一种木瓜蛋白酶分离纯化的工艺

技术领域：本发明属于生物化学酶的纯化制备领域，具体涉及一种木瓜蛋白酶的纯化制备方法。

背景技术：木瓜蛋白酶是存在植物番木瓜中的以半胱氨酸内肽酶为主的蛋白水解酶，可治疗消化不良，多种炎症并有健胃消食作用；也可作为食品添加剂用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、生产调味品等。木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，分离过程中的工艺步骤对其产品活力有较大影响。

木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜的果、茎、根和叶片中；木瓜蛋白酶相对分子质量为23000，白色粉末，等电点为9.6，略溶于水。

发明内容：本发明涉及一种木瓜蛋白酶的纯化制备方法。

本发明是这样来实现的：从成熟果实中提取木瓜蛋白酶，通过超声冷冻技术纯化制备木瓜蛋白酶， 将纯化制备得到的木瓜蛋白酶在275nm波长下测定其吸光度值；与普通搅拌纯化制备方法比较溶液中硫酸根离子残留量和酶活力。发现超声冰浴方式透析时，所得到的木瓜蛋白酶纯度高、活力大。

本发明的纯化制备过程包含如下步骤：

将称量好的木瓜果实原料100g压榨，加入pH5.7的0.04mol/L半胱氨酸溶液100mL，放入搅拌机内搅拌15min，使之充分搅拌均匀；4层纱布过滤。滤液4000rpm离心5min，取上清液调节pH至9.0，8000rpm离心10min，弃去中性和部分碱性蛋白质沉淀，留上清液加入硫酸铵可见沉淀析出；将沉淀转移入透析袋，超声冰浴方式进行透析去除无机离子和有机小分子15min，反复三次，用钡离子检测残余硫酸根离子；透析袋中酶蛋白加入200mLpH5.7的0.02mol/L半胱氨酸并调节pH至6.5；低温静置后有结晶析出。紫外可见分光光度计275nm波长测定酶溶液吸光度，检测酶活力。

具体实施方式:: 以下通过实施实例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。

实施例1：

配制浓度为0.01%的木瓜蛋白酶液，取5mL，加入0.04mol/L半胱氨酸溶液（pH5.7）10mL；于37℃下预热10min，加入1%酪蛋白溶液5.0mL准确反应10min，再加入10%三氯醋酸5.0mL终止酶促反应，上清液于275nm波长测定吸光度值。

实施例2

0-1000μg/mL蛋白质标准曲线的绘制。

分别吸取牛血清蛋白的标准液（1000μg/mL）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，依次加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0mL水，混匀后，分别与5.0mL5%考马斯亮蓝混合，振摇后在595nm测定吸光度值。以吸光度为横坐标，牛血清蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

吸取10%木瓜蛋白酶1mL同法操作读取吸光度值，标准曲线中查找相应的浓度。

实施例3

取2mL氯化钡0.01mol/L溶液放入一支试管滴加2-3滴透析外液至试管中；超声冰浴15min，三次换水后无白色沉淀，普通搅拌方法4次换水后仍有浑浊。