可以容纳高达8 kb的外源插入DNA，并且能够在互补细胞系中有效地复制以产生每毫升高达1012个转导单位的非常高的效价。腺病毒因此是研究原代非复制细胞中基因表达的最佳系统之一。来自腺病毒基因组的病毒基因或外源基因的表达不需要复制细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦进入细胞内，腺病毒载体很少整合到宿主染色体中。相反，它们作为附加体（独立于宿主基因组）存在，作为宿主细胞核中的线性基因组。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。重组的AAV载体已成功地被用于标记基因和涉及人类疾病的基因的体外、离体和体内的转导。已经开发了某些AAV载体，其可以有效地结合大的有效载荷（高达8-9kb）。现在已经鉴定了多种腺相关病毒（AAV）的血清型，包括12种人血清型（AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12）和超过100种来自非人灵长动物的血清型。本发明预期可使用这些血清型中的任何一个。

单纯性疱疹病毒（HSV）是包膜的双链DNA病毒，其天然地感染神经元。它可以容纳外源DNA的大区段，并且已经被采用为用于对神经元的基因递送的载体。在治疗过程中HSV的使用需要使毒株减毒，从而它们不能建立裂解周期。特别地，如果HSV载体用于人类的基因治疗，则优选地将多核苷酸插入必需基因中。这是因为如果病毒载体遭遇野生型病毒，则可以通过重组将异源基因转移至野生型病毒。然而，如果以防止其复制的方式构建重组病毒，则这可以通过将寡核苷酸插入对复制必需的病毒基因来实现。

本发明的病毒载体可以是牛痘病毒载体，例如MVA或NYVAC。牛痘载体的替代物包括例如称为ALVAC的鸡痘或金丝雀痘的禽痘（avipox）载体，以及由其衍生的毒株，该毒株可以在人类细胞中感染和表达重组蛋白但不能复制。应当理解的是，在重组基因的插入之后病毒基因组的部分可以保持完整。这意味着病毒载体可以保留感染细胞并随后表达额外的基因的能力的概念，该额外的基因支持其复制并可能促进被感染细胞的裂解和死亡。

慢病毒是更大群体的逆转录病毒的一部分。可以分为灵长类动物和非灵长类动物群体。灵长类慢病毒的例子包括但不限于：人免疫缺陷病毒（HIV）、人自身免疫缺陷综合症（AIDS）的病原体以及猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类动物慢病毒群体包括原型“慢病毒”visna/maedi病毒（VMV），以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。慢病毒载体一般是指以人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

非病毒载体

非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。任何合适的非病毒载体可被用于将

质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。质粒载体的例子包括但不限于：大肠杆菌质粒载体、枯草杆菌质粒载体、酵母质粒载体、农杆菌质粒载体和蓝细菌质粒载体。

脂质体由卵磷脂和神经酰胺等制得的脂质体（空心），具有的双分子层结构，是一种人工膜。脂质体的组成通常是磷脂（特别是高相转变温度的磷脂）的组合，通常与类固醇（尤其是胆固醇）组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。通过在转导期间通过使用二油酰磷脂酰乙醇胺可以增加脂质体的转导效率。高效脂质体可商购获得。脂质体的例子包括但不限于：中性脂质体、负电荷脂质体和正电荷脂质体。

附加型载体是一种允许和帮助水溶性物质渗入并穿过细胞膜的脂质层而转移到细胞中去的物质。它是膜上的一种蛋白质，调节着离子主动吸收的一种成分。附加型载体可以包括一种或多种多能性基因，其可操作地连接至少一个用于表达因子的调控序列。本发明的附加型载体还可包括允许该载体在细胞中复制的组分。例如，Epstein Barr oriP/核抗原-1（EBNA-1）组合可以支持哺乳动物细胞（特别是灵长类动物细胞）中载体的自我复制。来自于EBV基因组的EBNA1反式元件和OriP顺式元件使得简单质粒能够在增殖的人类细胞中作为附加体进行复制和维持。

用于基因转移的阳离子多聚物包括但不限于：多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺和树突状聚合物。

壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物，通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解，完全进入细胞。作为基因载体，壳聚糖具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点。壳聚糖-DNA复合物按制备方法主要分为壳聚糖及其衍生物的DNA复合物、壳聚糖-DNA纳米微球和壳聚糖自聚体-DNA。

无机纳米粒子主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用。应用于基因转运的无机纳米粒子的例子包括但不限于硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、金属纳米粒子、量子点等。

重组载体

本文所公开的重组载体是表达BMP4蛋白的重组载体，其包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。

表达BMP4蛋白的重组载体

在本文公开的任何重组载体、药物组合物和方法中，编码BMP4蛋白的多核苷酸通过载体来施用，其中载体包含病毒载体和非病毒载体。将编码BMP4蛋白的核酸序列包装进载体的方法是本领域技术人员已知的。

本发明的一个方面提供一种在对象中治疗或预防纤维增生性疾病的重组载体，其包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

在一些实施方式中，所述载体是病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。

在一些实施方式中，所述重组载体包含病毒载体，其中所述病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组载体包含病毒载体，其中所述病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ IDNO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含病毒载体，其中所述病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含病毒载体，其中所述病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ IDNO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含病毒载体，其中所述病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。在一些实施方式中，所述重组载体包含腺相关病毒载体，其中所述腺相关病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组载体包含腺相关病毒载体，其中所述腺相关病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含腺相关病毒载体，其中所述腺相关病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含腺相关病毒载体，其中所述腺相关病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含腺相关病毒载体，其中所述腺相关病毒载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO:28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

在一些实施方式中，所述载体是非病毒载体，在一些实施方式中，所述非病毒载体选自质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。

在一些实施方式中，所述重组载体包含非病毒载体，其中所述非病毒载体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组载体包含非病毒载体，其中所述非病毒载体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含非病毒载体，其中所述非病毒载体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含非病毒载体，其中所述非病毒载体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含非病毒载体，其中所述非病毒载体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

在一些实施方式中，所述非病毒载体是外泌体。在一些实施方式中，所述重组载体包含外泌体，其中所述外泌体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组载体包含外泌体，其中所述外泌体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含外泌体，其中所述外泌体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含外泌体，其中所述外泌体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ IDNO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含外泌体，其中所述外泌体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

在一些实施方式中，所述非病毒载体是质粒。在一些实施方式中，所述重组载体包含质粒，其中所述质粒包含编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组载体包含质粒，其中所述质粒包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含质粒，其中所述质粒包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含质粒，其中所述质粒包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ IDNO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含质粒，其中所述质粒包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

在一些实施方式中，所述非病毒载体是脂质体。在一些实施方式中，所述重组载体包含脂质体，其中所述脂质体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组载体包含脂质体，其中所述脂质体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含脂质体，其中所述脂质体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含脂质体，其中所述脂质体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ IDNO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述重组载体包含脂质体，其中所述脂质体包含编码BMP4蛋白的多核苷酸，其中所述编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。

药物组合物

“药物组合物”是指用于人的药物制剂。该药物组合物包含本发明的药物以及载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。

本发明的一个方面提供包含重组载体以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。该药物组合物可用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。

本发明的另一个方面提供包含游离的BMP4蛋白以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方式中，所述游离的BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述游离的BMP4蛋白是从天然来源纯化得到的，或者是通过基因工程方法得到的重组BMP4蛋白。

为了制备药物组合物或无菌组合物，让重组载体与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液或混悬剂形式的治疗及诊断药物的制剂。

药学上可接受的赋形剂是本领域熟知的。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括当与组合物的活性成分组合时允许该成分保持生物活性并且不会引起与对象的免疫系统的破坏性反应的材料。这些可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖配合物或晶体等。“药学上可接受的”是指当施用至人体时不会产生过敏反应或类似的不期望的反应的分子和成分。本领域已知如何制备包含作为活性组分的水性组合物。通常，这些组合物被制备成注射剂或喷雾剂，例如液态溶液或悬浮液；也可以制备成适于在注射或喷雾之前配制成溶液或悬浮液的固体形式。

纤维增生性疾病

纤维增生可发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。

在本发明中，纤维增生性疾病包括但不限于：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。

肺纤维增生性疾病包括但不限于：无机粉尘职业病（例如矽肺、石棉肺、煤肺等），有机粉尘和过敏性肺炎（例如农民肺），肺原发性疾病（例如特发性间质性肺炎、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎等），特发性肺纤维化，进行性系统硬化症，淋巴细胞间质性肺炎，家族性肺纤维化等。

心血管系统纤维增生性疾病包括但不限于心肌梗死后的替代性和间质性纤维化。

肝纤维增生性疾病包括但不限于：病毒性肝硬化（例如乙、丙和丁型肝炎病毒性肝炎），营养不良性肝硬化等。

肾纤维增生性疾病包括但不限于：慢性肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、阻塞性肾病、系统性红斑狼疮性肾病等。

眼睛纤维增生性疾病包括但不限于眼睛外伤和手术后眼睛纤维增生性疾病等。

神经系统纤维增生性疾病包括但不限于脊髓外伤后纤维增生性疾病等。

骨髓纤维增生性疾病包括但不限于特发性和药物引起的骨髓纤维化等。

皮肤纤维增生性病症包括但不限于口腔粘膜纤维化等。

方法和治疗

本发明的一方面，提供了一种治疗或预防对象的纤维增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的BMP4蛋白，其中所述BMP4蛋白是游离的BMP4蛋白。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述游离的BMP4蛋白是从天然来源纯化得到的，或者是通过基因工程方法得到的重组BMP4蛋白。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

进一步地，本发明提供了本发明的BMP4蛋白在制备用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病的药物中的应用，其中所述BMP4蛋白是游离的BMP4蛋白。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，所述游离的BMP4蛋白是从天然来源纯化得到的，或者是通过基因工程方法得到的重组BMP4蛋白。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防对象的纤维增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的BMP4蛋白，其中所述BMP4蛋白是表达BMP4蛋白的重组载体，所述重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO:28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

进一步地，本发明提供了本发明的BMP4蛋白在制备用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病的药物中的应用，其中所述BMP4蛋白是表达BMP4蛋白的重组载体，所述重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防对象的纤维增生性疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含重组载体和药学上可接受的赋形剂，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ IDNO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

进一步地，本发明提供了本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防对象的纤维增生性疾病的药物中的应用，其中该药物组合物包含重组载体和药学上可接受的赋形剂，其中该重组载体包含载体，所述载体包含或携带编码BMP4蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸是编码BMP4蛋白的DNA、RNA、或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，BMP4蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 4至SEQID NO: 9所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 10至SEQ ID NO: 27所示序列中的任何一个序列或其变体。在一些实施方式中，编码BMP4蛋白的多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO:29所示的序列或其变体。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方式中，所述非病毒载体选自：质粒、脂质体、逆转录元件、转座子、附加型载体、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子和外泌体。在一些实施方式中，所述病毒载体选自：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒、牛痘病毒、杆状病毒和慢病毒。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病选自：肺、心血管系统、肝、肾、眼、神经系统、骨髓和皮肤的纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述纤维增生性疾病是肺纤维增生性疾病。在一些实施方式中，所述肺纤维增生性疾病是特发性肺纤维化。

合适的给药途径包括胃肠外给药（例如肌内、静脉内或皮下给药）及口服给药。可按多种常规方式给予本发明方法的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物，这些方法例如有经气管插管给予、经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。此外，人们可以在靶向药物递送系统中给予本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物。在一个实施方式中，经气管插管给予本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物。在一个实施方式中，经静脉内注射给予本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物。

由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的诊断测量包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。

可通过连续给药或通过以一定间隔（例如一天、一周或每周1-7次）给药来施用本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物。可通过气管插管、静脉内、皮下、腹膜内、经皮肤、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内或脊柱内来提供剂量。优选剂量方案是包括避免显著的不合乎需要的副作用的最大剂量或给药频率的方案。

在一些实施方式中，本发明的治疗或预防纤维增生性疾病的方法阻止了纤维化的进展或由纤维化导致的疾病的发作。因此，在一些实施方式中，本发明提供一种阻止纤维化的进展和/或由纤维化导致的疾病的发作的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物。在一些实施方式中，这些治疗或预防纤维增生性疾病的方法阻止了与纤维化有关的症状的发作、进展和/或复发。因此，在一些实施方式中，本发明提供了治疗或预防与纤维化有关的症状的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的本发明的BMP4蛋白、重组载体或药物组合物。

实施例

实验动物

SPF级野生型C57BL/6小鼠购自广州中医药大学动物实验中心，C57BL/6背景的

统计学处理

使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析和软件作图，实验结果以均数±标准误差表示（Mean±SEM），两组样本之间均数的比较应用t检验，多组均数比较应用单因素方差分析（one way-ANOVA）检验，P<0.05为有统计学意义。

实施例1 在IPF患者和博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中BMP4的表达显著降低

免疫印迹检测肺组织中相关目的蛋白的表达量

（1）肺组织总蛋白提取：将冻存的肺组织从-80℃冰箱拿出，用生理盐水清洗肺组织，并吸干水。称量肺组织重量，大约每100 mg肺组织加入1 ml蛋白裂解液，装入匀浆管中，用高速匀浆机破碎肺组织，裂解至裂解液成浓汤样。于高速冷冻离心机中离心，4 ℃ 12000g，离心25分钟，吸取上层液体至一新的EP管中，用于后续测蛋白浓度，弃去沉淀。

（2）测蛋白浓度：按碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作。加入总体积为25μl的梯度稀释的标准品。将1.25 μl的样品用水稀释20倍，使总体积为25 μl并加入96孔板。试剂A、试剂B按50：1比例混匀，将混合液200 μl加入已加标准品和样品的96孔板中，37℃避光孵育30 min。全波长酶标仪于562 nm波长下测定每个孔的OD值，制作标准曲线，并计算出每孔样品蛋白浓度。

（3）制备上样蛋白：以上样20 ng为总量，根据所测蛋白浓度，算出每个样品上样体积，用蛋白裂解液稀释样品，使每个样品最终上样体积一致。按照比例加入5 *loadingbuffer。100℃沸水煮样品5 min使蛋白变性，煮完将样品置于冰上冷却后于-20℃保存。

（4）蛋白免疫印迹：提前配制好10%分离胶和5%浓缩胶，向电泳槽内加入电泳液，垂直向上拔出加样梳，将样品加入上样孔。先以70 v电压恒压电泳，至样品经浓缩胶压成一条直线，marker 开始分离，加压至120 v，恒压电泳至溴酚蓝跑至底部约0.5 cm时结束。用甲醇浸泡PVDF膜，取出放入装有电转液的盘子中，弃去电泳液，从电泳槽中取出凝胶，按照“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的顺序制作电转“三明治”。将三明治夹放入电转槽中，将预冷的电转液倒入电转仪中，放入冰袋使电转液保持低温。以300 mA，120 min条件电转并用冰覆盖电转槽。电转完将PVDF膜取出，将目的蛋白相应条带加入对应的一抗置于摇床上慢摇，4℃孵育过夜，第二天用TBST洗膜3次，每次10 min，加入对应二抗室温孵育1到2个小时，TBST洗膜3次，每次10分钟。用全自动化学发光显影系统显影，用Image J图像分析软件对目的条带灰度值进行分析并用Graph-Pad 软件进行统计。

结果

IPF患者肺组织中BMP4的表达显著降低

收集癌旁正常对照肺组织和IPF患者肺组织，观察IPF患者和正常对照肺组织中BMP4的表达变化 (n=20)。如图1A和图1B所示，IPF患者肺组织中BMP4蛋白水平显著降低。荧光定量PCR（Real-time PCR）的结果显示，IPF患者肺组织中BMP4 mRNA水平显著降低（图1C）。免疫荧光染色的结果显示，IPF患者肺组织中BMP4的荧光强度显著降低（图1D）。综上，根据图1所示的结果可知，相对正常对照肺组织而言，肺纤维化患者肺组织中BMP4的表达显著降低。

博来霉素在肺纤维化小鼠肺组织中诱导BMP4蛋白表达的降低

博莱霉素气管内给药（2.5 mg/kg）诱导野生型小鼠发生肺纤维化，分别在肺纤维化发展的不同阶段，即给予博来霉素造模后第0、7、14、21天收集肺组织标本；应用蛋白免疫印迹技术，分析在肺纤维化不同阶段，小鼠肺组织中BMP4蛋白表达情况。发现，与对照组小鼠相比，模型组小鼠肺组织中BMP4水平显著降低，且随着博来霉素的作用时间增加，肺纤维化小鼠肺组织中BMP4蛋白表达进一步降低（图2）。

实施例2

（1）剪取小鼠尾巴并裂解：给小鼠编号，用洁净的剪刀剪取小鼠尾巴，并置于1.5ml EP管内，每个EP管中加入200 μl鼠尾裂解液，55℃水浴过夜（约10 h左右），再85℃水浴1h使蛋白酶K灭活（标本可置于4℃保存一周）。

（2）引物序列如下表所示：

表1 BMP4基因敲除小鼠（BMP4+/-）基因型鉴定引物序列

注：NEO引物用于扩增BMP4突变基因；WT引物用于扩增BMP4野生基因。

（3）按照下表配制PCR反应体系（总体积25 μl）：

表2 BMP4+/-小鼠基因鉴定反应体系

注：F：上游引物；R：下游引物。

（4）PCR扩增的反应条件

表3

注：将反应体系充分混匀后再行PCR扩增反应。

（5）琼脂糖凝胶电泳

称取适量琼脂糖粉末至锥形瓶中，按比加入1xTAE轻轻摇匀，用微波炉加热至沸腾后，轻轻摇匀，使琼脂糖完全溶解。待其稍微冷却后加入EB替代物（每100 ml琼脂糖凝胶液加入5 μl EB替代物），混匀后倒入加样槽中，并垂直插入加样梳，待琼脂糖凝胶彻底凝固后，拔出加样梳，取出琼脂糖凝胶并放入琼脂糖电泳槽中，加入1xTAE至没过琼脂糖凝胶。按序加入DL1000 marker和样品，按120 V、30 min的条件进行电泳。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中拍照成像，保存并分析结果。

小鼠肺纤维化模型建立

将小鼠分为四组：野生型小鼠对照组，

小鼠活体CT扫描

腹腔注射1.2%阿佛丁（0.2 ml/10 g）麻醉小鼠，将麻醉后的小鼠置于CT扫描箱中，用LCT-200 Micro CT对小鼠进行胸部CT扫描成像。

小鼠肺功能检测

于博来霉素造模后第21天，用小动物肺功能仪检测小鼠肺功能情况。校正小动物肺功能仪，使机器参数达标后开始检测。腹腔注射1.2%阿佛丁（0.2 ml/10 g）麻醉小鼠，用酒精擦拭小鼠颈部，切开颈部皮肤，顿性分离肌肉组织，暴露气管，剪开气管并接气管插管，放入体描箱后，连接小动物肺功能仪并进行机械通气。待小鼠呼吸及各参数变化趋于稳定后测定肺功能，记录各项肺通气功能指标。

小鼠肺组织HE染色

将分离的小鼠肺组织用多聚甲醛固定，再进行脱水、包埋、切片，切成约3 μm厚的切片。将切片置于烤片机上烤2 h，使石蜡充分熔化；脱蜡：二甲苯10 min*2次，100%酒精5min*2次，95%酒精5 min*2次，流水冲洗5 min；苏木素染核10 min，流水冲洗3 min；2%盐酸酒精转化15 s，流水冲洗2 min；伊红染色1 min，流水冲洗4 min；脱水透明：95%酒精5 min*2 次，100%酒精5 min*2次，二甲苯2次；待玻片晾干，用中性树脂封片；扫片机全视野扫描后观察肺部病变情况。

小鼠肺组织Masson染色

小鼠肺组织用甲醛固定后，常规脱水包埋切片，切片脱蜡后，置于固定液中于常温下过夜，流水冲洗。与天青石蓝液、苏木精液中各染2分钟，用1%的盐酸乙醇分化，流水冲洗10分钟。于品红溶液、1%磷铝酸盐溶液各处理10分钟，再于2%的苯胺蓝溶液中染5分钟，于0.2%冰醋酸溶液中处理2分钟。95%酒精脱水，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

肺组织中羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量测定

（1）肺组织的水解：称取约20 mg左右的肺组织至15 ml的EP管中，加入500 μl碱性水解液，混匀后放置于95℃水浴锅中水解20 min，间中多次摇晃混匀。

（2）调节PH至6.0~6.8左右：水解后用流水冲洗EP管使其冷却，加入指示剂后充分振荡摇匀，准确加入调PH甲液500 μl后充分振荡摇匀，液体呈红色；将调PH的乙液加入各EP管，边加边充分振荡摇匀，直至EP 管中的液体由红色变黄绿色；往EP管中加双蒸水至5 ml后充分振荡摇匀；取1.5-1.6 ml经稀释的水解液于2 ml的EP管中，称量10-15 mg活性炭于水解液中，充分振荡摇匀后，3500 rpm/min离心10 min，用加样枪吸取离心后的上清液500μl以待检测。

（3）检测反应体系：

表4 反应体系

注：加完试剂一后充分振荡摇匀后，静置10 min，再加入试剂二，充分振荡摇匀后，静置5 min，再加入试剂三，充分振荡摇匀冷却后，置于60℃的水浴锅中反应15 min，再3500rpm/min离心10 min。

（4）样品OD值测量：用加样枪吸取200 μl的样品于96孔板中，置于酶标仪中以550nm的波长测量各样品的OD值。

结果

一般状态观察

我们将小鼠随机分为四组，

小鼠生存率和体重

小鼠给予博来霉素（2.0 mg/kg）处理，记录造模21天过程中小鼠的体重及死亡情况。与对照组（Saline）小鼠相比，模型组（BLM）小鼠的生存率下降。模型组（BLM）小鼠中，与野生型小鼠相比，

小鼠肺部CT结果

小鼠博来霉素造模后第14天，进行了小鼠活体胸部CT扫描，评估小鼠肺纤维化程度。如图4所示，与对照组相比，模型组（BLM）小鼠的肺实变及纤维化显著。模型组（BLM）小鼠中，与野生型小鼠相比，

小鼠肺功能结果

造模后第21天，对小鼠进行肺功能检测，如图5所示：与对照组（Saline）相比，模型组（BLM）小鼠的肺功能下降，表现为肺顺应性下降（n=6，P＜0.05）和气道阻力升高（n=6，P＜0.001）。模型组（BLM）小鼠中，与野生型小鼠相比，

小鼠肺组织HE和Masson染色结果

小鼠博来霉素造模后第21天，小鼠肺组织HE染色结果如图6A所示，Masson染色结果如图6B所示，予以生理盐水处理组的小鼠肺泡结构完整，气道及肺泡周围无炎症细胞浸润，未见纤维组织增生和胶原沉积；模型组（BLM）小鼠肺泡结构破坏，肺泡壁及肺泡间隔增厚，可见气道及肺泡周围有炎症细胞浸润，肺泡间隔有纤维组织增生，

肺组织中羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）的含量

肺纤维化时，肺组织内胶原纤维增加，而羟脯胺酸为胶原纤维所特有，以此作为肺纤维化的指标。博来霉素造模后第21天，检测了小鼠肺组织中羟脯胺酸含量（图7），以此判断纤维化程度。与对照组相比，模型组（BLM）小鼠的肺组织中的羟脯胺酸含量增多（n=10，P<0.05），

实施例3

α-SMA是成纤维细胞向肌纤维母细胞转化的标记物，Fibronectin、和胶原主要成分Col 1、Col 3是ECM的主要成分。博来霉素造模后，我们检测了各组小鼠肺组织α-SMA、Fibronectin、Col 1、Col 3蛋白表达情况。

结果

如图8所示，与对照组相比，予以博来霉素处理21天后小鼠肺组织中的Fibronectin、α-SMA、Col 1、Col 3蛋白含量显著增加，说明博来霉素诱导了小鼠成纤维细胞向肌纤维母细胞转化和合成大量的ECM。模型组（BLM）小鼠中，与野生型小鼠相比，

实施例4 BMP4过表达对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的预防和治疗作用的影响

为了进一步确定BMP4在肺纤维化中的保护作用，我们包装了过表达BMP4（SEQ IDNO: 34）的腺相关病毒（AAV9-BMP4），分别在气管内注射博莱霉素前两周以及造模9天后，经气管插管给予腺相关病毒AAV-BMP4。在给予博莱霉素造模23天后对各组小鼠进行肺功能测定，并对取材后的组织进行HE染色和Masson染色，观察BMP4过表达对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的预防和治疗作用。将小鼠分为四组：对照组（control），博来霉素和AAV9空载体处理组（BLM+AAV-Empty），博来霉素处理后AAV9-BMP4处理组（BLM+AAV9-BMP4），AAV9-BMP4处理后BLM处理组（AAV9-BMP4+BLM）。

结果

如图9A所示，与博莱霉素模型组（BLM+AAV-Empty）相比，BMP4过表达预防组（AAV9-BMP4+BLM）和治疗组（BLM+AAV9-BMP4）小鼠的肺功能都明显改善，表现为肺动态顺应性增加和肺阻力降低；图9B所示，与博莱霉素模型组（BLM+AAV-Empty）相比，BMP4过表达预防组（AAV9-BMP4+BLM）和治疗组（BLM+AAV9-BMP4）小鼠的肺纤维化病理程度也显著降低，进一步说明了BMP4在肺纤维化中能够起到抗纤维化的作用。

实施例5

小鼠肺原代成纤维细胞的提取和培养

将小鼠用1.2%阿佛丁（0.2 ml/10 g）腹腔注射麻醉，麻醉后用酒精浸泡小鼠3-5分钟，将小鼠放入超净台中，剪开腹主动脉放血，打开胸腔取出肺组织，弃掉靠近大气道的肺组织，将肺组织放入含PBS的大皿中清洗2-3遍，移入新的大皿中，将肺组织快速剪成约1mm

细胞总蛋白的提取

将细胞孔板或细胞培养皿中培养基吸弃，加入PBS清洗一遍，弃去PBS，加入配好的蛋白裂解液，于冰上裂解30 min。用细胞刮刮取细胞，将蛋白裂解液及细胞碎片吸入1.5 mlEP管中，置于事先预冷的离心机中，4 °C，12000 rpm，离心30 min。将上清吸至新的1.5 mlEP管中，弃去沉淀，-80℃保存用于后续实验。

为研究

结果

如图10A所示，与空白对照组相比，予以TGF-β1处理的肺成纤维细胞中，Fibronectin、α-SMA、Col3、Col1的表达显著升高，

实施例6 外源性加入BMP4重组蛋白能够抑制TGF-β1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞转化和ECM的产生

细胞爬片免疫荧光染色

将细胞孔板中放入相应大小的圆形盖玻片，将细胞均匀铺入孔板中，置于培养箱培养3-5天并给药处理，从培养箱取出细胞孔板，用PBS轻轻清洗细胞表面1遍，弃去PBS，加入4%多聚甲醛并将孔板置于摇床上慢摇5-10 min，以固定细胞。弃去固定液，加入PBS清洗3遍，弃去PBS。加入10%TRIT-100，摇床上慢摇15 min以透化细胞膜，加入PBS清洗3遍，弃去PBS，加入3%BSA室温封闭1 h。弃去BAS，夹出盖玻片移至湿盒，按一抗说明书稀释一抗，将稀释好的一抗滴至圆形盖玻片上，阴性对照组则加入PBS，将湿盒放至4度冰箱，一抗孵育过夜。第二天将湿盒取出，于室温复温约半小时，将玻片夹至细胞孔板中，加入PBS清洗3遍，弃去PBS。加入稀释好的二抗，室温避光孵育1 h。加入PBS清洗3遍，弃去PBS。加入细胞核染色试剂DAPI，避光室温孵育5-8 min。加入PBS清洗3遍，弃去PBS，用防淬灭封片剂封片。于荧光显微镜下对细胞染色情况进行观察并采集图像。

为研究外源性BMP4对小鼠原代成纤维细胞转化和合成ECM能力的影响，对小鼠原代成纤维细胞予以TGF-β1刺激，建立纤维化细胞模型，在此基础上予以BMP4处理48 h，检测细胞中成纤维细胞转化标志物Fibronectin、α-SMA、Col 1、Col 3蛋白表达变化。

结果

如图10B-10D所示，予以TGF-β1处理后，细胞中Fibronectin、α-SMA、Col 1、Col 3的蛋白表达显著升高，予以BMP4处理可以抑制TGF-β1所致Fibronectin、α-SMA、Col 1、Col3的表达升高，其差别具有统计学意义。单独予以BMP4处理不影响Fibronectin、α-SMA、Col1、Col 3蛋白表达。免疫荧光结果显示，予以TGF-β1处理后，细胞中α-SMA、Vimentin蛋白表达显著升高，予以BMP4处理可以抑制TGF-β1所致α-SMA、Vimentin蛋白表达升高。说明外源性BMP4能抑制TGF-β1诱导的小鼠原代成纤维细胞转化。

实施例7

成纤维细胞的激活和转化是肺纤维化的主要特征。成纤维细胞的激活包括过度增殖和凋亡抵抗。我们研究BMP4对TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖的影响。

结果

如图11A-11C所示，小鼠原代成纤维细胞（

实施例8 外源性加入BMP4重组蛋白能够抑制TGF-β1诱导的小鼠肺原代成纤维细胞增殖

如图11D-11F所示，予以外源性BMP4处理能抑制TGF-β1所致PCNA、Survivin的表达升高，其差别具有统计学意义。

实施例9

为研究BMP4对肺成纤维细胞凋亡的影响，探究BMP4是否通过抑制TGF-β1，促进成纤维细胞的凋亡，发挥抗纤维化作用。我们对小鼠肺原代成纤维细胞（

按照AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，具体步骤如下：先用PBS清洗贴壁细胞1遍，用胰酶消化细胞，加含10%FBS的DMEM终止消化，吹打后将细胞悬液移入15ml EP管中，800 rpm，离心5 min。用预冷的PBS清洗细胞2遍，800 rpm，离心5 min，弃去PBS，用1×Bingding Buffer 溶液重悬细胞，并行细胞计数，稀释细胞悬液，使得细胞浓度为1×10

结果

使用AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒检测小鼠原代成纤维细胞予以TGF-β1处理后细胞凋亡情况，并计算凋亡率，结果显示，

应该理解的是，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改、改进和变化，这些修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法和实施例是优选的实施方式的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）

<120> 用于治疗或预防纤维增生性疾病的药物

<130> 20D-1642-CNP

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 455

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4蛋白的氨基酸序列

<222> (1)..(455)

<400> 1

Met Arg Glu Gly Arg Gly Gly Gly Arg Glu Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 5 10 15

Gly Pro Glu Ala Arg Ser His Ser Val Val Pro Ser Arg Ala Thr His

20 25 30

Cys Cys Ser Phe Pro Glu Pro Phe Gln Gln Val Cys Ser Arg Leu Ala

35 40 45

Val Lys Asn His Gly Leu Leu Leu Tyr Ala Leu Phe Ser Val Ile Leu

50 55 60

Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Lys

65 70 75 80

Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gln

85 90 95

Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met Phe

100 105 110

Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro Asp

115 120 125

Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu Glu

130 135 140

Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser Arg

145 150 155 160

Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn Ile

165 170 175

Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu Ser

180 185 190

Ser Ile Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Phe

195 200 205

Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg

210 215 220

Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro Gly

225 230 235 240

His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn Val

245 250 255

Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp Thr

260 265 270

Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His Leu

275 280 285

His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg Ser

290 295 300

Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu Val

305 310 315 320

Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg

325 330 335

Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn

340 345 350

Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly

355 360 365

Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys

370 375 380

His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn

385 390 395 400

His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro

405 410 415

Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr

420 425 430

Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val

435 440 445

Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

450 455

<210> 2

<211> 408

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4蛋白的氨基酸序列

<222> (1)..(408)

<400> 2

Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys

20 25 30

Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly

35 40 45

Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met

50 55 60

Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu

85 90 95

Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser

100 105 110

Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn

115 120 125

Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu

130 135 140

Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu

145 150 155 160

Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His

165 170 175

Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro

180 185 190

Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn

195 200 205

Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp

210 215 220

Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His

225 230 235 240

Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg

245 250 255

Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu

260 265 270

Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg

275 280 285

Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys

290 295 300

Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val

305 310 315 320

Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr

325 330 335

Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr

340 345 350

Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile

355 360 365

Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu

370 375 380

Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met

385 390 395 400

Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

405

<210> 3

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4蛋白的氨基酸序列

<222> (1)..(345)

<400> 3

Met Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile

1 5 10 15

Pro Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu

20 25 30

Glu Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala

35 40 45

Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu

50 55 60

Asn Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn

65 70 75 80

Leu Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg

85 90 95

Leu Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe

100 105 110

His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val

115 120 125

Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His

130 135 140

Asn Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg

145 150 155 160

Trp Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr

165 170 175

His Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser

180 185 190

Arg Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu

195 200 205

Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg

210 215 220

Arg Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys

225 230 235 240

Lys Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp

245 250 255

Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe

260 265 270

Tyr Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser

275 280 285

Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met

305 310 315 320

Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu

325 330 335

Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

340 345

<210> 4

<211> 1368

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4基因的CDS对应的RNA序列

<222> (1)..(1368)

<400> 4

augcgagaag gcagaggagg agggagggag ggaaggagcg cggagcccgg cccggaagcu 60

aggagccauu ccguagugcc aucccgagca acgcacugcu gcagcuuccc ugagccuuuc 120

cagcaaguuu guucaagauu ggcugucaag aaucauggac uguuauuaua ugccuuguuu 180

ucugucaucc ugcuaggagg cgcgagccau gcuaguuuga uaccugagac ggggaagaaa 240

aaagucgccg agauucaggg ccacgcggga ggacgccgcu cagggcagag ccaugagcuc 300

cugcgggacu ucgaggcgac acuucugcag auguuugggc ugcgccgccg cccgcagccu 360

agcaagagug ccgucauucc ggacuacaug cgggaucuuu accggcuuca gucuggggag 420

gaggaggaag agcagaucca cagcacuggu cuugaguauc cugagcgccc ggccagccgg 480

gccaacaccg ugaggagcuu ccaccacgaa gaacaucugg agaacauccc agggaccagu 540

gaaaacucug cuuuucguuu ccucuuuaac cucagcagca ucccugagaa cgaggugauc 600

uccucugcag agcuucggcu cuuccgggag cagguggacc agggcccuga uugggaaagg 660

ggcuuccacc guauaaacau uuaugagguu augaagcccc cagcagaagu ggugccuggg 720

caccucauca cacgacuacu ggacacgaga cugguccacc acaaugugac acggugggaa 780

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caugccauug ugcagacccu ggucaauucu gucaauucca guauccccaa agccuguugu 1260

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<210> 5

<211> 1227

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4基因的CDS对应的RNA序列

<222> (1)..(1227)

<400> 5

augauuccug guaaccgaau gcugaugguc guuuuauuau gccaaguccu gcuaggaggc 60

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cucuuuaacc ucagcagcau cccugagaac gaggugaucu ccucugcaga gcuucggcuc 480

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uaugagguua ugaagccccc agcagaagug gugccugggc accucaucac acgacuacug 600

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gucaauucug ucaauuccag uauccccaaa gccuguugug ugcccacuga acugagugcc 1140

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<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4基因的CDS对应的RNA序列

<222> (1)..(1038)

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4基因的CDS

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<212> RNA

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uuugggcugc gccgccgccc gcagccuagc aagagugccg ucauuccgga cuacaugcgg 660

gaucuuuacc ggcuucaguc uggggaggag gaggaagagc agauccacag cacuggucuu 720

gaguauccug agcgcccggc cagccgggcc aacaccguga ggagcuucca ccacgaagaa 780

caucuggaga acaucccagg gaccagugaa aacucugcuu uucguuuccu cuuuaaccuc 840

agcagcaucc cugagaacga ggugaucucc ucugcagagc uucggcucuu ccgggagcag 900

guggaccagg gcccugauug ggaaaggggc uuccaccgua uaaacauuua ugagguuaug 960

aagcccccag cagaaguggu gccugggcac cucaucacac gacuacugga cacgagacug 1020

guccaccaca augugacacg gugggaaacu uuugauguga gcccugcggu ccuucgcugg 1080

acccgggaga agcagccaaa cuaugggcua gccauugagg ugacucaccu ccaucagacu 1140

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ugggcccagc uccggccccu ccuggucacc uuuggccaug auggccgggg ccaugccuug 1260

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uuaaagguaa a 1931

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<211> 1788

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> BMP4基因的mRNA

<222> (1)..(1788)

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ggaggggccg ccggggaaga ggaggaggaa ggaaagaaag aaagcgaggg agggaaagag 60

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<212> RNA

<213> Homo sapiens

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<221> BMP4基因的mRNA

<222> (1)..(1723)

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agacgcagac gcagaggucg agcgcaggcc gaaagcuguu caccguuuuc ucgacuccgg 60

ggaacaugga gccauuccgu agugccaucc cgagcaacgc acugcugcag cuucccugag 120

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<212> RNA

<213> Homo sapiens

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<221> BMP4基因的mRNA

<222> (1)..(2027)

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