用于治疗铜缺乏的组合物和使用方法

本专利申请要求2018年7月12日提交的美国临时申请号62/697,207的优先权，并通过引用并入其整个公开内容。

本发明在国立卫生研究院颁布的GM111672下在政府支持下完成。政府具有本发明中的某些权利。

技术领域

本公开内容总体上涉及铜缺乏，并且更具体地但非限制性地涉及用于治疗铜缺乏的组合物及其使用方法。

本部分提供背景信息以促进对本公开内容的各个方面的更好理解。应当理解，应从这一角度来阅读本文件的该部分中的陈述，而不是作为现有技术的承认。

铜是细胞色素

铜向细胞色素

本发明的开发部分地由韦尔奇基金会（Welch Foundation）在授权号A-1810下资助。

发明概述

提供本概述来介绍一些概念，所述概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述并不旨在鉴定所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在用作限制所要求保护的主题的范围的辅助。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种在有此需要的受试者中恢复细胞色素

在一些实施方案中，所述方法还包括模仿缺失的铜转运蛋白或伴侣蛋白的功能和恢复细胞内铜稳态。在一些实施方案中，所述方法另外包括跨生物膜转运铜和恢复线粒体呼吸链功能。在一些实施方案中，对于人受试者而言伊来司莫的治疗有效量是在约0.589mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中，伊来司莫在人类中的治疗剂量范围是0.243 -1.17 mg/kg。在一些实施方案中，所述伊来司莫是伊来司莫类似物、模拟物或其衍生物。在一些实施方案中，所述方法还包括绕过

在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种治疗铜代谢病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的伊来司莫，其中所述病症由基因的缺陷或突变造成，所述基因包括、但不限于

在一些实施方案中，所述方法还包括模仿缺失的铜转运蛋白或伴侣蛋白的功能和恢复细胞内铜稳态。在一些实施方案中，所述方法另外包括跨生物膜转运铜和恢复线粒体呼吸链功能。在一些实施方案中，所述方法包括给受试者共同施用伊来司莫和铜。在一些实施方案中，所述治疗有效量是在约0.589 mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中，伊来司莫在人类中的治疗剂量范围是0.243 - 1.17 mg/kg。

在一些实施方案中，所述伊来司莫是与铜络合的伊来司莫(Cu(II)-ES)、伊来司莫类似物、伊来司莫模拟物或其衍生物。在一些实施方案中，所述方法还包括绕过

在另一个实施方案中，本公开内容涉及具有图11B中所示结构的化合物。在一些实施方案中，X

在另一个实施方案中，本公开内容涉及一种药物组合物，其具有图11B中所示的结构、或其互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物、笼形化合物或前药。在一些实施方案中，所述组合物还包括赋形剂，所述赋形剂可以包括、但不限于盐、溶剂、缓冲剂、稀释剂、粘合剂、压缩助剂、造粒剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、片剂包衣、片剂薄膜、着色剂或它们的组合。在一些实施方案中，X

本发明的一个实施方案涉及用于治疗铜代谢病症的化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物由图12中所示结构表示。

附图简要说明

通过结合附图参考下面的详细描述可以获得对本公开内容的方法和组合物的更完整的理解，在附图中：

图1说明了伊来司莫的半数有效剂量(ED

图2A、2B、2C、2D和2E说明了伊来司莫补充通过恢复酵母酿酒酵母（

图3A和3B说明了

图4A和4B说明了ES补充在增加Ctrl1

图5A和5B说明了用递增浓度的伊来司莫处理过的永生化的和原代的人成纤维细胞细胞系的细胞生存力。图5A显示了永生化的对照(MCH46)和

图6A、6B、6C和6D说明了伊来司莫处理改善在

图7说明了伊来司莫-Cu的2次注射阻止门克斯病(

图8说明了在出生后第7和10天皮下注射以后小鼠的平均体重增加。组群和小鼠数目/组群如下命名：WT媒介物(

图9说明了在5、10、15和20周评估时在存活小鼠组群中肌肉强度的倒置金属丝网测试。将小鼠放在具有1 mm直径金属丝的12 mm长度正方形的43 cm

图10说明了在10周龄的存活小鼠组群中通过加速旋转杆评估的运动性能。在测试之前将小鼠在旋转杆(UGO Basile 7650型)上以4 rpm的恒定转速训练三期。为了评估运动性能，将小鼠放在加速旋转杆(4 rpm至40 rpm 300秒，随后恒定转速120秒)上最大420秒。记录跌落或被动旋转的等待时间，并取每只小鼠在三个试验中的平均值。以随机次序在中光线（mid-light）周期中评估所有小鼠。将数据报告为平均组群平均值±SEM。具有Dunnett氏事后检验的ANOVA用于确定显著性。

图11A说明了伊来司莫的化学结构。

图11B说明了根据本公开内容的方面的伊来司莫的类似物的通用化学结构。

图12说明了根据本公开内容的方面的伊来司莫的实例类似物。

详细描述

应当理解，为了实现各个实施方案的不同特征，下述公开内容提供了许多不同的实施方案或实例。下面描述了组分和安排的具体实例来简化本公开内容。当然，这些仅仅是实例且无意意图进行限制。在本文中使用的段落标题是用于组构目的，并且不应解释为限制描述的主题。

铜是细胞色素

细胞溶质的铜通过最近鉴定的酵母蛋白Pic2递送至线粒体基质，其以配体结合形式存储在那里。该线粒体基质铜库是插入到线粒体膜间空间(IMS)内的CcO亚基中的铜离子的主要来源。为了将铜递送到CcO亚基中的铜位点从线粒体基质到IMS的铜动员需要许多进化上保守的蛋白。除了金属伴侣蛋白Cox17、Sco1、Sco2和Cox11（它们已被显示以连串接力（bucket-brigade）方式将铜转移到CcO亚基）外，这些蛋白的精确分子功能尚未得到解决。具体而言，Cox17从线粒体基质接收铜并将其转移至Cox11和Sco1/Sco2，它们然后分别对Cox1和Cox2上的铜位点金属化。最近，还已经显示另外两种蛋白Coa6和Cox19是IMS中该铜递送途径的一部分。

在人类中，

ATP7A是在人类健康中起重要作用的ATP驱动的铜转运蛋白。ATP7A至关重要地参与从肠道的饮食铜摄取。此外，ATP7A将铜递送至分泌途径内的许多铜依赖性酶，并促进铜向大脑的转移。

现在将参考本公开内容的更具体实施方案以及为这样的实施方案提供支持的数据。但是，应当指出，下面的公开内容仅仅用于说明性目的且无意以任何方式限制所要求保护的主题的范围。

试剂. 除了购自Selleckchem的伊来司莫(ES)以外，所有的铜结合化合物均购自Sigma-Aldrich。将酵母-人杂合(hyCOA6)基因构建体针对酵母进行了密码子优化，并使用GENEART

酵母菌株和培养条件. 在本公开内容中使用的酿酒酵母菌株列于如下所示的表2中。通过PCR以及通过在脱离（dropout）平板上的影印铺板，证实酵母菌株可靠性。在包括YPD (1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖)、YPGal (2%半乳糖)、YPGE (3%甘油+ 1%乙醇)的标准YP生长培养基或合成培养基(SC葡萄糖)中培养酵母细胞。关于定性生长测量，将过夜培养物的10倍系列稀释物印迹在YPD或YPGE平板上并在30℃和37℃温育指定的阶段。通过分光光度计法在600 nm测量在液体培养基中的生长。

哺乳动物细胞培养. 在补充了10%胎牛血清(Sigma)和1 mM丙酮酸钠(LifeTechnologies)的高葡萄糖Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中培养人对照MCH46和

氧耗量测量. 为了测量呼吸率，将细胞在YPGal培养基中生长至对数期后期，且然后洗涤，计数，并以10

免疫印迹法和凝胶中活性. 分别进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Blue Native PAGE (BN-PAGE)以分离变性的和天然的蛋白复合物。对于SDS-PAGE，在NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶(Life Technologies, Carlsbad, CA)上分离线粒体裂解物(20 μg)。对于BN-PAGE，通过在4℃温育15分钟，将酵母线粒体溶解在含有1%洋地黄皂苷(Life Technologies)的缓冲液中。20,000×

细胞和线粒体铜测量. 使用Perkin Elmer DRC II电感耦合等离子体-质谱仪(ICP-MS)测量细胞和线粒体铜水平。将完整的酵母细胞和分离的线粒体沉淀物用含有100μM EDTA的水洗涤，称重，并在90℃用40%硝酸(TraceSELECT, Sigma)消化18 h。将样品在超纯无金属水(TraceSELECT, Sigma)中稀释，并通过ICP-MS分析。通过适当稀释商购可得的混合金属标准品(BDH Aristar Plus)，制备铜标准溶液。还通过ICP-MS测量了哺乳动物细胞中的铜浓度。

斑马鱼实验. 斑马鱼研究经海洋生物实验机构动物护理和使用委员会(#16-38)批准。使用标准方法维持并杂交野生型AB品系和

铜结合剂的有针对性搜索将伊来司莫鉴定为拯救酵母

ES从培养基中清除铜，以ES-铜络合物的形式进入细胞，并选择性地积累在线粒体中，在那里它从铜解离。与该概念一致，观察到在补充了ES的

ES拯救许多不同的具有受损铜代谢的酵母突变体. 为了测试ES介导的拯救的特异性，入选了维持细胞和线粒体铜稳态所需的基因的许多酵母突变体。基于基因的进化保守性、致病性突变在人类中的存在和/或相关小鼠表型的存在，对基因进行优先排序（表3，如下所示）。这些酵母突变体在生长两天后在37℃在非发酵培养基中显示显著的呼吸缺陷生长表型，其在生长四天后变得不太明显。尽管程度不同，但大多数酵母突变体通过ES补充得到拯救，这反映了它们在细胞和线粒体铜稳态中的独特作用。ES无法拯救

ES补充拯救具有铜代谢遗传缺陷的哺乳动物细胞系中的CcO亚基水平. 为了扩展在酵母中的发现并测试ES在铜缺乏的哺乳动物细胞培养模型中的效力，构建了

ES补充拯救斑马鱼模型中的铜缺乏表型. 为了确定ES是否可以拯救在完整的发育中的脊椎动物模型中与铜缺乏相关的表型，使用了在编码质膜铜输入蛋白Ctr1的基因中具有无效突变的斑马鱼胚胎。选择斑马鱼的原因是，能够快速监测由于酪氨酸酶对铜的需求而产生的色素沉着缺陷，所述酪氨酸酶是一种催化黑色素生物合成中的关键步骤的酶。野生型斑马鱼胚胎具有特征性的黑色素色素沉着模式，在48 hpf时可见。为了确定ES是否可以拯救斑马鱼中的铜缺乏表型，将在10 nM ES中来自杂合Ctr1杂交的斑马鱼胚胎进行温育，并与未处理的胚胎对比。发现预期的约25%的来自

为了进一步建立ES用于治疗涉及铜向线粒体的缺陷递送的代谢疾病的潜力，测试了ES在拯救与斑马鱼胚胎中的

铜代谢的线粒体病症代表目前尚无疗法的线粒体能量代谢的先天性缺陷的子集。先前使用直接铜补充作为治疗方案的尝试未成功，可能是由于全身性铜水平的严格调节。因此，存在未得到满足的开发更好铜递送剂的需求。考虑到这一目标，在

以靶向方式改变金属的亚细胞浓度和分布的药理干预可能具有治疗益处。例如，铜与双硫仑（食品和药品管理局批准的一种药物）的共同施用增加门克斯病（一种以全身性铜缺乏为特征的遗传性病症）的小鼠模型的脑中的CcO活性。类似地，已经显示Cu

虽然在线粒体中有ES-铜复合物的选择性富集，但酵母

证实Cu-伊来司莫复合物[Cu(II)-ES]的效力的体内小鼠模型数据. 为了评价Cu(II)-ES在人铜缺乏病症的小鼠模型中的潜力，选择了紧密模仿门克斯病的临床和生化表型的充分表征的有花斑斑纹的(

为了测试

除了存活和生长测量以外，还进行了许多神经学试验以评价ES介导的铜向大脑的递送的效力以及动物的整体健康。如前所述，在仅处理两次（第7天和第10天）的小鼠上进行这些测试，下面进行更详细的描述。

金属丝悬挂测试. 该测试评价动物的运动功能和肌肉强度。用媒介物或Cu(II)-ES处理的野生型小鼠在它们的悬挂时间方面没有区别，从而暗示Cu(II)-ES的施用不会引起任何肌肉或运动功能毒性(图9)。就药物效力而言，Cu(II)-ES处理的

转杆测试. 该测试评价神经运动功能，包括平衡、耐力、抓力和运动协调。它涉及将成年小鼠放在悬挂于笼子地板上方的水平定向旋转杆上，并监测直到它们跌落的时间。如在图10中所示，与用媒介物处理的野生型小鼠相比，用Cu(II)-ES处理拯救的

体内小鼠模型数据提示，Cu(II)-ES制剂在以铜代谢的调节异常为特征的许多人病症中是有效的。例如，Cu(II)-ES制剂对枕骨角综合征和X-连锁的远侧遗传性运动神经病(它们两者均由

此外，Cu(II)-ES制剂可能对阿尔茨海默氏病是有效的。阿尔茨海默氏病的显著特征是细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块在大脑中的积聚。已经显示，通过饮食或药理学方式的铜递送可以减少间质性Αβ并改善阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型中的认知功能。并且，Cu(II)-ES制剂可能对Huppke-Brendel综合征是有效的。该综合征是由编码内质网膜乙酰辅酶A转运蛋白的

因此，可以预见，Cu(II)-ES制剂在以铜代谢的调节异常为特征的许多人病症中可以是有效的，所述人病症包括、但不限于枕骨角综合征、X-连锁的远侧遗传性运动神经病、肌萎缩性侧索硬化、Lou Gehrig病、阿尔茨海默氏病、Huppke-Brendel综合征、MEDNIK综合征或它们和相似病症的组合。

上面已经证明，在出生后第7天和第10天通过皮下途径施用的Cu(II)-伊来司莫的共两次注射各3.635 mg/kg是有效的。基于小鼠的预期全身铜含量选择该剂量。预期7日龄的4克幼崽具有约4 μg的全身铜。因此，选择两剂3.635 mg/kg Cu(II)-伊来司莫，其中每剂含2 μg当量的铜，总剂量为4 μg。基于这些实验，在出生的前10天内施用的3-14.5 mg/kg总Cu(II)-伊来司莫的剂量范围可能有效改善

鉴于前述内容，在一些实施方案中，本公开内容进一步涉及在具有以铜代谢的调节异常为特征的病症的人类受试者中的治疗有效剂量。这样，可以基于上述数据外推人剂量，并且本领域技术人员容易想到。

例如，在一些实施方案中，伊来司莫-Cu(II)在人类中的治疗剂量为近似约0.589mg/kg体重。因此，对于重达4 kg的人类儿童，剂量为近似2.36 mg。在一些实施方案中，伊来司莫在人类中的治疗剂量范围是0.243 - 1.17 mg/kg。按照Nair和Jacob (2016) Journalof Basic and Clinical Chemistry, 第7卷(2): 27-31计算人剂量。

尽管已经显示最有效的伊来司莫制剂是溶解于20%CAPTISOL

在一些实施方案中，伊来司莫类似物、模拟物或衍生物可以具有在图11B中描绘的化学结构。参考图11B，在一些实施方案中，X

仍然参考图11B，在一些实施方案中，R

仍然参考图11B，在一些实施方案中，R

仍然参考图11B，在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，上面描述的化合物可以是具有图11B中所描绘的化学结构的药物组合物、或其互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物、笼形化合物或前药。在一些实施方案中，所述化合物还可以包括盐、溶剂、缓冲剂、稀释剂、粘合剂、压缩助剂、造粒剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、片剂包衣或薄膜、着色剂或它们的组合。

在本公开内容中预想的伊来司莫类似物、模拟物和衍生物的化学结构的其它例子在图12中描绘。

鉴于前述内容，在一些实施方案中，本公开内容涉及一种恢复细胞中的细胞色素

在另外的实施方案中，本公开内容涉及治疗有此需要的受试者中的细胞或线粒体铜缺乏的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的伊来司莫。在其它实施方案中，本公开内容涉及一种拯救来自具有

在其它实施方案中，本公开内容涉及一种治疗铜代谢的人病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括单独地或在有铜存在下施用治疗有效量的伊来司莫。在一些实施方案中，所述病症由

尽管已经在附图中说明了本公开内容的各个实施方案并且在前面的详细描述中进行了描述，但是应该理解，本公开内容不限于本文公开的实施方案，而是能够在不脱离本文阐述的本公开内容的精神的前提下进行许多重排、修改和替换。

如本领域普通技术人员所理解的，术语“基本上”被定义为在很大程度上但不一定完全是所指定的。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”、“近似”、“通常”和“约”可以被指定的“在…的[百分比]内”置换，其中百分比包括0.1％、1％、5％和10％。

前述内容概述了几个实施方案的特征，使得本领域技术人员可以更好地理解本公开内容的方面。本领域技术人员应当理解，他们可以容易地将本公开内容用作设计或修改其它方法和组合物的基础，所述其它方法和组合物用于实现本文所介绍的实施方案的相同目的和/或达到相同优点。本领域技术人员还应该认识到，这样的等效构造不脱离本公开内容的精神和范围，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的前提下，它们可以在本文中做出不同的变化、置换和改变。本发明的范围应当仅由所附权利要求的措辞确定。在权利要求中的术语“包含”意指“至少包括”，使得在权利要求中所列举的要素列表是一个开放的组。除非明确地排除，否则术语“一个/种(a)”、“一个/种(a)”和其它单数术语意图包括其复数形式。