一种真菌菌种保存方法

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及真菌菌种的保存方法。

背景技术

真菌微生物学领域，无论是科研还是教学都离不开菌种。真菌菌种是生物学真菌研究工作正常运行的关键，菌种质量的高低决定着研究工作的成败。为使自然界分离的优质菌种能够保持原有的优良性状，最大限度地发挥作用，就需要尽可能完好地保存菌种。好的菌种保存方法不仅能够延长菌种的保存时间，还能够防止菌种功能退化，有效地保持菌种的优良性状。

真菌菌种的保存方法很多，各有优缺点。大体上可分为4类，即传代法、干燥法、低温干燥法及冷冻法。

传代法，也叫定期移植法，是将真菌菌种移植到斜面培养基上，放置室温或者放置4℃冰箱中保存。该方法操作简便，适用广泛，不需要特殊存储设备，费用低。但缺点是传代法中微生物的生长和代谢活动几乎没有受到抑制，因而保存时间较短，需要经常进行移植(三个月或者更短时间就需要移植一次)，繁琐费时。传代法最致命的缺点还是多次继代培养后菌种的生物学特性容易退化，失去菌种原有的优良性状。

干燥保存法，是将菌种干燥后放置在干燥室温环境下进行保存的方法。通常的做法是利用5％的脱脂牛奶洗涤真菌孢子，配制成高浓度的孢子悬浮液后加在无菌硅胶上，室温干燥后放在盛有硅胶的干燥器中进行保存。干燥保存法保存的菌种便于运输，保存时间长。但干燥保存法适用范围较窄，只能保存在培养基上产生孢子的真菌菌种，而且一直放置在干燥器中，保存容量有限。

低温干燥保存法，是将需要保存的真菌孢子悬浮在保护剂如脱脂牛奶中，无菌分装后置于冷冻液中，加干燥剂(如硅胶等)抽真空进行干燥，然后封口放低温冰箱中保存。低温干燥保存法保存的菌种存活率高、保存时间长、菌种稳定性高；但操作繁琐，需专用设备，而且同样只能保存产生孢子的菌种。

冷冻法保存，是将菌种保存于﹣80℃的超低温冰箱，或者超低温冷冻保存在液氮(﹣196℃)中，冷冻法保存的菌种保存时间长，菌种不易退化。但冷冻法操作复杂，需特殊设备，液氮还需要定期添加，费用高昂。

此外还有很多改进后的保存方法。如矿物油保存法，即传代法利用培养基斜面保存菌种时，在培养基上面加一层灭菌石蜡油，加的量应该超过斜面顶部1cm，然后放置室温保存或者放置冰箱中冷藏保存。矿物油保存法简便，而且保存时间比较长，而且不需专用设备。有实验证明，矿物油保存法保存的一种半知菌在保存45年后依然存活。但矿物油容易污染环境，占用空间大而且有异味，且矿物油保存法保存的菌种恢复时生长缓慢且外观带粘性，一般需要多移植1～2次才能恢复正常。

此外还有Richards保存法，是将菌种培养在Richards培养液中，然后收集孢子平摊在滤纸上，干燥24h后于4℃中冰箱保存。

此外还有滤纸低温保存法。滤纸低温保存法是将真菌孢子收集在滤纸上，或将滤纸放置在真菌菌落上让孢子生长到滤纸上，或者将滤纸与菌种共培养，让真菌菌丝和(或)孢子长到滤纸上，然后将滤纸干燥后放置于﹣20℃冰箱中保存。比较起来，滤纸低温干燥保存菌种是最为经济有效的方法。

专利申请ZL 201710976139.5公开了一种真菌保存方法，是将干燥的带菌滤纸放入硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋密封后装入信封内，在信封内添加干燥剂变色硅胶，最后再将信封装入塑料密封袋中保存。该方法中，硫酸纸袋、信封和塑料密封袋的密封性都不强，不能保证菌种处于良好的干燥环境，因而需要定期更换干燥剂，费力费时。而且三层袋子包裹菌种并且不透明，所以查找菌种、活化菌种、检测或更换硅胶干燥剂的过程中都需要一层层打开袋子，费时费力，工作效率低下，此外，还增加了冷冻材料放置室温的时间及频率。此外，更换硅胶不及时以及更换硅胶的过程中都容易造成菌种污染。另外，一个菌种套三个袋子，占用空间较大，导致保存容量小。

因此，如何提高菌种保存效果，降低污染，节约空间；如何快速从数千份保存菌种中迅速找出目标菌种；如何快速检查数千份菌种保存环境的干燥程度；如何减少更换干燥剂的频率、提高工作效率、缩短冷冻材料放置室温的时间，就成为真菌菌种保存中亟待解决的问题。

发明内容

本发明从以上几个方面进行改进，以延长菌种保存时间、提高工作效率、减少污染、节约空间。

本发明的目的是提供一种保存真菌菌种的方法，用小滤纸片作为真菌菌种保存的载体，将干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片放入装有无菌变色硅胶颗粒的无菌微量离心管或无菌指形管中，用封口膜将微量离心管或指形管封口，在低温环境下进行菌种的长期保存。

在本发明中，将干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片简称为真菌滤纸片。

本发明提供一种保存真菌菌种的方法，将干热灭菌的变色硅胶颗粒和干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片放入透明或半透明的无菌微量离心管或无菌指形管中，微量离心管或指形管使用封口膜封口，存放在透明或半透明的微量离心管冷冻盒中，放置于﹣20℃冰箱保存。

进一步地，变色硅胶颗粒的灭菌条件为160℃干热灭菌2小时。

进一步地，变色硅胶颗粒在干燥状态下呈现蓝色，潮湿的状态下为粉红色。在真菌滤纸片保存过程中，可以通过变色硅胶颗粒的颜色来观察微量离心管内的干燥状态。

进一步地，真菌滤纸片的干燥条件可以为，在底部盛有干燥变色硅胶的干燥器中室温干燥5天以上。

进一步地，微量离心管可以是尖底微量离心管或圆底微量离心管。例如可以是1.5ml尖底微量离心管、2ml圆底微量离心管等。

进一步地，微量离心管或指形管优选透明的微量离心管或指形管。

进一步地，封口膜可以为PARAFILM封口膜，也可以为透明保鲜膜。

进一步地，微量离心管冷冻盒优选透明的微量离心管冷冻盒。

本发明的真菌菌种保存方法包括以下步骤：

1)在无菌环境中，将真菌菌种移植到无菌固体培养基上，在移植点周围放置数片无菌小滤纸片；

2)培养，直至真菌菌丝和/或真菌孢子长满小滤纸片；

3)在无菌环境中，将长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片取出放在无菌培养皿中；

4)将步骤3)中的培养皿放在底部盛有干燥硅胶的干燥器中室温干燥；

5)在无菌环境中，将干热灭菌并冷却后的无菌变色硅胶颗粒放入透明或半透明的无菌微量离心管或无菌指形管中，再将干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片放入微量离心管或指形管中，用封口膜将微量离心管或指形管封口；

6)将步骤5)中的微量离心管或指形管放入透明或半透明的微量离心管冷冻盒内，将冷冻盒放置于﹣20℃冰箱保存。

进一步地，步骤1)的固体培养基可以为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即PDA(PotatoDextrose Agar)培养基，具体为：取马铃薯200g的煮沸滤液加蒸馏水定容至1000ml，加入葡萄糖20g、琼脂20g，121℃湿热灭菌15min。

进一步地，制备步骤1)的小滤纸片所使用的滤纸既可以是定性滤纸，也可以是定量滤纸。

进一步地，步骤1)的小滤纸片的尺寸小于微量离心管的横截面，例如可以为直径3～5mm的圆形，也可以为边长为3～5mm的正方形或短边为3～5mm的长方形，还可以为其它宽度为3～5mm的任何形状。

进一步地，步骤2)的培养的条件可以是，在恒温培养箱25℃黑暗培养。

具体而言，本发明如下：

1.一种真菌菌种保存方法，其特征在于：将干热灭菌的变色硅胶颗粒和干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片放入透明或半透明的无菌微量离心管或无菌指形管中，微量离心管或指形管使用封口膜封口，存放在透明或半透明的微量离心管冷冻盒中，放置于﹣20℃冰箱保存。

2.根据项1所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述变色硅胶颗粒的灭菌条件为160℃干热灭菌2小时。

3.根据项1所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片的干燥条件为，在底部盛有干燥硅胶的干燥器中室温干燥5天。

4.根据项1所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述微量离心管为尖底微量离心管或圆底微量离心管。

5.根据项1所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述封口膜为PARAFILM封口膜或透明保鲜膜。

6.根据项2所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片的干燥条件为，在底部盛有干燥硅胶的干燥器中室温干燥5天。

7.根据项2所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述微量离心管为尖底微量离心管或圆底微量离心管。

8.根据项2所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述封口膜为PARAFILM封口膜或透明保鲜膜。

9.根据项3所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述微量离心管为尖底微量离心管或圆底微量离心管。

10.根据项3所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述封口膜为PARAFILM封口膜或透明保鲜膜。

11.根据项4所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：所述封口膜为PARAFILM封口膜或透明保鲜膜。

12.根据项1至11中任一项所述的真菌菌种保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在无菌环境中，将真菌菌种移植到无菌固体培养基上，在移植点周围放置数片无菌小滤纸片；

2)培养，直至真菌菌丝和/或真菌孢子长满小滤纸片；

3)在无菌环境中，将长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片取出放在无菌培养皿中；

4)将步骤3)中的培养皿放在底部盛有干燥硅胶的干燥器中室温干燥；

5)在无菌环境中，将干热灭菌并冷却后的无菌变色硅胶颗粒放入透明或半透明的无菌微量离心管或无菌指形管中，再将干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片放入微量离心管或指形管中，用封口膜将微量离心管或指形管封口；

6)将步骤5)中的微量离心管或指形管放入透明或半透明的微量离心管冷冻盒内，将冷冻盒放置于﹣20℃冰箱保存。

13.根据项12所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：步骤1)所述的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，具体为，取马铃薯200g的煮沸滤液加蒸馏水定容至1000ml，加入葡萄糖20g、琼脂20g，121℃湿热灭菌15min。

14.根据项12所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：步骤2)所述的培养的条件为，在恒温培养箱25℃黑暗培养。

15.根据项13所述的真菌菌种保存方法，其特征在于：步骤2)所述的培养的条件为，在恒温培养箱25℃黑暗培养。

本发明具有以下优点：

(1)变色硅胶不仅是干燥剂，还兼具湿度指示剂和保存状态指示剂的作用。微量离心管本身的密封性很强，里面再放置灭菌的干燥变色硅胶颗粒，盖上微量离心管盖子，盖子外面再使用封口膜封口，密封效果加倍，能够很好地维持干燥环境。根据吸湿量的多少，变色硅胶颗粒的颜色会从深蓝色变为淡蓝色、蓝白色、蓝紫色、粉紫色或者粉红色，通过变色硅胶颗粒的颜色即可判断滤纸片的干燥程度，确定是否需要更换硅胶，从而更好地保存菌种。在稳定的低温环境下，菌种保持优良性状在很大程度上取决于保存环境的干燥状态。因此，变色硅胶指示剂的颜色不仅指示菌种保存环境的干燥状态，在稳定的低温环境下，变色硅胶指示剂的颜色兼具菌种保存状态指示剂的作用，可以一眼判断菌种保存状况，根据变色硅胶指示剂的颜色决定是否需要更换硅胶。

(2)菌种保存时间长，而且生物学特性不容易退化。微量离心管本身的密封性很强，能有效阻挡外界湿气，里面再放置干燥变色硅胶颗粒，外面再封口，密封效果加倍，能够更好地为所保存菌种提供无菌以及干燥环境。低温干燥环境下，微生物的生长和代谢活动几乎都被抑制，菌种基本处于休眠状态，因而保存的周期延长，而且其生物学特性不容易退化，提高菌种保存效果。

(3)菌种不容易被污染。微量离心管本身的密封性很强，里面再放置干燥变色硅胶颗粒，外面再封口，密封效果加倍，能够很好地维持干燥环境。本发明的保存方法因为密封效果好，所以滤纸片一直保持干燥状态，杂菌不容易滋生；而且，也因为密封效果好，保存过程中基本不需要更换硅胶，减少了更换过程中的污染。

(4)查找菌种方便。冷冻盒顶部为透明或半透明的，查找菌种时很容易就通过透明或半透明盒体查看微量离心管盖子上书写的菌种名称，看到目标菌种，不仅一目了然，能够快速高效地查找菌种，大大提高工作效率，而且还能缩短冷冻的菌种放置于室温的时间，尽可能减少温度变化，从而能够更好地保持菌种特性，提高保存效果。

(5)方便观察保存菌种干燥状态。微量离心管是透明或半透明的，冷冻盒底部与四周也都是透明或半透明的，能够直接透过冷冻盒底部观察保存菌种的微量离心管内变色硅胶颗粒的颜色，从而判断所保存菌种的干燥状态，确定需不需要更换硅胶。

(6)占用空间小，保存容量大。本保存方法中滤纸片体积小，而且是放置在微量离心管中保存，占用空间小，一个普通冰箱的冷冻室就能够轻松保存数千份菌种，因而保存容量大。

(7)方便远距离携带及邮寄。加有无菌干燥变色硅胶颗粒的微量离心管不仅能提供干燥的环境，而且能提供无菌的环境，滤纸片即便放置室温条件下，真菌菌种也能存活很长时间，加之体积小，所以方便远距离携带及邮寄。

(8)菌种取用方便。需要时找到所需菌种打开封口，取出一片滤纸片进行活化，剩下的菌种可以再度封口，放回﹣20℃冰箱保存。随用随取，非常方便。

(9)提高工作效率。由于密封性好，菌种保存过程中基本不需要更换硅胶干燥剂，有效降低了工作量；而且由于微量离心管跟冷冻盒透明度高，查找菌种、检查变色硅胶颗粒干燥程度都方便快捷，从而提高了工作效率。

添加的变色硅胶颗粒不仅是干燥剂，还是一种湿度指示剂，根据其颜色即可判断所保存菌种的干燥状态。因为变色硅胶根据吸湿量的多少其颜色会从深蓝色变为淡蓝色、蓝白色、蓝紫色、粉紫色或者粉红色，所以通过变色硅胶颗粒的颜色即可判断滤纸片的干燥程度，确定是否需要更换硅胶，从而更好地保存菌种。微量离心管密封性好，能有效阻挡外界湿气，加上硅胶的干燥效果，能够更好地为所保存菌种提供无菌以及干燥环境，从而提高保存效果；而且微量离心管透明度高，能够直接观察管中变色硅胶颗粒的颜色，从而判断所保存菌种的干燥状态；此外微量离心管体积小，不占空间，所以保存容量大。透明或半透明的冷冻盒方便查看微量离心管盖子上书写的菌种名称，不仅能够快速高效地查找菌种，还能有效缩短冷冻材料放置于室温的时间，从而提高保存效果；其次，还方便通过冷冻盒底部查看微量离心管中变色硅胶颗粒的颜色。通过这一系列改进，该方法保存的菌种成活率高，致病力强，生物学特性不容易退化；而且具有占用空间小、保存容量大、保存时间长，方便远距离携带及邮寄，提高工作效率等优点。

本发明的保存真菌菌种的方法既适用于产生孢子的真菌菌种，也适用于不产生孢子的真菌菌种。使用本发明的保存真菌菌种的方法，保存的菌种存活率高，保存时间长，菌种状态易于观察。此外，在稳定的低温干燥条件下菌种处于休眠状态，菌种的生物学特性不容易发生退化，从而能够很好地保持菌种固有的性状。此外，该保存方法还具有菌种不容易被污染、查找菌种方便、菌种取用方便、对设备要求简单、占用空间小、保存容量大、工作效率高、方便远距离携带及邮寄等优点。

附图说明

图1是真菌滤纸片制作图片。

图2是真菌滤纸片干燥图片。

图3是真菌滤纸片保存图片。

图4是变色硅胶颗粒颜色变化图片。

图5是通过透明冷冻盒观察变色硅胶颗粒颜色示意图。

图6表示致病力测试实验结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，本发明给出以下实施例。应该理解的是，本发明的实施例仅用于对本发明进行解释而不是限定，本发明的保护范围仅仅由本发明的权利要求书进行限定。本发明的实施例仅仅是一些优选的实施例，本领域技术人员可以根据本发明的内容，做出变更和替代，形成不同的实施方式。然而，在不违背本发明构思的情况下，对本发明的方法做出的任何改变和变形、任何等同替代，都在本发明的保护范围之中。

下面结合实施例和附图对本发明进行说明。

实施例1微量离心管保存法保存真菌菌种

微量离心管法保存真菌菌种，包括以下步骤。

步骤1：制备PDA培养基。PDA培养基的成分为：取马铃薯200g的煮沸滤液加蒸馏水定容至1000ml，加入葡萄糖20g、琼脂20g。

步骤2：用打孔器将滤纸打成直径为4mm的圆形小滤纸片。

步骤3：将PDA培养基和小滤纸片在121℃湿热灭菌15min，灭菌后制备PDA培养基平板。

步骤4：在超净工作台上，将接种针、镊子等用酒精灯火焰灼烧灭菌，利用无菌接种针将待保存真菌菌种移植至PDA培养基平板上，利用无菌镊子在移植点周围放置数片无菌小滤纸片，放置数量可以根据菌种使用频率及成活率决定。

图1是真菌滤纸片制作图片。左图表示菌种移植培养时，在移植点周围放置数片无菌小滤纸片。

步骤5：将移植菌种的培养基平板放入恒温培养箱25℃黑暗培养，菌丝和/或孢子扩展过程中生长到小滤纸片上，直至真菌菌丝和/或孢子长满小滤纸片。

图1是真菌滤纸片制作图片。右图表示菌丝和/或孢子生长到小滤纸片上。

步骤6：取变色硅胶在烘箱中80℃加热2h进行干燥，冷却，将干燥冷却后的变色硅胶放入干燥器底部。

步骤7：在超净工作台上，将镊子等用酒精灯火焰灼烧灭菌，利用无菌镊子将长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片从培养基平板中取出，放入一个新的无菌培养皿中。

图2是真菌滤纸片干燥图片。左图表示转移到新的无菌培养皿中的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片。

步骤8：将步骤7中装有长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片的培养皿放入底部盛有干燥硅胶的干燥器中干燥5天。

图2是真菌滤纸片干燥图片。右图表示装有长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片的培养皿在底部装有干燥变色硅胶的干燥器中干燥。

步骤9：取变色硅胶颗粒置于玻璃培养皿中，160℃干热灭菌2h，冷却。

步骤10：在超净工作台上，将镊子、药勺等用酒精灯火焰灼烧灭菌，利用无菌药勺取冷却后的灭菌的干燥变色硅胶颗粒放入无菌的1.5ml尖底微量离心管中，利用无菌镊子将干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片放入底部装有灭菌干燥变色硅胶颗粒的微量离心管中，并盖上盖子。在微量离心管盖上及管身上标记菌种名称及保存日期。用PARAFILM封口膜将微量离心管封口。

图3是真菌滤纸片保存图片。左图表示干燥好的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片被放入底部装有无菌干燥变色硅胶颗粒的无菌微量离心管中，微量离心管用PARAFILM封口膜封口。

步骤11：将装有干燥的长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片的微量离心管放入透明的微量离心管冷冻盒内。

图3是真菌滤纸片保存图片。右图表示冷冻盒内的微量离心管。

步骤12：将冷冻盒置于﹣20℃冰箱中长期保存。

在真菌滤纸片保存过程中，可以通过观察变色硅胶颗粒颜色来观察微量离心管内环境的干燥状态。

图4是变色硅胶颗粒颜色变化图片。1为深蓝色，表示硅胶干燥，湿度约为0；2为淡蓝色，表示硅胶湿度约为10％；3为蓝白色，表示湿度约为25％；4为粉紫色，表示湿度约为40％；5为粉红色，表示湿度超过50％。变色硅胶颜色为粉紫色或粉红色时需要及时更换硅胶。

图5是透过冷冻盒观察到的变色硅胶颗粒颜色示意图。白色格子表示变色硅胶呈深蓝色，指示干燥状态；淡灰色格子表示变色硅胶呈淡蓝色，尚具有吸湿能力；深灰色格子表示变色硅胶呈蓝白色、蓝紫色或者粉紫色，吸湿能力较弱；黑色格子表示变色硅胶呈粉红色，失去吸湿能力，需要进行更换。透过透明或半透明的冷冻盒观察变色硅胶，判断颜色一目了然，几秒就能清楚看到所保存菌种的干燥状态，从而推断菌种的保存状态，及时更换已失效或即将失效的硅胶。

实施例2硫酸纸袋保存法保存真菌菌种

硫酸纸袋法保存真菌菌种，包括以下步骤。

步骤1：制备PDA培养基。PDA培养基的成分为：取马铃薯200g的煮沸滤液加蒸馏水定容至1000ml，加入葡萄糖20g、琼脂20g。

步骤2：用打孔器将滤纸打成直径为4mm的圆形小滤纸片。

步骤3：将PDA培养基和小滤纸片在121℃湿热灭菌15min，灭菌后制备PDA培养基平板。

步骤4：在超净工作台上，将接种针、镊子等用酒精灯火焰灼烧灭菌，利用无菌接种针将待保存真菌菌种移植至PDA培养基平板上，利用无菌镊子在移植点周围放置数片无菌小滤纸片。

步骤5：将移植菌种的培养基平板放入恒温培养箱25℃黑暗培养，菌丝和/或孢子扩展过程中生长到小滤纸片上，直至真菌菌丝和/或孢子长满小滤纸片。

步骤6：取变色硅胶在烘箱中80℃加热2h进行干燥，冷却，将干燥冷却后的变色硅胶放入干燥器底部。

步骤7：在超净工作台上，将镊子等用酒精灯火焰灼烧灭菌，利用无菌镊子将长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片从培养基平板中取出，放入一个新的无菌培养皿中。

步骤8：将步骤7中装有长满真菌菌丝和/或真菌孢子的小滤纸片的培养皿放入底部盛有干燥硅胶的干燥器中干燥5天。

步骤9：取变色硅胶颗粒置于玻璃培养皿中，在80℃加热2h进行干燥，冷却。

步骤10：将硫酸纸袋在121℃湿热灭菌15min。

步骤11：在超净工作台上，将镊子、药勺等用酒精灯火焰灼烧灭菌，将硫酸纸袋吹干。利用无菌镊子将干燥的真菌滤纸片放入无菌硫酸纸袋中，封口。取冷却后的干燥变色硅胶颗粒放入信封内，将密封的硫酸纸袋装入信封内，封口。再将信封装入塑料密封袋中，封口。在塑料密封袋上记载菌种名称及保存日期。

步骤12：将步骤11中的塑料密封袋置于﹣20℃冰箱中长期保存。

实施例3微量离心管保存法与硫酸纸袋保存法的比较

采用微量离心管保存法保存真菌菌种。按照实施例1的微量离心管保存法，使用10×10规格的透明冷冻盒保存真菌菌种，一个冷冻盒保存100个菌种。

采用硫酸纸袋保存法保存真菌菌种。按照实施例2的硫酸纸袋保存法保存100个菌种。

比较查找菌种的时间。按照硫酸纸袋保存法保存真菌菌种，查找使用菌种时需要逐一打开塑料密封袋、翻看信封，才能找到目标菌种。而采用本发明的微量离心管保存法，直接透过冷冻盒的透明盖子就可以迅速查找菌种，缩短查找时间，缩短冷冻材料放置室温的时间，减少温度变化的影响，从而更有效地保存真菌菌种。

比较查看硅胶颜色花费的时间。硫酸纸袋保存法需要逐一打开密封塑料袋，然后打开信封观察硅胶颜色以确定是否更换硅胶，之后再封上信封及密封塑料袋。100个菌种就需要重复这些操作100次，费时费力。而本发明的微量离心管保存法只需取出冷冻盒，从底部观察，100个菌种仅需数秒钟观察，硅胶颜色一目了然，花费时间极短，从而大大缩短冷冻材料放置在室温的时间。

比较更换硅胶的次数及更换个数。硫酸纸袋保存法每隔一段时间需要更换一次变色硅胶颗粒，一次需要更换数十个甚至一百个。本发明的微量离心管保存法保存的菌种由于密封性好，在开封次数少的情况下，10年都不需要更换硅胶颗粒，偶尔有个别使用频率高的菌种，由于打开次数多导致受潮，才需要更换硅胶。

比较菌种活化操作所花费的时间。硫酸纸袋保存法活化菌种需要逐一打开密封塑料袋，打开信封，再打开硫酸纸袋取出菌种活化，之后密封硫酸纸袋，装入信封，再装入塑料袋，然后密封。本发明的微量离心管保存法只需要打开微量离心管，取出菌种活化，再度密封即可。花费时间短，工作效率高，而且缩短冷冻材料放置于室温的时间。

本发明的微量离心管保存法与硫酸纸袋保存法的对比见表1。

表1.微量离心管保存法与硫酸纸袋保存法的对比

实施例4保存菌种的成活率检测实验

按照实施例1的方法，使用微量离心管保存真菌菌种。挑选来自不同生物学种群及不同保存年限的菌种进行活化，测定其成活率情况，结果如表2。

表2.滤纸片微量离心管低温干燥保存法保存菌种的成活率测定

表2中，滤纸片活化率表示，同一菌种的活化实验中，成活滤纸片个数占总活化滤纸片个数的百分比；菌种成活率表示，同一菌种的活化实验中，具有成活滤纸片的微量离心管的个数占总活化微量离心管个数的百分比。滤纸片活化率为70％的菌种，表示10片真菌滤纸片中有7片真菌滤纸片活化成功。对于一种菌种来说，只要微量离心管中有一片能活化成功，其菌种存活率则为100％。使用本发明的方法保存的菌种，滤纸片活化率均在70％以上，微量离心管的菌种成活率都能达到100％。该实验说明使用本发明的方法保存的菌种不仅保存时间长，而且存活率高。

实施例5致病力测试实验

本实验挑选了三株保存年限不同的褐腐病菌菌株以及刚分离到的新鲜褐腐病菌菌株接种到寄主水果上进行致病力对比实验。通过致病力测试实验，检测保存菌种生物学活性退化情况。

图6表示致病力测试实验结果。图6a表示接种刚分离的新鲜菌种后致病的水果；图6b表示接种利用本发明的方法保存4年的菌种后致病的水果；图6c表示接种利用本发明的方法保存6年的菌种后致病的水果；图6d表示接种利用本发明的方法保存7年的菌种后致病的水果。

如图6所示，三株保存年限不一样的褐腐病菌以及刚分离到的新鲜菌株都能够导致寄主发病，并且所产生的病斑大小没有区别，表明保存菌种的致病力没有退化。