一种黄精果聚糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品和医药技术领域，特别是涉及一种黄精果聚糖及其制备方法和应用。

背景技术

黄精是百合科黄精属植物，因有补益功效而得名。该属植物主要包括黄精(Polygonatum sibiricum)、滇黄精(Polygonatum kingianum)、多花黄精(Polygonatumcyrtonema)、棒丝黄精(Polygonatum cathcartii)、玉竹(polygonatum odoratum)、康定玉竹(Polygonatum prattii)、小玉竹(Polygonatum humile)、毛筒玉竹(Polygonatuminflatum)、垂叶黄精(Polygonatum curvistylum)、长苞黄精(Polygonatum desoulayi)、长梗黄精(Polygonatum filipes)、粗毛黄精(Polygonatum hirtellum)、大苞黄精(Polygonatum megaphyllum)、点花黄精(Polygonatum punctatum)、短筒黄精(Polygonatum altelobatum)、互卷黄精(Polygonatum alternicirrhosum)、距药黄精(Polygonatum franchetii)、独花黄精(Polygonatum hookeri)、二苞黄精(Polygonatuminvolucratum)、节根黄精(Polygonatum nodosum)、对叶黄精(Polygonatumoppositifolium)、湖北黄精(Polygonatum zanlanscianense)、格脉黄精(Polygonatumtessellatum)、五叶黄精(Polygonatum acuminatifolium)、卷叶黄精(Polygonatumcirrhifolium)、细根茎黄精(Polygonatum gracile)、热河黄精(Polygonatummacropodium)、新疆黄精(Polygonatum roseum)、轮叶黄精(Polygonatum verticillatum)和狭叶黄精(Polygonatum stenophyllum)等。黄精药用部位为根茎，味甘，平。补气养阴，健脾，润肺，益肾。用于脾虚胃弱，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴。黄精属植物的根茎可作药用，其根茎中的化学成分主要有：黄精多糖、粘液质、淀粉、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素、维生素、脂肪、蛋白质以及多种对人体有用的氨基酸等化合物，而其中的黄精多糖正是黄精属植物中最具有药用功效的成分。

然而，植物多糖的化学结构极其复杂，同一植物中往往含有多种不同类型的多糖，多糖的生物学功效研究开展的也较少，因而植物多糖在生物医药和食品领域的应用研发进展缓慢。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术对于黄精研究深度不足，黄精中植物多糖成分复杂，其植物多糖研究进展缓慢的问题，提供一种黄精果聚糖及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种黄精果聚糖，所述黄精果聚糖具有如下通式I表示的结构：

式(I)中，m、n和p表示糖重复单元数，m、n和p为包括0在内的自然数，且m+n>p。

本发明的结构新颖的黄精果聚糖，经过药理学研究发现，可以促进包括乳酸杆菌和双歧杆菌在内的益生菌的增殖，且在2-12小时效果显著；随着药物浓度的增加，黄精果聚糖促进益生菌增殖的能力明显增强，表明所述黄精果聚糖能促进益生菌的生长。

作为本发明的优选方案，所述黄精果聚糖的重均分子量为2000Da～8000Da，多分散系数为1～3。

为了更好的获得黄精果聚糖的高纯度产物，本发明还提供了一种制备方法，以确保黄精提取过程分离效果更好，所得产物纯净度更满足应用要求。

一种上述黄精果聚糖的制备方法，包括以下步骤：

提取所述黄精属植物的根茎粗多糖；

纯化所述黄精根茎粗多糖中重均分子量为2000Da～8000Da的组分，得到所述黄精果聚糖。

进一步，提取所述黄精果聚糖的步骤包括以下步骤：将黄精属植物的根茎用热水提取后，再分别用95％乙醇分级沉淀黄精多糖，使其醇浓度分别达到40v％、60v％和80v％，然后离心并收集80v％乙醇浓度时的沉淀。按照分级沉淀的方式，逐渐增大乙醇的浓度，实现沉淀分离纯化目的。

进一步，所述黄精属植物是指黄精属各黄精。可以是黄精属各黄精中的一种黄精，也可以是一种以上的黄精混合物。上述黄精属各黄精是至少一种现有的黄精。

进一步，所述制备方法包括以下步骤：S1、提取所述黄精的80v％乙醇浓度下的粗多糖；S2、纯化所述黄精多糖中重均分子量为2000Da～8000Da的组分，得到所述黄精果聚糖。

进一步，80v％乙醇浓度下的粗多糖，是通过将黄精属植物的根茎用热水提取得后，再经过醇沉分离得到的，80v％乙醇浓度沉淀物。

在其中一个实施例中，提取所述黄精果聚糖的步骤包括以下步骤：先将所述黄精以95％乙醇沉淀，使其最后乙醇浓度达80％，离心并收集醇沉沉淀。

在其中一个实施例中，纯化所述黄精多糖中重均分子量为2000Da～8000Da的组分的方法，选自凝胶排阻层析柱法、透析法和超滤法中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述黄精属植物包括黄精、滇黄精、多花黄精、棒丝黄精、玉竹、康定玉竹、小玉竹、毛筒玉竹、垂叶黄精、长苞黄精、长梗黄精、粗毛黄精、大苞黄精、点花黄精、短筒黄精、互卷黄精、距药黄精、独花黄精、二苞黄精、节根黄精、对叶黄精、湖北黄精、格脉黄精、五叶黄精、卷叶黄精、细根茎黄精、热河黄精、新疆黄精、轮叶黄精和狭叶黄精中的一种或多种。

一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的黄精果聚糖。

一种上述的黄精果聚糖的应用，在调节胃肠道菌群、促进肠道蠕动和/或促消化的食品和/或药物制备中的应用。

一种上述黄精果聚糖在促进益生菌生长产品中的应用。

在其中一个实施例中，所述药物组合物的剂型为冻干粉、口服液、胶囊等中的一种。

一种上述药物组合物在制备用于促进消化、肠道蠕动的食品和药物中的应用。

上述黄精果聚糖在制备面膜、化妆品、日化品等中的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明首次分离得到黄精果聚糖，该果聚糖具有促进益生菌的增殖效果，表现出显著的浓度依赖特性，可以作为促进益生菌各种制剂的活性成分应用。

2、本发明的黄精果聚糖能够促进益生菌的增殖，调节肠道益生菌增殖，因而具有食疗保健应用价值。可以作为预防、治疗或调理方面的食品、保健品或药品的主要或辅助活性成分进行应用。

附图说明：

图1为黄精果聚糖的HPLC图；

图2为黄精果聚糖的MALDI-TOF MS图；

图3为黄精果聚糖的单糖组成分析HPLC图，其中图a为单糖标准品的HPLC图，图b为黄精果聚糖的HPLC图，Fru表示果糖，Glc表示葡萄糖；

图4为黄精果聚糖的红外光谱图；

图5为黄精果聚糖的核磁共振谱图，其中图a为1H NMR谱，图b为13C NMR谱；

图6为黄精果聚糖的核磁共振谱图，其中图a为HSQC-TOCSY NMR图，图b为HMBC NMR图；

图7为不同时间黄精果聚糖对接种包括乳酸杆菌和双歧杆菌在内的益生菌的培养基pH值的影响(n＝3)；

图8为不同时间黄精果聚糖对接种包括乳酸杆菌和双歧杆菌在内的益生菌的培养基OD值的影响(n＝3)；

图9不同时间为黄精果聚糖对接种包括乳酸杆菌和双歧杆菌在内的益生菌的培养基中细菌数量的影响(n＝3)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本发明所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明中使用的乙醇溶液是体积百分比的乙醇水溶液，以％表示百分比例，应当理解为vol％的意思。

本发明一实施例的黄精果聚糖，具有如下通式I表示的结构：

式(I)中，m、n和p表示糖重复单元数，m、n和p为包括0在内的自然数，且m+n>p。

所述黄精果聚糖以β(2→6)糖苷键为主链，侧链为果糖以β(2→1)糖苷键连接到此主链上。

本发明人对黄精经过深入的研究惊奇地发现，从多花黄精等黄精属植物中，应用创新性方法提取纯化可获得一种结构新颖的黄精果聚糖。通过进一步的药理活性研究发现，所述新发现的黄精果聚糖能够显著促进益生菌的增殖，因而所述黄精果聚糖具有用于肠道调节和助消化药物和/或食品的制备的用途。

因此，本发明提供的一种结构新颖的黄精果聚糖及其制备方法和药用组合物，以及在制备肠道调节和助消化药物中的应用，均为首次公开报道。

在一个具体示例中，黄精果聚糖的重均分子量为2000Da～8000Da，多分散系数为1～2。优选地，黄精果聚糖的重均分子量为3000Da～5000Da。

在一个具体示例中，当通式I中的p＝0，要满足m+n>p，则m和n最小值m＝n＝1，黄精果聚糖具有如下化学式II表示的结构：

本发明一实施方案的上述黄精果聚糖的制备方法，包括以下步骤S1～S2：

S1：提取黄精属植物的粗黄精果聚糖。

S2：纯化粗黄精果聚糖中重均分子量为2000Da～8000Da的组分，得到黄精果聚糖。

在一个具体示例中，黄精属植物包括但不限于黄精、滇黄精、多花黄精、棒丝黄精、玉竹、康定玉竹、小玉竹、毛筒玉竹、垂叶黄精、长苞黄精、长梗黄精、粗毛黄精、大苞黄精、点花黄精、短筒黄精、互卷黄精、距药黄精、独花黄精、二苞黄精、节根黄精、对叶黄精、湖北黄精、格脉黄精、五叶黄精、卷叶黄精、细根茎黄精、热河黄精、新疆黄精、轮叶黄精和狭叶黄精。鉴于黄精属植物的种植资源情况，优选地，上述黄精属植物为黄精、滇黄精、多花黄精和玉竹中的一种和/或多种。

作为本发明的优选方案，提取所述黄精的80v％乙醇浓度下的粗多糖，具体采用以下方法进行提取：

称取黄精(优选为多花黄精)，加入5-10倍水回流提取1-4次，每次1-5小时，过滤，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至0.5-3倍原始黄精药材重量。然后，调节乙醇浓度为40v％，离心，得40％乙醇沉物以及第一次上清液。第一次上清液中，继续调节乙醇浓度至60v％，离心，得60％乙醇沉物和第二次上清液。搅拌下，调节乙醇浓度至80v％，离心，得80％乙醇沉物和80％乙醇沉上清液，用纯乙醇或95％乙醇洗涤80％乙醇沉物2-4次后，挥发除去乙醇，得粗黄精果聚糖。

进一步，上述40v％、60v％、80v％乙醇浓度调整控制，可以上下浮动5v％。

在一个具体示例中，提取黄精果聚糖的步骤包括以下步骤：称取多花黄精生品200g，10倍水回流提取2次，每次4h，过滤，合并提取液，离心，得上清液，浓缩至680mL。加入95％乙醇至醇浓度为40％，离心，得40％乙醇沉物以及1370mL上清液。上述40％乙醇沉上清液中，搅拌下加入783mL 95％乙醇，离心，得60％乙醇沉物和2000mL 60％乙醇沉上清液。搅拌下，上清液中加入2667mL 95％乙醇，离心，得80％乙醇沉物和80％乙醇沉上清液，95％乙醇洗涤80％乙醇沉物3次，挥醇得粗黄精果聚糖。

在一个具体示例中，纯化黄精多糖中重均分子量为2000Da～8000Da的组分的方法选自阴离子交换柱层析法、凝胶排阻层析柱法、透析法和超滤法中的一种或多种。

具体地，可将粗黄精果聚糖组分加去离子水复溶后，离心除去少量不溶物，任选醇沉分级法、凝胶排阻层析法、透析法或超滤法等方法进行纯化，收集含有果聚糖的流份或截留液或透过液，若含有盐需脱盐后，直接真空冷冻干燥或减压浓缩后醇沉减压干燥，即得纯化的黄精果聚糖。

本领域技术人员容易理解，对于凝胶排阻层析法，是根据黄精多糖组分中多糖物质的分子量，合理选择凝胶材料，例如葡聚糖凝胶Sephadex系列、琼脂糖凝胶Sepharose系列、聚丙烯酰胺Bio-Gel P系列以及它们相互交联形成的凝胶填料，然后按照各个填料的实际性能进行装柱、上样以及用含盐或不含盐洗脱溶液依次洗脱并收集流份。因糖类物质无特征紫外吸收，可以采用硫酸苯酚法等显色检测流份，绘制流出曲线，合并各个流出峰，流出液可浓缩或不需要浓缩，装入透析袋透析或超滤膜包超滤脱盐，收集脱盐后的截留液，经真空冷冻干燥或真空减压干燥，即得纯化的黄精果聚糖。或者采用透析法或超滤法等方法进行纯化黄精多糖组分时，选择适当分子量的超滤膜包进行切向流超滤截留处理。例如，黄精多糖组分水溶液先经一个大于黄精果聚糖的分子量的透析袋或超滤膜包充分透析或超滤，收集透过液或流出液，除去大分子量的物质，然后再经小于黄精果聚糖的分子量的透析袋或超滤膜包充分透析或超滤，收集截留液，浓缩后经真空冷冻干燥或真空减压干燥，即得纯化的黄精果聚糖。

本发明还提供一种所述黄精果聚糖的结构解析方法，包括以下步骤：

(1)分子量测定：取纯化的黄精果聚糖样品，任选采用高效凝胶排阻色谱-示差检测器检测法(HPGPC-RI)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析黄精果聚糖的分子量及其分布。

(2)单糖组成分析：取纯化的黄精果聚糖样品，用浓度较低的酸使之部分水解为单糖，然后直接进如sugar-D的色谱柱，经高效液相色谱仪分析黄精果聚糖的单糖组成。

(3)甲基化分析：取纯化的黄精果聚糖样品，用如碘甲烷等卤代甲烷试剂在碱性条件下，进行多糖羟基的部分甲基化，在碱性条件下水解后用硼氢化钠还原，用酸酐对甲基化糖醇进行乙酰化，萃取定容后，进行气相色谱仪联用质谱仪(GC-MS)分析，判断黄精果聚糖的糖苷键连接方式。

(4)红外光谱分析：取纯化的黄精果聚糖样品，充分干燥后，采用固体溴化钾压片法，在红外光谱仪上测定样品的红外光谱。

(5)核磁共振分析：取纯化的黄精果聚糖样品溶解于氘代重水中，冷冻真空干燥，重复三次重水交换后，溶解到高氘代度的重水中，检测样品的核磁共振谱包括一维

(6)综合数据解析：综合分析上述步骤的分析数据，阐明黄精果聚糖的化学结构。

按照上述结构解析方法，对应用本发明的制备方法从多花黄精中提取纯化的黄精果聚糖进行结构分析。结果显示，所述黄精果聚糖在HPGPC凝胶色谱峰上只显示一个对称性良好的色谱峰，而其重均分子量为～3kDa，其多分散指数为1.20；单糖组成显示所述黄精果聚糖由果糖和葡萄糖组成；甲基化分析显示，所述黄精果聚糖存在β(2→6)糖苷键和β(2→1)糖苷键；红外光谱分析显示，糖环和环上的羟基吸收峰，以及在指纹图谱区有呋喃糖吸收信号峰都符合果聚糖的吸收峰；根据核磁共振谱数据，可以清晰地归属黄精果聚糖的

综合上述数据，所述黄精果聚糖具有如通式I所示的结构特征：以β(2→6)糖苷键为主链，而侧链果糖以β(2→1)糖苷键连接到此主链上。

式(I)中，m、n和p表示糖重复单元数，m、n和p为包括0在内的自然数，且m+n>p。

按照本发明所述制备方法及结构解析方法发现，黄精属植物中含有具有化学式II所示结构的黄精果聚糖。

显然，如化学式II所示结构的黄精果聚糖是如通式I所示黄精果聚糖当p＝0，要满足m+n>p，则m和n最小值m＝n＝1时的结构。

本发明经药理学研究惊奇地发现，所述黄精果聚糖可以促进益生菌的增殖，且在2-12小时效果显著；随着药物浓度的增加，黄精果聚糖促进益生菌的能力明显增强，表明所述黄精果聚糖能够促进益生菌的增殖。因此，所述结构新颖的黄精果聚糖具有促进益生菌增殖，因而具有调节肠道菌群的实际应用价值。

为此，进一步本发明还提供所述黄精果聚糖在制备调节肠道菌群、促进消化和增强肠道蠕动药物和/或食品中的应用。

本发明一实施例的药物组合物，包括所述黄精果聚糖及其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂，和药学上和/或食品上可接受的辅料。可选地，上述辅料包括药用赋形剂、载体和/或稀释剂和/或矫味剂等。

进一步，所述药物组合物还含有药用和/或食品用辅料。例如含有赋型剂或矫味剂中的至少一种。

进一步，所述药物组合物包括有效量的黄精果聚糖。

在一个具体示例中，上述药物组合物的剂型为注射剂或固体制剂，例如水针剂和注射用冻干粉针剂和胶囊剂和泡腾剂等，辅料包括赋型剂和/或矫味剂等。

本发明还提供上述药物组合物在制备用于调节肠道菌群、促进消化和增强肠道蠕动药物和/或功能食品中的应用。

本发明所述“有效量”是指足以获得所期望的结果或对不希望的病况具有效果的量。例如，“治疗有效量”指的是足以获得所期望的治疗结果或对不希望的症状具有效果，但是通常不足以引起不利的副作用的量。

本发明所述的调节肠道菌群、促进消化、增强肠道蠕动等方向的应用，是指旨在改善、稳定与消化道相关的病理状况或病症作为目的给予患者进行应用。既包括积极治疗，直接改善病理状况或病症；也包括预防性治疗，即降低或部分或完全地抑制病理病况或病症的发生。其中预防是指排除、避免、消除、防范、制止或妨碍某事发生，尤其是通过预先作用。

通常本发明上述药物或含有上述药物的组合物，在哺乳动物(例如人类)食用食品或保健品的制备中的应用。当然，某些情况下也可以考虑将其应用于其他哺乳动物，诸如饲养宠物猫、狗等；又或者牲畜，牛、马、猪、绵羊、山羊等，其他如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等。

本发明的黄精聚糖制备成各种产剖时，可以加入必要的辅料和/或助剂。例如药学上可接受的载体，泛指水或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液等。非水溶液可以简单列举的包括诸如乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纤维素、植物油等等中的一种或多种。如果用于制备口服剂型，如片剂、胶囊剂型，还可以包括其他的填充剂、崩解剂、缓释剂、防腐剂、分散剂等。作为举例，防腐剂可以是尼泊金酯、氯丁醇、山梨酸等。

以下结合附图以特定的具体实施例来详细说明本发明内容，但这些具体实施例对本发明的权利要求的范围不构成任何限制。

以下实施例中应用的原材料、化合物、组合物或组分，主要采用商业购买获得，或使用本领域技术人员通常已知的技术制备得到。其次，下述实施例中的制备工艺方法实验操作方法按照一般的实验指导进，实施例中的实验部分对本领域技术人员清楚的形式进行举例说明，并非仅限于下述实施例中的方法。本领域技术人员可以根据常规知识进行必要的衍生，以获得适宜特定原材料的实验过程。

实施例1黄精果聚糖的提取纯化

1.黄精多糖提取

称取多花黄精生品200g，10倍重量水回流提取2次，每次4h，过滤，合并提取液，离心，得上清液，浓缩得680mL浓缩液。加入95v％乙醇495mL至醇浓度为40v％，离心(4000rpm×15min)，得40％乙醇沉物和上清液。搅拌下，40v％醇沉上清液中加入783mL 95v％乙醇，至醇浓度达60v％，离心(4000rpm×15min)，得60v％乙醇沉物和上清液。搅拌下，60％乙醇沉上清液中加入2667mL 95v％乙醇，至醇浓度达80v％，离心(4000rpm×15min)，得80v％乙醇沉物和上清液，95％乙醇洗涤80％醇沉物3次，挥醇后得粗黄精果聚糖。其中，挥醇可以采用减压蒸发挥发脱除乙醇。

2.黄精果聚糖纯化

取上述粗黄精果聚糖，溶解于去离子水中，上DEAE-52(3.2cm×30cm)弱阴离子交换柱，分别用去离子水和0.1、0.5和1.0M浓度NaCl溶液洗脱，每管约10mL收集洗脱流份。苯酚硫酸法检测，绘制流出曲线，最后一个流份为不含或少量含多糖流份，收集该流份后，减压浓缩，冷冻真空干燥，即得纯化的黄精果聚糖22.83g。

实施例2黄精果聚糖的结构解析

1.实验过程

1.1.分子量及其分布

采用高效凝胶排阻色谱-示差检测器检测法(HPGPC-RI)分析实施例1制备的黄精果聚糖的分子量及其分布。

色谱仪器：Agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；

色谱条件：Shodex Ohpak SB-804HQ(7.8mm×300mm)柱；柱温为35℃；示差检测器；流动相为0.1M浓度NaCl，流速0.5mL/min；

测定过程：各取5mg黄精果聚糖样品或已知分子量的右旋糖酐对照品加流动相配制为5mg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，滤过液50μL进高效液相色谱仪分析，记录色谱图。数据采用GPC软件处理，绘制标准曲线，将数据带入方程，计算分子量。

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析黄精果聚糖的分子量及其分布

仪器：Bruker UltrafleXtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；

仪器条件：线性正离子模式；N2激光源，基质为2,5-二羟基苯甲酸。

测定过程：称取一定量黄精果聚糖样品加去离子水配制成溶液，取1μL样品溶液与1μL基质溶液混合后点在样品靶上，自然干燥后测定黄精果聚糖分子量，记录质谱图。数据采用flexAnalysis软件处理，计算分子量。

1.2单糖组成分析

取黄精果聚糖样品约20mg，置于2个COD试管中，向试管中加入2mL 0.05M的硫酸溶液溶解，于80℃烘箱中水解反应40min，反应完后，冷却至室温，取出置于5mL EP管(离心管)后，加入碳酸钡固体粉末中和硫酸，离心(15000rpm×15min)取上清，过0.22μm微孔滤膜供色谱分析。

色谱条件：仪器：Agilent technologies 1260series高效液相色谱仪；色谱柱：Cosmosil Sugar-D柱(2.0mm×250mm，5μm)；柱温为30℃；流动相为乙腈:水(85:15)；流速：0.2mL/min；进样体积为20μL；RID检测器。

1.3甲基化分析

甲基化反应：称取黄精果聚糖样品10mg置于5mL反应瓶中，溶解于4mL DMSO中，依次加入100mg氢氧化钠和600μL碘甲烷，充氮气室温超声反应1h。反应结束后，加入2mL纯水，用1M盐酸溶液调节溶液pH值至中性，加入6mL三氯甲烷进行萃取，取有机相40℃减压干燥后真空干燥12h。

甲基化多糖的酸水解：上述干燥后样品，溶解于2mL 0.5M TFA溶液中，封管120℃下酸水解5h。

甲基化单糖的还原：上述水解液用1M NaOH调pH为10～12，加入50mg硼氢化钠，50℃水浴搅拌2h后，加入250μL冰乙酸终止反应，反应液冻干。

甲基化糖醇的乙酰化：上述冻干样品中加入1mL吡啶和1mL乙酸酐，于试管中，100℃封管反应1h。冷却后，加入1mL水，每次2mL二氯甲烷萃取3次，有机相用N

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(50mm×0.25mm，0.25μm)；柱温：起始温度80℃，保持11min，程序升温5℃/min至250℃，保持5min；载气为高纯氦气；载气流量为1.5mL/min；进样口温度270℃；柱前压100KPa；不分流；进样量：2μL。

MS条件：电离方式EI；电子能量70；传输线温度290℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；质量范围50～600；采用CCRC标准谱库计算机检索定性。

1.4红外光谱分析

按照2020版《中国药典》第四部分采用固体压片法：取2mg样品经40℃真空干燥24h，采用KBr压片法，使用Tensor 27傅立叶变换中红外光谱仪对样品进行4000～400cm

1.5核磁共振分析

取黄精果聚糖样品10mg溶于0.5mL D

2.实验结果

本发明的黄精果聚糖的性状为：类白色固体，无味，易溶于水，微溶于乙醇等有机溶剂，有引湿性。

高效凝胶排阻色谱法分析(HPGPC-RI)结果表明(附图1)，黄精果聚糖仅有一个对称的色谱峰，其重均分子量(Mw)为3803Da，多分散系数为1.21。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结果显示(附图2)，黄精果聚糖的分子量范围为2000.9-7027.5Da，强度最高的黄精果聚糖的对应分子量为2973.7Da。

单糖组成分析结果显示(附图3)，所述黄精果聚糖经直接酸水解后进Sugar-D柱后的HPLC图显示仅有一个果糖和葡萄糖的峰，其中果糖的峰面积远高于葡萄糖，说明所述黄精果聚糖的单糖组成中仅含有果糖和葡萄糖，且葡萄糖含量远低于果糖，符合果聚糖的结构特征。

甲基化分析结果表明，所述黄精果聚糖存在β(2→6)果糖糖苷键、β(2→1,6)果糖糖苷键、β(→2)果糖糖苷键、β(2→1)果糖糖苷键和α(1→6)葡萄糖糖苷键。

如附图4所示，红外光谱(cm

核磁共振NMR检测分析结果见附图5和附图6，详细的

综合上述数据可知，这个结构新颖的黄精果聚糖的化学结构式如通式I所示。

式(I)中，m、n和p表示糖重复单元数，m、n和p为包括0在内的自然数，且m+n>p。

其结构特征为：(1)所述黄精果聚糖是从黄精根茎中提取纯化的多糖，为植物性果聚糖；(2)所述黄精果聚糖的单糖组成中，果糖为主和葡萄糖少量；(3)所述黄精果聚糖的单糖连接方式为：以β(2→6)糖苷键为主链，侧链果糖以β(2→1)糖苷键连接到此主链上。经国内外公开文献检索，该黄精果聚糖的这种排列方式未见公开报道，为本发明人首次发现。

表1.黄精果聚糖的

表2.黄精果聚糖的

其中，

2,6-O-β-D-Fruf表示→6)-β-D-Fruf-(2→；

1,2,6-O-β-D-Fruf表示→1,6)-β-D-Fruf-(2→；

2-O-β-D-Fruf表示β-D-Fruf-(2→；

2,1-O-β-D-Fruf表示→1)-β-D-Fruf-(2→；

1,6-α-D-Glcp表示→1)-α-D-Glcp-(6→。

实施例3黄精果聚糖的促进益生菌生长实验

1.受试品、试剂和菌株

黄精果聚糖，简写为DP1，按照实施例1制备；无糖Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基，北京coolaber公司；4种菌株分别为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)均购自北京北纳创联生物技术研究院。

2.实验方法

2.1溶液配制

分别称取600mg低聚果糖(FOS)、600mg黄精果聚糖(DP1)以及700mg葡萄糖(Glucose)，各用无菌水配制成10mg/mL溶液，用0.22μm的无菌滤器过滤后，每种溶液均以5mg/mL的浓度添加到无糖的MRS培养基中。取56mL灭菌好的MRS培养基，加56mL无菌水稀释过滤的样品，混合后，配制成5mg/mL MRS培养基。B.bifidum和L.plantarum在相应的培养基上接种1×10

2.2细菌培养

细菌培养基：MRS(L-半胱氨酸)培养基含0.05％的L-半胱氨酸；

细菌复苏：准备1支相对液体培养基及2个平板，在超净台中用小砂轮在管身1/2处划圈，然后用75vol％的酒精擦拭管壁，用镊子敲断。将0.3-0.5mL的液体培养基注入冻干管中，轻轻吹打混匀，充分溶解成菌悬液，吸取1/3加入液体培养基中，剩余平均加入到2个平板上，在相应的条件下培养至长出菌落。

扩菌：从平板上挑取单个菌落于液体培养基中，37℃相应条件下摇床上培养。

保种：取25ml菌液4℃下离心(4100rpm×10min)，去上清液，加2.5mL液体培养基悬起沉淀，加等体积的甘油混匀分装置-80℃冻存。

2.3各细菌培养基的培养

各细菌菌株置于厌氧环境(85％N

2.4pH值的检测

在各取样时间点取出培养液，平行取三份，离心后(4000rpm×10min)，测定pH值，每个时间点测3次。

2.5OD值的检测

在各取样时间点取出培养液，平行取三份，上下振摇15s后，倒入比色皿内，于600nm波长处用紫外分光光度计测定OD值，每个时间点测3次。

2.6细菌数目的检测

在各取样时间点取出培养液，平行取三份，上下振摇15s后，从中取出一定量培养液，以一定倍数稀释后在血球计数板上数，每个时间点测3次。

3.实验结果

3.1对各细菌培养基中pH值的影响

如附图7所示，与空白组相比，黄精果聚糖和其他各处理组的pH值均有不同程度的降低，表明各细菌株在黄精果聚糖(DP1)、低聚果糖(FOS)和葡萄糖(Glucose)存在下，其如乳酸、乙酸等短链脂肪酸代谢产物有所增加，从而使培养基pH值降低。

3.2对各细菌培养基中OD值的影响

结果如附图8所示，以不同培养基培养得到的培养液中OD值在0到12h快速上升，12h后各培养液的OD值基本保持不变；黄精果聚糖(DP1)、低聚果糖(FOS)和葡萄糖(Glucose)组的OD值在相应时间内均显著高于空白组。黄精果聚糖、低聚果糖和葡萄糖均可促进各细菌菌株的增殖，而黄精果聚糖处理后细菌增殖数量与空白组有显著差异。

3.3对各细菌培养基中细菌菌株数目的影响

如附图9所示，在含有黄精果聚糖的培养基中，4个细菌菌株均在2-12小时进入指数期，快速增殖；以24h或48h细菌进入平台期的最大细菌菌株数目比较发现，黄精果聚糖组与低聚果聚糖组和葡萄糖组相当，均明显高于空白组；对4种不同菌种的增殖情况随菌种不同而有差异，对动物双歧杆菌乳亚种(B.animalis subsp.lactis)促增殖活性显著高于嗜酸乳酸杆菌(L.acidophilus)。

上述结果证实，本发明所述黄精果聚糖具有显著的促进益生菌生长活性，因而所述结构新颖的黄精果聚糖具有改善肠道菌群、促进消化和增强肠道蠕动的实际应用价值。

实施例4黄精果聚糖冻干粉针的制备

1.材料

同实施例1方法所得黄精果聚糖，药用级氯化钠。

2.处方

3.制备工艺

称取处方量的黄精果聚糖和氯化钠加注射用水至全量，搅拌使溶解完全，间歇式热压法灭菌。加入0.3％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。含量合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；分装于管制西林瓶中，每瓶0.5mL，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，包装得成品。

冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持4h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至250μbar。开始升华：1h匀速升温至-20℃，保持3h；3h匀速升温至-10℃，保持8h，真空保持100～250μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。

实施例5黄精果聚糖胶囊剂的制备

1.材料

同实施例1方法所得黄精果聚糖，食品或药品级淀粉。

2.处方

3.制备工艺

称取处方量的黄精果聚糖和淀粉，搅拌使混合完全。加入适量滑石粉，用乙醇湿法制粒，过筛干燥后，装入2号胶囊壳中，每个胶囊体装填60mg的黄精果聚糖，制得黄精果聚糖胶囊。

实施例6黄精果聚糖口服液的制备

1.材料

同实施例1方法所得黄精果聚糖，食品或药品级矫味剂为天门冬酰氨苯丙氨酸甲酯和苹果香精。

2.处方

3.制备工艺

称取处方量的黄精果聚糖、天门冬酰氨苯丙氨酸甲酯和苹果香精，加纯化水完全溶解后，0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液按每瓶2mL的量，经口服液罐装机罐装，封口后灭菌，即得。

实施例7黄精果聚糖洁面乳制备

1.材料

同实施例1方法所得黄精果聚糖，采用化妆品级别或食品级的原料。

2.处方

黄精果聚糖7g、甘油2.0g、丁二醇4.0g、丙二醇0.5g、EDTA钠0.1g、瓜尔胶0.3g、二氧化锌2.0g、C12-15醇苯甲酸酯4.0g、C12-20烷基葡糖苷3.0g、C14-22醇0.5g、鲸蜡硬脂醇1.2g、尼泊金酯0.2g、硬脂酸钠0.3g、聚二甲基硅氧烷醇0.5g、聚山梨醇酯0.2g、去离子水55g。

3.制备工艺

称取处方量的黄精果聚糖，加纯化水完全溶解；取甘油、丁二醇、丙二醇、EDTA钠、瓜尔胶、二氧化锌、硬脂酸钠、C12-15醇苯甲酸酯、C12-20烷基葡糖苷、C14-22醇、鲸蜡硬脂醇，加纯化水完全溶解；取尼泊金酯、聚二甲基硅氧烷醇、聚山梨醇酯，加纯化水完全溶解。将前述准备的溶液混合，充分搅拌均匀，0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液按每瓶30mL的量罐装，封口后灭菌，即得。

实施例8黄精果聚糖面膜制备

1.材料

同实施例1方法所得黄精果聚糖，采用化妆品级别或食品级的原料。

2.处方

黄精果聚糖12g、透明汉生胶3.5g、水解透明质酸2.0g、透明质酸钠2.0g、丙二醇0.3g、卡波姆0.5g、尼泊金酯0.1、PPG-10甲基葡糖醚0.25g、甘油葡糖苷1.0g、去离子水45g。

3.面膜制备工艺

步骤1、取去离子水、透明汉生胶、水解透明质酸、透明质酸钠、丙二醇、卡波姆、尼泊金酯加入乳化锅内，一边搅拌一边加热至75℃，达到温度以后保温并继续搅拌直至溶液呈透明均一，然后保温20分钟后，降温至42℃。

步骤2、调节pH＝7.6±0.2。

步骤3、继续降温至35℃，加入PPG-10甲基葡糖醚、黄精果聚糖、甘油葡糖苷，继续搅拌均匀，检验合格后即可出料。以无纺布底材进行涂布，涂布量为2.1g每平方厘米。

本申请所引用的各专利、专利申请和出版文的说明全部纳入本申请参考。引用的任何参考文献不应认为是允许这些参考文献可以用来作为本申请的“现有技术”。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。