鉴定和定量蛋白质的方法和系统

技术领域

本发明总体上涉及鉴定和/或定量蛋白质的方法和系统。

背景技术

基于蛋白质的生物制药产品必须满足非常高的纯度标准。有几种工艺相关杂质和产品相关杂质在生物制药中被发现。关于活性、功效和安全性，这些杂质不具有与所需产品的特性可比的特性。一个实例是蛋白质的翻译后修饰物(PTM)，其深刻地影响与其治疗应用相关的蛋白质特性。另一个这样的实例包括在生产双特异性抗体期间可能存在的同源二聚体污染物，其理想地必须通过下游纯化去除。这些杂质与产品相比可以表现出不同的作用模式和潜在的毒性或免疫原性。另外，它们的稳定性可能低于产品，这给聚集和免疫原性带来较高的风险。尽管最近取得了进展，但开发用于定量评估此类杂质的纯度测定方法的挑战仍然存在。另外，双特异性抗体的分析方法开发中的关键挑战可在于所述方法必须准确地且可重复地检测相对于主要所需物质以2％或更低水平存在的杂质。因此，在药物开发和生产的不同阶段期间监测和表征此类杂质是重要的。尽管杂质对生物功能很重要，但由于缺乏合适的方法，它们的大规模研究一直受到阻碍。

纯度测定的分析方法必须显示出足够的准确度和分辨率(resolution)以检测和定量所需的产品和其杂质。由于杂质(如抗体中的PTM和双特异性抗体中的同源二聚体)的结构和物理化学特性与所需产品之间的相似性，对此类杂质的评估可能很困难。对此类杂质的直接分析需要分离出足够大量的所需产品以进行测定，这是不可取的，而且只有在选定的情况下才有可能。

因此，本领域长期以来需要一种用于鉴定和定量基于蛋白质的生物制药中的蛋白质—杂质和/或所需产品的方法和/或系统。

发明内容

基于蛋白质的生物制药产品的开发、制造和销售的增长导致了对用于鉴定和定量产品中的杂质的方法和/或系统的需求日益增加。

本文公开的实施方案通过提供用于蛋白质的快速表征的方法和系统来满足前述需求。

本公开至少部分地提供一种用于定量样品中的杂质的方法。

在一个示例性实施方案中，所述方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含杂质的洗脱液，以及使用质谱仪定量洗脱液中的杂质的量。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使所述样品接触具有带有疏水性相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使所述样品接触具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使约10μg到约100μg的样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含杂质的洗脱液。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使用可与质谱仪相容的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于定量样品中的杂质的方法可包括使用流速为0.2ml/min到0.4ml/min的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是产品相关杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是工艺相关杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是蛋白质的降解产物。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是蛋白质的消化产物。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是多特异性抗体产品的同源二聚体类物质。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是蛋白质的翻译后修饰物。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使用质谱仪定量所述洗脱液中的杂质的量，其中质谱仪可以是串联质谱仪。

在此实施方案的一个方面中，用于定量杂质的方法可包括使用质谱仪定量所述洗脱液中的杂质的量，其中质谱仪可以是原生(native)质谱仪。

本公开至少部分地提供了一种用于检测样品中的杂质的方法。

在一个示例性实施方案中，所述方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含杂质的洗脱液，以及使用质谱仪定量洗脱液中的杂质的量。

在此实施方案的一个方面中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使所述样品接触具有带有疏水性相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使所述样品接触具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使约10μg到约100μg的样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含杂质的洗脱液。

在此实施方案的一个方面中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使用可与质谱仪相容的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在一些具体的示例性实施方案中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合。

在一些具体的示例性实施方案中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于检测样品中的杂质的方法可包括使用流速为0.2ml/min到0.4ml/min的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是产品相关杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是与工艺相关杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是蛋白质的降解产物。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是蛋白质的消化产物。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是多特异性抗体产品的同源二聚体类物质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中杂质可以是蛋白质的翻译后修饰物。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使用质谱仪检测洗脱液中的杂质的量，其中质谱仪可以是串联质谱仪。

在此实施方案的一个方面中，用于检测杂质的方法可包括使用质谱仪检测所述洗脱液中的杂质的量，其中质谱仪可以是原生质谱仪。

本公开至少部分地提供一种用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法。

在一个示例性实施方案中，所述方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含目标蛋白的洗脱液，以及使用质谱仪检测和/或定量洗脱液中的目标蛋白的量。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使所述样品接触具有带有疏水性相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使所述样品接触具有带有电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使约10μg到约100μg的样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含杂质的洗脱液。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使用可与质谱仪相容的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。在具体方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂，其中流动相可选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合。在另一具体方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量样品中的目标蛋白的方法可包括使用流速为0.2ml/min到0.4ml/min的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是抗体。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是双特异性抗体。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是治疗蛋白质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是制造蛋白质的生物制药工艺的工艺相关杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是制造蛋白质的生物制药工艺的产品相关杂质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是蛋白质的降解产物。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是蛋白质的消化产物。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使样品接触具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱系统，其中目标蛋白可以是多特异性抗体产品的同源二聚体类物质。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使用质谱仪定量所述洗脱液中的目标蛋白的量，其中质谱仪可以是串联质谱仪。

在此实施方案的一个方面中，用于检测和/或定量目标蛋白的方法可包括使用质谱仪定量所述洗脱液中的目标蛋白的量，其中质谱仪可以是原生质谱仪。

在一个示例性实施方案中，本公开至少部分地提供混合模式色谱系统，其包括具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，和质谱仪。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括带疏水性相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括带电荷-电荷相互作用功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂，其可用于洗脱约10μg到约100μg的样品。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括能够接受流动相的混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括进一步能够接受具有目标蛋白的样品的混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括能够用流动相洗涤的混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括耦接到具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱的质谱仪。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括串联质谱仪。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括原生光谱仪。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中混合模式尺寸排阻色谱树脂可与选自乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合的流动相相容。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中可使用含有高达600mM总盐浓度的流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂。

在此实施方案的一个方面中，混合模式色谱系统可包括具有带有附加功能的混合模式尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中色谱柱可用流速为0.2ml/min到0.4ml/min的流动相洗涤。

附图说明

图1示出使用尺寸排阻色谱或离子交换色谱法定量和/或检测蛋白质所采用的系统的实例。

图2表示使用示例性实施方案从同源二聚体类物质中纯化双特异性抗体的尝试。

图3示出Hofmeister系列，其示出阴离子和阳离子对蛋白质沉淀(或促进疏水相互作用)的影响。

图4示出根据示例性实施方案的混合模式尺寸排阻色谱质谱系统。

图5示出在范围介于30mM到300mM的流动相浓度下执行的BEH200 SEC柱上的样品混合物中的八种mAb的保留时间的曲线图，其中两个插图表示根据示例性实施方案的在相应浓度下对八种mAb进行的MM-SEC-MS分析的基峰色谱图(BPC)。

图6示出使用示例性混合模式尺寸色谱质谱系统的双特异性抗体样品的色谱图，所述系统使用流动相：150mM总盐浓度和450mM总盐浓度。

图7示出根据示例性实施方案的使用混合模式尺寸排阻色谱质谱分离和分析的双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的提取离子色谱图(XIC)和原生质谱。

图8示出根据示例性实施方案的抗体检测光谱法的Lumos上的RP LC-MS、EMR上的SEC-MS和EMR上的MM-SEC-MS的总离子色谱(TIC)和原生MS谱的比较。

图9示出根据示例性实施方案的使用Zenix SEC-300，3μm，

图10示出根据示例性实施方案的通过在双特异性抗体产品中执行同源二聚体类物质的检测而获得的提取离子色谱图(XIC)。

图11示出根据示例性实施方案的通过使用Zenix SEC-300，3μm，

图12示出根据示例性实施方案的通过使用具有不同盐浓度的流动相在对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基化混合物执行MM-SEC-MS分析而获得的提取离子色谱图(XIC)。

图13示出根据示例性实施方案的在执行MM-SEC-MS分析时双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基化混合物的蛋白质保留时间(分钟)与流动相的总盐浓度的关系的图表。

图14表示根据示例性实施方案的在执行MM-SEC-MS分析时基于改变的总盐浓度的保留时间的趋势的图。

图15表示示出根据示例性实施方案的在执行MM-SEC-MS分析时基于改变的总盐浓度的保留时间的差异的趋势的图表。

图16示出了根据示例性实施方案的在Waters BEH SEC柱上对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基化混合物进行MM-SEC-MS分析时所获得的提取离子色谱图(XIC)。

图17示出根据示例性实施方案的在Waters BEH SEC柱上执行MM-SEC-MS分析时双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基化混合物的蛋白质保留时间(分钟)与流动相的总盐浓度的关系的图表。

图18示出根据示例性实施方案的在Waters BEH SEC柱上对抗体和其氧化变体进行MM-SEC-MS分析所获得的提取离子色谱图(XIC)。

图19示出根据示例性实施方案的在Waters BEH SEC柱上执行MM-SEC-MS分析时抗体和其氧化变体的蛋白质保留时间(分钟)与流动相的总盐浓度的关系的图表。

图20示出根据示例性实施方案的含有双特异性抗体和其同源二聚体类物质的混合物的样品制备方法。

图21示出根据示例性实施方案的使用具有300mM盐浓度的流动相在完整的双特异性抗体和其同源二聚体类物质的水平下对混合物进行的MM-SEC-MS分析。

图22示出根据示例性实施方案的使用具有70mM盐浓度的流动相在亚单位的双特异性抗体和其同源二聚体类物质的水平下对混合物进行的MM-SEC-MS分析。

图23示出根据示例性实施方案的来自完整水平的双特异性抗体和其同源二聚体类物质的MM-SEC-MS分析的同源二聚体定量结果。

图24示出根据示例性实施方案的来自亚单位水平的双特异性抗体和其同源二聚体类物质的MM-SEC-MS分析的同源二聚体定量结果。

图25示出通过根据示例性实施方案实施的在BEH柱(左)或Zenix柱(右)上的MM-SEC-MS对双特异性抗体混合物[四种不同bsAb/H2L2同源二聚体/H*2L2同源二聚体混合物]的分析，其中每个BPC迹线均表示使用所指示的流动相盐浓度的一个单独分析。

图26示出针对根据示例性实施方案实施的分析分别使用0.01％和0.1％加标标准品对bsAb2(左图)和bsAb4(右图)中的同源二聚体杂质进行的MM-SEC-MS检测研究的极限，其中原生MS谱(a、b、c、d、e和f)在相应的TIC区域上被平均化，且示出了两个最丰富的电荷状态。

图27示出使用以连续稀释的已知比率掺入到bsAb2中的同源二聚体根据示例性实施方案实施的定量研究(左图上的灰色线和标记值)，还示出了基于原始质谱中的四种最丰富电荷状态的XIC强度的H2L2同源二聚体(红色)和H*2L2同源二聚体(蓝色)与bsAb2的比率测量值(作为右图上示出的实例，每种同源二聚体的相对丰度为0.1％)。

具体实施方式

生物制药中的杂质可能会引起可潜在地影响所需产品的功效、清除率、安全性和免疫原性的变化。举例来说，甲硫氨酸和色氨酸侧链的氧化可影响抗体与Fc受体和抗原的结合(Bertolotti-Ciarlet等人Mol.Immunol.(2009)46:1878–1882；Pan等人Protein Sci.(2009)18:424–433；Wei等人Anal.Chem.(2007)79:2797–2805；以及Wang等人Mol.Immunol.(2011)48:860–866)。

传统的基于分离的抗体纯度测定，例如电泳和基于高效液相色谱(HPLC)的方法缺乏将这些杂质与所需产品区分所需的分辨率。通过将反相液相色谱(RPLC)与质谱耦接用于监测PTM来进行肽图谱分析具有一些局限性，因为RP-LC-MS的样品制备工艺是冗长的，且在一些情况下，诸如高温、有机溶剂和酸性pH的色谱条件可诱导氧化假象。

另外，一些尺寸排阻色谱或离子交换色谱方法也可用于将杂质与所需产品分离。可使用质谱仪进一步分析分离的杂质和所需产品。然而，来自尺寸排阻色谱或离子交换色谱柱的流动相不能被直接地注射到质谱仪中且需要包括改变流动相在内的附加步骤(参见图1)。

考虑到现有方法的局限性，如本文所公开，开发出了使用新型混合模式尺寸排阻色谱-质谱系统鉴定和定量杂质的有效且高效率的方法。混合模式尺寸排阻色谱-质谱系统由于高效率的混合模式分离和灵敏的在线MS检测而提高了定量以极低水平存在的杂质的灵敏度和能力，这是不能通过其它典型测定来实现的。

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的一般技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可在实践或测试中使用与本文所描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在描述了特定的方法和材料。提到的所有出版物在此以引入的方式并入。

术语“一个/种”应该被理解意指“至少一个/种”；术语“约”和“近似”应理解为允许如本领域的普通技术人员所理解的标准偏差；且在提供范围时，端点也被包括在内。

生物制药产品需要显示出高水平的效能、纯度和低水平的结构异质性。结构异质性往往影响药物的生物活性和功效。因此，表征和定量治疗蛋白和/或杂质在药物开发中是重要的。蛋白质中的结构异质性可能由翻译后修饰以及制造和储存条件期间的固有化学修饰引起。对于生物技术行业中产生的蛋白质，互补分离技术对于纯化目标蛋白以及对于给出最终产品的质量的准确描写(accurate picture)都是必要的。产品的复杂性消除了简单的一维分离策略的使用。因此，需要检测和/或定量治疗蛋白和/或杂质的准确且高效率的方法。

在一些示例性实施方案中，本公开提供了用于定量和/或检测样品中的蛋白质和/或杂质的方法。

如本文所用，术语“蛋白质”包括具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一种或多种氨基酸聚合物链，在本领域中一般被称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体和它们的通过肽键连接的合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体和它们的合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。举例来说，可使用自动多肽合成器合成合成肽或多肽。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可含有一种或多种多肽以形成单一的功能生物分子。蛋白质可包括生物治疗蛋白、在研究或治疗中使用的重组蛋白、陷阱蛋白和其它嵌合受体Fc-融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人类抗体和双特异性抗体中的任一种。在另一示例性方面中，蛋白质可包括抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统，例如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母属(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和像CHO-K1细胞之类的CHO衍生物)来生产。对于讨论生物治疗蛋白和其生产的最新综述，参见Ghaderi等人,"Production platforms for biotherapeuticglycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-human sialylation,"(Biotechnol.Genet.Eng.Rev.(2012)147-75)。在一些实施方案中，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。那些修饰、加合物和部分包括例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、多组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记和其它染料等。蛋白质可以基于组合物和溶解度来分类并且可因此包括简单的蛋白质，例如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合的蛋白，例如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白质，例如初级衍生蛋白和二级衍生蛋白。

在一些示例性实施方案中，蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或其组合。

如本文所用的术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或V

如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv抗体、dAb片段、Fd’片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及由抗体片段形成的三重抗体、四重抗体、线性抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白质是其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接的重组单链多肽分子。在一些示例性实施方案中，抗体片段含有母体抗体的足够的氨基酸序列，其是与亲本抗体结合至相同抗原的片段。在一些示例性实施方案中，片段以与亲本抗体可比的亲和力结合至抗原，以及/或者与亲本抗体竞争着结合至抗原。抗体片段可通过任何方法产生。举例来说，抗体片段可通过完整抗体的片段化以酶促或化学方式产生，以及/或者它可由编码部分抗体序列的基因以重组方式产生。替代地或另外地，抗体片段可全部或部分地以合成方式产生。抗体片段可任选地包含单链抗体片段。替代地或另外地，抗体片段可包含例如通过二硫连键连接在一起的多条链。抗体片段可任选地包含多分子复合物。功能抗体片段通常包含至少约50个氨基酸，且更通常包含至少约200个氨基酸。

短语“双特异性抗体”包括能够选择性地结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体一般包含两个不同的重链，其中每条重链特异性地结合两种不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，在同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够选择性地结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，那么第一重链对第一表位的亲和力一般将比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个到两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可在相同或不同的靶上(例如，在相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可例如通过组合识别相同抗原的不同表位的重链来制成。举例来说，可使编码识别相同抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，且可使此类序列在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型的双特异性抗体具有两条重链，每条重链具有三个重链CDR，其后是C

治疗性双特异性抗体(bsAb)可同时结合至两个不同的靶标且有望通过提供双重功能或新作用机制来实现增强的治疗功效(Marie Godar等人,Therapeutic bispecificantibody formats:a patent applications review(1994-2017),28 EXPERT OPINION ONTHERAPEUTIC PATENTS 251–276(2018))。迄今为止，已开发出且评估了超过60种双特异性分子来治疗各种疾病，其中的许多由于其在治疗应用中的已知优点(稳定性、血清半衰期等)而采用IgG样架构(Christoph Spiess,Qianting Zhai&Paul J.Carter,Alternativemolecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies,67MOLECULAR IMMUNOLOGY 95–106(2015)；M X Sliwkowski&I Mellman,Antibodytherapeutics in cancer.,341 SCIENCE 1192–1198(2013)；Paul J.Carter,Potentantibody therapeutics by design,6 NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY 343–357(2006))。双特异性抗体经常通过共表达不同的轻链和重链来在单细胞中产生。随后，bsAb构建体的组装需要同源轻链和重链的正确配对，以及两种不同半分子的异源二聚化。不幸的是，此工艺还可能导致形成错误组装的分子构建体，例如单特异性分子(例如，同源二聚体类物质)。与其它杂质不同，通过下游纯化去除同源二聚体类物质可能具有挑战性，因为它们往往对预期的bsAb产品展现出高度相似的物理化学特性。为了提高多肽链配对的保真度且因此有利于形成bsAb，近年来已经开发了各种策略(Shixue Chen等人,Immunoglobulin Gamma-LikeTherapeutic Bispecific Antibody Formats for Tumor Therapy,2019JOURNAL OFIMMUNOLOGY RESEARCH 1–13(2019))。举例来说，针对bsAb的每个抗原结合臂使用同一的轻链已经特别成功地避免了轻链与重链之间的错配(A.Margaret Merchant等人,Anefficient route to human bispecific IgG,16 NATURE BIOTECHNOLOGY677–681(1998))。此外，不同重链的异源二聚化可以通过旋钮孔(John B.b.Ridgway,LeonardG.Presta&Paul Carter,‘Knobs-into-holes’engineering of antibody CH3 domainsfor heavy chain heterodimerization,9"PROTEIN ENGINEERING,DESIGN ANDSELECTION"617–621(1996))设计得到极大的促进，在旋钮孔设计中，特异性突变被工程化为抗体的Fc部分以利于形成异源二聚体。替代地，通过在Fc部分中经由氨基酸取代调节蛋白质A结合亲和力，也可在蛋白质A纯化步骤期间有效地从同源二聚体杂质中分离出bsAb(Adam Zwolak等人,Rapid Purification of Human Bispecific Antibodies viaSelective Modulation of Protein A Binding,7 SCIENTIFIC REPORTS 15521(2017))。此策略已被成功地实施，以实现bsAb的大规模生产，以支持临床研究(Andrew D.Tustian等人,Development of purification processes for fully human bispecificantibodies based upon modification of protein A binding avidity,8 MABS 828–838(2016))。

通过蛋白质工程化和工艺开发在新型bsAb格式上取得的进展已经使得能够大规模生产具有高纯度的治疗性bsAb。然而，bsAb药物产品中仍然可能存在低丰度的同源二聚体杂质，并且需要在开发和释放测试期间对所述低丰度的同源二聚体杂质的存在进行常规监测。同源二聚体抗体被视为产品相关杂质，可在许多特性方面与所需bsAb高度相似，这使得它们的检测和定量成为当前分析技术的一项独特且具有挑战性的任务。由于同源二聚体类物质与对应bsAb相比通常展现出不同的分子量，因此使用基于LC-MS的技术在完整蛋白质水平下进行质量测量是表征它们的首选方法(R.Jeremy Woods等人,LC-MScharacterization and purity assessment of a prototype bispecific antibody,5MABS 711–722(2013)；Wolfgang Schaefer等人,Heavy and light chain pairing ofbivalent quadroma and knobs-into-holes antibodies analyzed by UHR-ESI-QTOFmass spectrometry,8 MABS 49–55(2015)；Frank D.Macchi等人,Absolute Quantitationof Intact Recombinant Antibody Product Variants Using Mass Spectrometry,87ANALYTICAL CHEMISTRY 10475–10482(2015)；Luis Schachner等人,Characterization ofChain Pairing Variants of Bispecific IgG Expressed in a Single Host Cell byHigh-Resolution Native and Denaturing Mass Spectrometry,88 ANALYTICALCHEMISTRY 12122–12127(2016)；Yiyuan Yin等人,Precise quantification of mixturesof bispecific IgG produced in single host cells by liquid chromatography-Orbitrap high-resolution mass spectrometry,8 MABS 1467–1476(2016)；ChunleiWang等人,A systematic approach for analysis and characterization ofmispairing in bispecific antibodies with asymmetric architecture,10MABS 1226–1235(2018)；Markus Haberger等人,Rapid characterization of biotherapeuticproteins by size-exclusion chromatography coupled to native massspectrometry,8 MABS 331–339(2015)；

迄今为止，关于依靠色谱分离来检测和定量bsAb样品中的同源二聚体类物质的分析方法的报告有限。举例来说，疏水相互作用色谱(HIC)(Wang等人,2018,同上)或离子交换色谱(IEX)(A.F.Labrijn等人,Efficient generation of stable bispecific IgG1 bycontrolled Fab-arm exchange,110 PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OFSCIENCES 5145–5150(2013)；Michael J Gramer等人,Production of stable bispecificIgG1 by controlled Fab-arm exchange,5 MABS 962–973(2013))已被证明能在bsAb与其同源二聚体分别在疏水性或等电点(pI)方面展现出足够不同的值时将所述bsAb与其同源二聚体分离。此外，在线IEX原生MS技术的最新进展(Yuetian Yan等人,UltrasensitiveCharacterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal AntibodiesUsing Strong Cation Exchange Chromatography Coupled to Native MassSpectrometry,90 ANALYTICAL CHEMISTRY 13013–13020(2018)；Florian Füssl等人,Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pHGradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native MassSpectrometry,90 ANALYTICAL CHEMISTRY 4669–4676(2018)；Aaron O.Bailey等人,Charge variant native mass spectrometry benefits mass precision and dynamicrange of monoclonal antibody intact mass analysis,10 MABS 1214–1225(2018))为敏感地检测bsAb中的低水平同源二聚体类物质提供了一种有效的途径。然而，由于高分辨率，IEX通常基于每个抗体的电荷异质性为其生成复杂的电荷分布，这些电荷分布可能会彼此重叠。此外，使用这种途径进行基于MS的定量可能会很复杂，因为需要将来自每个分子的所有分离的电荷变体形式求和以进行计算。另外，与基于RPLC的途径类似，IEX方法利用梯度洗脱，由于在不同溶剂条件(例如pH或盐浓度)下洗脱的抗体的电离效率不同，梯度洗脱可能会损害基于MS的定量。最近，通过流体动力学体积以及与柱基质的疏水相互作用分离分析物的基于SEC的混合模式色谱(MM-SEC)方法已应用于研究抗体异质性(Xiaoyu Yang等人,Analysis and purification of IgG4 bispecific antibodies by a mixed-modechromatography,484 ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 173–179(2015)；Cintyu Wong,CamilleStrachan-Mills&Sudhir Burman,Facile method of quantification for oxidizedtryptophan degradants of monoclonal antibody by mixed mode ultra performanceliquid chromatography,1270 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A 153–161(2012)；JorgeAlexander Pavon等人,Analysis of monoclonal antibody oxidation by simple mixedmode chromatography,1431 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A 154–165(2016))。与UV或荧光检测耦接，MM-SEC方法成功地应用于bsAb样品中的同源二聚体类物质的相对定量(Yang等人,2015,同上)。然而，很明显，这种方法的实用性可能局限于同源二聚体和bsAb类物质在疏水性方面足够不同从而使得可以实现基于UV或荧光的定量的基线分离的情况。此外，由于对同源二聚体类物质的鉴定仅基于保留时间与标准品的比对，因此如果它们与bsAb分子的寡聚或截短形式共洗脱，那么总是存在相对丰度过高估计的风险。

使用SEC柱的混合模式色谱法的概念源自蛋白质分析物与柱基质之间的不想要的二级相互作用。理想情况下，SEC应该仅基于其流体动力学体积来分离蛋白质分析物。在实践中，静电、疏水和氢键结相互作用都可在不同程度上促成蛋白质的保留和分离，这取决于柱基质、缓冲液条件和蛋白质特性(Alexandre Goyon等人,Unraveling the mysteries ofmodern size exclusion chromatography-the way to achieve confidentcharacterization of therapeutic proteins,1092 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B368–378(2018)；Tsutomu Arakawa等人,The critical role of mobile phasecomposition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals,99JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 1674–1692(2010))。通过适当优化色谱条件在SEC分离期间利用这些二级相互作用提供了改善具有相似流体动力学体积但具有不同表面特性(例如电荷和疏水性)的抗体分离的机会。通过使用与MS相容的流动相，混合模式SEC与原生SEC检测(MM-SEC-MS)的在线耦接与基于UV的方法相比可具有许多优点，包括通过精确的质量测量明确识别同源二聚体类物质，来自共洗脱物质的干扰最小，对色谱分辨率的要求不太严格(Terral等人,2016,同上；Goyon等人,2017,同上)。

如本文所用，“多特异性抗体”或“Mab”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。尽管此类分子通常将仅结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但具有附加特异性的抗体(例如三特异性抗体和KIH三特异性抗体)也可通过本文公开的系统和方法来解决。

如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可通过本领域可获得的或已知的任何方式衍生自包括任何真核、原核或噬菌体克隆在内的单个克隆。可以使用包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合在内的本领域已知的多种多样的技术来制备可用于本公开的单克隆抗体。

在生物药物生产的许多阶段，可能形成杂质。生物技术来源的杂质可能很难表征和定量，因为它们往往以较低水平存在，且因为它们可能代表非常复杂的物质或物质混合物。获得杂质峰的真实参考标准也可能非常困难。但是，充分表征痕量的杂质蛋白质将成为耗时、冗长且往往非常昂贵的过程。杂质往往可包括变体、同种型、降解产物、产品相关杂质、工艺相关、微小翻译后修饰物、聚集物，或完整重组蛋白质的剪切片段。存在几乎无限多的可能杂质，其中大部分(但不是全部)可能是已知的。

如本文所用，术语“目标蛋白”可包括所需产品或杂质或两者。

如本文所用，术语“所需产品”是指具有所需结构、功能或功效特征的蛋白质。

如本文所用，术语“杂质”可包括生物制药产品中存在的任何不合需要的蛋白质。杂质可包括工艺相关杂质和产品相关杂质。杂质可进一步具有已知的结构、被部分表征或未被鉴定。工艺相关杂质可源自制造工艺，且可包括三个主要类别：细胞基质来源的杂质、细胞培养物来源的杂质和下游来源的杂质。细胞基质来源的杂质包括但不限于来源于宿主生物的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物来源的杂质包括但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它培养基成分。下游来源的杂质包括但不限于酶、化学和生化处理剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可滤取物(leachable)。产品相关杂质(例如，前体、某些降解产物)可能是在制造和/或存储期间产生的分子变体，其在活性、功效和安全性方面不具有与所需产品可比的特性。此类变体可能需要相当大的努力来分离和表征，以便确定一种或多种修饰的类型。产品相关杂质可包括截短形式、经修饰形式和聚集物。截短形式由催化肽键断裂的水解酶或化学物质形成。经修饰形式包括但不限于脱酰胺化、异构化、错配的S-S连接、氧化或改变的缀合形式(例如，糖基化、磷酸化)。经修饰形式还可包括任何翻译后修饰形式。聚集物包括所需产品的二聚体和更高倍数。(Q6B规范：《生物技术/生物产品的测试程序和验收标准(Test Procedures and Acceptance Criteria forBiotechnological/Biological Products)》，ICH，1999年8月，美国卫生与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Humans Services))。

如本文所用，通用术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间经历的共价修饰(共翻译修饰)或者肽在其核糖体合成之后经历的共价修饰(翻译后修饰)。PTM一般通过特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质主链内的特定特征性蛋白质序列(签名序列)的位点处。已记录了数百个PTM，且这些修饰总是影响蛋白质的结构或功能的一些方面(Walsh,G.“Proteins”(2014)second edition,published by Wiley and Sons,Ltd.,ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包括但不限于断裂、N末端扩展、蛋白质降解、N末端酰化、生物素化(用生物素酰化赖氨酸残基)、C末端酰胺化、糖基化、碘化、辅基共价连接、乙酰化(通常在蛋白质的N末端处添加乙酰基)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基(例如，甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷酰化、ADP核糖基化、多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、戊烯基化(prenylation)、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K是谷氨酸残基羧基化的辅因子，从而引起γ-羧基谷氨酸(glu残基)的形成)、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价连键)、甘氨酰化(glycylation)(甘氨酸残基的共价连键)、糖基化(向天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸中添加糖基，从而产生糖蛋白)、异戊烯基化(isoprenylation)(添加类异戊烯基团(isoprenoid)，如法尼醇(farnesol)和香叶基香叶醇(geranylgeraniol))、硫辛酰化(lipoylation)(硫辛酸根官能团的连接)、磷酸泛酰巯基乙胺基化(从辅酶a中添加4′-磷酸泛酰巯基乙胺基部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中添加)、磷酸化(添加磷酸根基团，通常添加到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸中)和硫酸化(添加硫酸根基团，通常添加到酪氨酸残基中)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包括但不限于瓜氨酸化(通过脱亚胺基化作用将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺化(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包括但不限于形成二硫桥(两个半胱氨酸氨基酸的共价连键)和蛋白水解性断裂(肽键处的蛋白质断裂)。某些翻译后修饰涉及添加其它蛋白质或肽，如ISG化(与ISG15蛋白质(干扰素刺激的基因)的共价连键)、SUMO化(与SUMO蛋白质(与泛素相关的小分子修饰剂)的共价连键)和泛素化(与蛋白质泛素的共价连键)。关于由UniProt策划的PTM的更详细的受控词汇，请参见http://www.uniprot.org/docs/ptmlist。

如本文所用，术语“色谱”是指其中由液体或气体携带的化学混合物由于该化学实体在静止的液相或固相周围或上方流动时的差异分布而被分离成组分的工艺。

如本文所用，术语“混合模式色谱”或“多模式色谱”包括其中溶质通过超过一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱方法。MMC可用作传统反相(RP)色谱、离子交换(IEX)色谱和正相(NP)色谱的替代或补充工具。不同于其中疏水相互作用、亲水相互作用和离子相互作用分别为占主导的相互作用模式的RP、NP和IEX色谱，混合模式色谱可采用这些相互作用模式中的两种或更多种的组合。混合模式色谱介质可提供无法通过单一模式色谱重现的独特选择性。与基于亲和力的方法相比，混合模式色谱还可提供潜在的成本节约和操作灵活性。

短语“尺寸排阻色谱”或“SEC”或“凝胶过滤”包括可根据分子在溶液中的尺寸对分子进行分类的液相柱色谱技术。

如本文所用，术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”在本文中可互换使用并且可包括SEC中使用的任何种类的固相，其将杂质与所需产品(例如，双特异性抗体产品的同源二聚体污染物)分离。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径，以及动态容量和流速可取决于几个参数，例如待处理的流体体积、待经受本发明的工艺的流体中的蛋白质的浓度等。每个步骤的这些参数的确定完全在本领域技术人员的平均技能范围内。

如本文所用，术语“混合模式尺寸排阻色谱”或“MM-SEC”可包括通过除基于蛋白质的尺寸的分离以外的附加相互作用分离蛋白质的任何色谱方法。附加相互作用或二级相互作用可利用以下机制中的一种或多种：阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、亲水相互作用、电荷-电荷相互作用、氢键合、π-π键合和金属亲和力。混合模式尺寸排阻色谱树脂可以指用于MM-SEC分离的任何类型的固相。非限制性实例是Sepax Zenix SEC-300、WatersBEH 300或Agilent Bio SEC-3。

如本文所用，术语“疏水性功能”是指蛋白质与SEC色谱树脂的作为二级相互作用的疏水相互作用。疏水性功能还可显著影响峰形，这可能对所述工艺的分辨能力具有明显的影响。疏水相互作用在高离子强度的流动相下最强。为了选择用于在树脂中纳入疏水功能的流动相，可将各种离子根据它们是促进疏水相互作用(盐析效应)，还是破坏水的结构(离液效应)并导致疏水相互作用的减弱(如图3所示)来排列成所谓的疏溶剂(soluphobic)系列。阳离子在增加盐析效应方面被排序为Ba

如本文所用，术语“质谱仪”包括能够检测特定分子物质且测量其准确质量的设备。该术语旨在包括多肽或肽可被洗脱到其中用于检测和/或表征的任何分子检测器。质谱仪可包括三个主要部分：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是创建气相离子。分析物原子、分子或团簇可被转移到气相中并同时被电离(如在电喷雾电离中)。离子源的选择在很大程度上取决于应用。

如本文所用，术语“质量分析仪”包括可根据物质的质量来分离物质(即原子、分子或团簇)的设备。可用于快速蛋白质测序的质量分析仪的非限制性实例是飞行时间(time-of-flight；TOF)、扇形磁场(Magnetic sector)/扇形电场(electric sector)、四极质量过滤器(Q)、四极离子阱(quadrupole ion trap；QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance；FTICR)以及加速器质谱技术(accelerator mass spectrometry；AMS)。

如本文所用，术语“串联质谱法”包括通过使用多个阶段的质量选择和质量分离获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可被转移到气相中并被完整电离，且在第一质量选择步骤之后，它们可以被诱导以一些可预测且可控制的方式分裂。多阶段MS/MS或MS

在一些示例性实施方案中，质谱分析可在原生条件下执行。

如本文所用，术语“原生条件”或“原生MS”或“原生ESI-MS”可包括在保留分析物中的非共价相互作用的条件下执行质谱分析。关于原生MS的详细综述，请参考综述：Elisabetta Boeri Erba&Carlo Petosa,The emerging role of native massspectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecularcomplexes,24 PROTEIN SCIENCE 1176–1192(2015)。原生ESI和常规ESI之间的一些区别示于表1中(Hao Zhang等人,Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein complexes,587 FEBS Letters 1012–1020(2013))。

表1.

本文公开的实施方案提供了用于快速表征样品中的蛋白质的组合物、方法和系统。

如本文所用，术语“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”意指非限制性的，且被理解为分别意指“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”。

本公开提供了用于检测或定量样品中的杂质的方法，其包括使样品与具有混合模式色谱树脂的色谱系统接触；使用流动相洗涤混合模式尺寸排阻色谱树脂以提供包含杂质的洗脱液；以及使用质谱仪检测洗脱液中的杂质。

本公开提供了用于检测或定量样品中的目标蛋白的方法，其包含使样品与具有混合模式色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤混合模式色谱树脂以提供包含目标蛋白的洗脱液，以及使用质谱仪检测或定量洗脱液中的目标蛋白。

在一些具体的示例性实施方案中，色谱系统可包括带有附加相互作用的尺寸排阻色谱树脂。

在一些具体的示例性实施方案中，色谱系统可包括具有疏水性相互作用功能的尺寸排阻色谱树脂。

在一些具体的示例性实施方案中，色谱系统可包括具有电荷-电荷相互作用功能的尺寸排阻色谱树脂。

在一些示例性实施方案中，用于检测或定量样品中的杂质的方法可包括杂质，所述杂质可包括至少一种不合需要的蛋白质。一种或多种杂质可具有已知结构，或被部分表征或未被鉴定。

在一些示例性实施方案中，杂质可以是产品相关杂质。产品相关杂质可以是分子变体、前体、降解产物、片段化蛋白质、消化产物、聚集物、翻译后修饰形式，或其组合。

在一些具体的示例性实施方案中，杂质可以是工艺相关杂质。工艺相关杂质可包括源自制造工艺的杂质，即核酸和宿主细胞蛋白质、抗生素、血清、其它培养基成分、酶、化学和生物化学处理剂、无机盐、溶剂、载体、配体和制造工艺中使用的其它可滤取物。

在一些示例性实施方案中，杂质可以是pI在约4.5到约9.0的范围中的蛋白质。在一个方面，杂质可以是pI为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的蛋白质。

在一些示例性实施方案中，杂质可以是同源二聚体类物质。在一个方面，杂质可以是同源二聚体类物质，其可以在产生双特异性抗体期间形成。在另一方面，样品中的杂质的数量可以是至少两种。

在一些示例性实施方案中，装载在色谱系统上的样品的量可在从约10μg到约100μg的范围内。在一个示例性实施方案中，装载在色谱系统上的样品的量可以是约10μg、约12.5μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg。

在一些示例性实施方案中，用于洗脱杂质的流动相可以是可与质谱仪相容的流动相。

在一些具体的示例性实施方案中，流动相可以是乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合。在一个方面，流动相的总浓度可以在高达约600mM的范围内。在一个具体方面，流动相的总浓度可以是约5mM、约6mM、7mM、约8mM、9mM、约10mM、12.5mM、约15mM、17.5mM、约20mM、25mM、约30mM、35mM、约40mM、45mM、约50mM、55mM、约60mM、65mM、约70mM、75mM、约80mM、75mM、约95mM、100mM、约1100mM、120mM、约130mM、140mM、约150mM、160mM、约170mM、180mM、约190mM、200mM、约225mM、250mM、约275mM、300mM、约325mM、350mM、约375mM、400mM、约425mM、450mM、约475mM、500mM、约525mM、550mM、约575mM或约600mM。

在一些示例性实施方案中，流动相可具有约0.1ml/min到约0.4ml/min的流速。在一个示例性实施方案中，流动相的流速可以是约0.1ml/min、约0.15ml/min、约0.20ml/min、约0.25ml/min、约0.30ml/min、约0.35ml/min或约0.4ml/min。

在一些示例性实施方案中，用于检测或定量杂质的方法可包括使用质谱仪检测或定量洗脱液中的杂质。在一个方面，质谱仪可以是串联质谱仪。在另一方面，质谱仪可包括纳米喷雾器(nano-spray)。

在一些示例性实施方案中，洗脱液可包含目标蛋白外加杂质。在一个方面，目标蛋白可包括抗体、双特异性抗体、抗体片段或多特异性抗体。在具体的方面，目标蛋白可以是单克隆抗体。在具体的方面，目标蛋白可以是治疗性抗体。在具体的方面，目标蛋白可以是免疫球蛋白。在另一个具体的方面，免疫球蛋白可以是IgG1。在又一个具体的方面，免疫球蛋白可以是IgG4。在一个方面，目标蛋白可以是双特异性抗体。在具体的方面，双特异性抗体可以是抗CD20/CD3单克隆抗体。在一个方面，目标蛋白可以是使用小鼠成纤维细胞系MG87产生的抗体。在一个方面，目标蛋白可以是在抗体消化时形成的抗体片段。

在一个方面，目标蛋白可以是翻译后修饰蛋白。在具体的方面，翻译后修饰蛋白可通过断裂、N末端扩展、蛋白质降解、N末端酰化、生物素化、C末端酰胺化、氧化、糖基化、碘化、辅基共价连接、乙酰化、烷基化、甲基化、腺苷酰化、ADP-核糖基化、多肽链内或之间的共价交联、磺化、戊烯基化、维生素C依赖性修饰、维生素K依赖性修饰、谷氨酰化、甘氨酰化、糖基化、去糖基化、异戊烯基化、硫辛酰化、磷酸泛酰巯基乙胺基化、磷酸化、硫酸化、瓜氨酸化、脱酰胺化、二硫桥形成、蛋白水解性断裂、ISG化、SUMO化或泛素化(与蛋白质泛素的共价连键)。

在另一方面，目标蛋白可以是蛋白质的降解产物。

在又一方面，目标蛋白可以是在生物制药产品中被发现的杂质。在具体的方面，目标蛋白可以是在生物制药产品制造期间被发现的杂质。

在一个方面，目标蛋白可以是pI在约4.5到约9.0的范围内的蛋白质。

在一个方面，目标蛋白可以是产品相关杂质。产品相关杂质可以是分子变体、前体、降解产物、片段化蛋白质、消化产物、聚集物、翻译后修饰形式，或其组合。

在一个方面，目标蛋白可以是工艺相关杂质。工艺相关杂质可包括源自制造工艺的杂质，即核酸和宿主细胞蛋白质、抗生素、血清、其它培养基成分、酶、化学和生物化学处理剂、无机盐、溶剂、载体、配体和制造工艺中使用的其它可滤取物。

在一个方面，样品中的杂质的数量可以是至少两种。

在一个方面，翻译后修饰蛋白可在蛋白质氧化时形成。

在另一方面，目标蛋白可包括降解产物。

在另一方面，降解产物可包括治疗性蛋白质的翻译后修饰物。

在一些示例性实施方案中，使用流动相洗涤混合模式色谱树脂需要小于约30分钟。在一个方面，使用流动相洗涤混合模式色谱树脂所需的时间可以是约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟或约30分钟。

在一些示例性实施方案中，色谱系统可在不清洗的情况下用于至少约3次样品运行。在一个方面，色谱系统可在不清洗的情况下用于至少约3次样品运行、至少约4次样品运行、至少约5次样品运行、至少约6次样品运行、至少约7次样品运行，或至少约8次样品运行。

应当理解，所述方法不限于前述蛋白质、杂质、柱中的任何一种，且用于检测或定量的方法可通过任何合适的装置(means)来进行。

在一些示例性实施方案中，本公开提供了混合模式色谱系统，其包括能够使用流动相洗涤以提供包含目标蛋白的洗脱液的色谱柱110和耦接到该色谱柱的质谱仪120(如图4中所例示)。在一个方面，色谱柱110能够使用样品装载设备100与样品接触。

在一些示例性实施方案中，可装载在色谱柱110上的样品的量可在从约10μg到约100μg的范围内。在一个方面，可装载在色谱柱110上的样品的量可为约10μg、约12.5μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg，约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg。

在一些示例性实施方案中，色谱柱110能够用流动相洗涤。在一个方面，流动相可以是乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合。在一个方面，可与色谱柱110一起使用的流动相的总浓度可在高达约600mM的范围内。在具体的方面，可与色谱柱110一起使用的流动相的总浓度可以是约5mM、约6mM、7mM、约8mM、9mM、约10mM、12.5mM、约15mM、17.5mM、约20mM、25mM、约30mM、35mM、约40mM、45mM、约50mM、55mM、约60mM、65mM、约70mM、75mM、约80mM、75mM、约95mM、100mM、约1100mM、120mM、约130mM、140mM、约150mM、160mM、约170mM、180mM、约190mM、200mM、约225mM、250mM、约275mM、300mM、约325mM、350mM、约375mM、400mM、约425mM、450mM、约475mM、500mM、约525mM、550mM、约575mM或约600mM。在另一方面，可与色谱柱110一起使用的流动相可具有0.1ml/min到0.4ml/min的流速。在具体的方面，可与色谱柱110一起使用的流动相的流速可为约0.1ml/min、约0.15ml/min、约0.20ml/min、约0.25ml/min、约0.30ml/min、约0.35ml/min或约0.4ml/min。在另一方面，可与色谱柱110一起使用的流动相可用于洗脱杂质。

在一些示例性实施方案中，色谱柱110能够与质谱仪120耦接。在一个方面，质谱仪120可包含纳米喷雾器。

在一些示例性实施方案中，质谱仪120可以是串联质谱仪。

在一些示例性实施方案中，质谱仪120可以是原生质谱仪。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130目标蛋白(参见图4)。在一个方面，混合模式色谱系统可用于检测140和/或定量130一种目标蛋白。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130单克隆抗体。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130治疗性抗体。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130免疫球蛋白。在一个方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130IgG1蛋白。在另一方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130IgG4蛋白。在另一方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130双特异性抗体。在又一方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130抗CD20/CD3单克隆抗体。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130在抗体消化时形成的抗体片段。在一个方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是翻译后修饰蛋白的目标蛋白。在另一方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是蛋白质的降解产物的目标蛋白。在又一方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是在生物制药产品中被发现的杂质的目标蛋白。在另一方面，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是在生物制药产品制造期间被发现的杂质的目标蛋白。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是pI在约4.5到约9.0的范围内的蛋白质的目标蛋白。

在一些示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是产品相关杂质的目标蛋白。产品相关杂质可以是分子变体、前体、降解产物、片段化蛋白质、消化产物、聚集物、翻译后修饰形式，或其组合。

在一些具体的示例性实施方案中，混合模式色谱系统能够检测140和/或定量130可以是工艺相关杂质的目标蛋白。工艺相关杂质可包括源自制造工艺的杂质，即核酸和宿主细胞蛋白质、抗生素、血清、其它培养基成分、酶、化学和生物化学处理剂、无机盐、溶剂、载体、配体和制造工艺中使用的其它可滤取物。在一个方面，样品中的杂质的数量可以是至少两种。

在一些示例性实施方案中，色谱柱110能够在不清洗的情况下用于至少约3次样品运行。在一个方面，色谱柱110可在不清洗的情况下用于至少约3次样品运行、至少约4次样品运行、至少约5次样品运行、至少约6次样品运行、至少约7次样品运行，或至少约8次样品运行。

应理解，所述系统不限于前述蛋白质、杂质、流动相或色谱柱中的任一种。

如本文利用数字和/或字母提供的方法步骤的连续标记并不意在将方法或其任何实施方案限制于特定的指示顺序。

整个说明书中引用了各种出版物，包括专利、专利申请、公布的专利申请、登记号、技术文章和学术文章。这些引用的参考文献中的每一篇均通过引用整体且出于所有目的并入本文。

通过参考以下实施例，可更全面地理解本公开，这些实施例是为了更详细地描述本公开而提供的。它们旨在说明且不应被解释为限制本公开的范围。

实施例

材料。去离子水由安装有MilliPak Express 20过滤器的Milli-Q整体水纯化系统提供。乙酸铵(LC/MS级)、乙酸和碳酸氢铵(LC/MS级)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。肽N-糖苷酶F(PNGase F)购自New England Biolabs Inc(Ipswich,MA)。Invitrogen

样品制备。为减少Fc部分中由两个N-连接的聚糖的存在引起的质量不均一性，将每种抗体或抗体混合物样品在45℃下在100mM Tris-HCl(pH 7.5)中用PNGase F(1IUB毫单位/10μg蛋白质)处理1小时。为了制备bsAb混合物的加标标准品，将bsAb原料药首先使用分析性强阳离子交换色谱(SCX)进一步纯化，以从大规模制造工艺中去除任何残余同源二聚体杂质。SCX分级的详细条件如下所示。分级后，对纯化的BsAb和对应的同源二聚体标准品二者进行缓冲液交换以将其交换到50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，并且基于通过Nanodrop(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)测定的浓度将它们各自调节至6μg/μL。随后，将bsAb和两种对应的同源二聚体以1:1:1的比例混合。最后，使用2μg/μL bsAb溶液执行连续稀释以制备一系列同源二聚体水平范围介于0.1％到10％的加标标准品。

通过SCX从bsAb原料药中纯化bsAb。为了从每个bsAb样品中进一步纯化bsAb，在配备有光电二极管阵列(PDA)检测器的Waters I级UPLC系统(Waters,Milford,MA,US)上执行分析型强阳离子交换色谱(SCX)。在注射样品之前，将柱室温度设定为45℃，用流动相A(20mM乙酸铵，用20mM乙酸将pH调节至5.6)以0.4mL/min的流速预调节YMC-BioPro SP-F强阳离子交换柱(100mm×4.6mm，5μm)(YMC Co.,LTD.,Kyoto,Japan)。在注射蛋白质样品的等分试样(200μg)之后，将梯度在100％流动相A下保持2分钟，随后在16分钟内线性增加到100％流动相B(140mM乙酸铵、10mM碳酸氢铵，pH 7.4)。将梯度在100％流动相B下保持4分钟，随后返回到100％流动相A以在下一次注射前将柱再调节7分钟。随后，在混合以制备加标标准品之前，对分级的BsAb执行缓冲液交换以将其交换到与错配的同源二聚体样品相同的缓冲液中。

MM-SEC-MS方法。在配备有光电二极管阵列(PDA)检测器的Waters I级UPLC系统(Waters,Milford,MA,US)上执行混合模式尺寸排阻色谱法。配备有Nanospray Flex

实施例1.在使用MS相容缓冲液执行SEC期间的二级相互作用。

蛋白质表面是高度异质的且由许多不同的官能团组成，所述官能团可有助于与基于二氧化硅或多糖的SEC柱基质产生氢键结(羟基、胺基和酰胺基)、静电(带电基团)和疏水(疏水基团)相互作用。这些相互作用一般具有不同的结合强度且高度取决于SEC应用中使用的pH、温度和流动相组成。举例来说，当在接近中性pH下执行时，来自基于二氧化硅的SEC柱的硅烷醇基团可以带负电荷，且因此促进了与碱性蛋白质的静电相互作用。为抑制此类相互作用，过去经常需要具有中等离子强度(Goyon等人,2018,同上)或低pH(小于5)(Pavon等人,2016,同上)的流动相。

最近，通过二氧化硅表面衍生化(如短烷基链或官能团连键)，来自现代SEC柱的残余硅烷醇基团可被有效地屏蔽，且因此显著减少静电相互作用的存在。然而，这些新引入的化学基团也可能导致与蛋白质分析物的其它增强的二级相互作用(例如，疏水性相互作用)，如最近的研究(Yang等人,2015,同上；Yan He等人,On-line coupling of sizeexclusion chromatography with mixed-mode liquid chromatography forcomprehensive profiling of biopharmaceutical drug product,1262 JOURNAL OFCHROMATOGRAPHY A 122–129(2012))所报告的。如Arakawa等人所概述，静电相互作用在低盐浓度下占主导地位，而疏水性相互作用则受到高离子强度流动相的喜爱，尤其是当使用Hofmeister系列的高级盐时(参见图3)。尽管与在线SEC-MS应用相容的盐的选择一般有限(例如，甲酸铵、乙酸铵和碳酸氢铵)，但蛋白质分析物与柱基质之间的不同类型的二级相互作用仍可通过改变盐浓度进行调节且仍可被探索用于蛋白质分离目的。

为了评定与盐浓度相关的混合模式相互作用，在Waters BEH200SEC柱上使用30mM到300mM(这个范围对于后续的原生MS分析是可行的)的变化浓度的基于乙酸铵和碳酸氢铵的流动相分析具有不同表面特征的八种抗体(IgG1和IgG4亚类)的混合物。乙酸铵与碳酸氢铵之间的摩尔比保持在14:1不变，以实现约7.4的pH值。这八种mAb的色谱行为是通过将其SEC保留时间(如通过所提取离子色谱图(XIC)所确定)对流动相浓度作图来例示的(图5)。总的来说，当使用30mM的流动相盐浓度执行SEC时，这八种mAb被分离得最好。随着盐浓度的增加，这八种mAb的洗脱曲线变得更加趋同(converged)，并且变得不太能被分辨(图5中的插图)。保留时间的这些转变可由mAb分子与柱基质之间的二级相互作用的变化来解释。一方面，随着来自柱基质的残余硅烷醇基团在pH 7.4下变得带负电，它们可通过静电相互作用与带正电的蛋白质表面相互作用。当使用较低的盐浓度时，这种相互作用得到增强。另一方面，当使用更高的盐浓度时，mAb分子与柱基质之间的疏水性相互作用可以被促进。有趣的是，基于pI值，这八种mAb可被分为三个不同的组，其中观察到保留时间与盐浓度之间的相似关系。第一组包括三种酸性mAb分子：mAb5(pI＝6.3)、mAb6(pI 6.4)和mAb1(pI＝6.7)，预计它们在pH 7.4下在蛋白质表面带有较少的正电荷，且因此表现出最少的与柱基质的静电相互作用。如图5中所示，随着盐浓度的增加，这三种分子都表现出保留时间增加的趋势，表明随着弱静电相互作用在较高离子强度下被消除，疏水性相互作用在SEC分离期间起主导作用。相反，随着盐浓度的增加，预计在pH 7.4下在蛋白质表面上带更正的电荷的三种碱性mAb分子：mAb3(pI＝8.0)、mAb4(pI＝8.3)和mAb8(pI＝7.6)都显示出保留时间下降的趋势。盐浓度与保留时间之间的这种反相关性主要归因于占主导地位的静电相互作用，该静电相互作用在低盐浓度下被促进且在高盐浓度下被抑制。最后，与酸性或碱性mAb不同，mAb2(pI＝7.3)和mAb7(pI＝6.9)代表“中性”基团，其可能在蛋白质表面上带有适量的正电荷，且因此表现出中等水平的与柱基质的静电相互作用。这组分子在变化的盐浓度(30mM到300mM)下维持相对不变的保留时间。在这种情况下，随着盐浓度的增加，疏水性相互作用的增加可能接近且抵消了静电相互作用的减少，从而导致保留时间几乎不变。这些结果表明，通过适当地调节盐浓度，有可能可以使用SEC柱上的混合模式相互作用来分离或部分分离不同的抗体(例如，bsAb与同源二聚体)以进行后续MS分析。

尽管似乎在Waters BEH柱上以低盐浓度获得了更高的色谱分辨率，但仍需谨慎对待碱性mAb，因为严重的峰拖尾可能会出现在那些条件下且可能显著影响蛋白质回收率(Alexandre Goyon等人,Characterization of 30 therapeutic antibodies andrelated products by size exclusion chromatography:Feasibility assessment forfuture mass spectrometry hyphenation,1065-1066 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B35–43(2017))。

实施例2.使用MM-SEC-MS检测双特异性抗体双特异性Ab的O-聚糖变体

2.1双特异性抗体的样品制备

抗CD20 x抗CD3双特异性抗体(BsAb1)是一种基于被修饰成减少Fc结合的IgG4同种型的铰链稳定(hinge-stabilized)的CD20xCD3双特异性全长抗体(Ab)。它被设计成结合T细胞(经由CD3)和CD20表达细胞。所述双特异性抗体通过遵循如Smith等人(Sci.Rep.(2015)5:17943)所描述的方法来生产。

2.2 MM-SEC-MS

使用Zenix SEC-300 MK柱(7.8×300nm,3μm)在如上所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的分析。通过280nm处的UV监测洗脱。

进行两组实验。在第一实验中，流动相包含140mM乙酸铵和10mM碳酸氢铵，而在第二实验中，流动相包含420mM乙酸铵和30mM碳酸氢铵。洗脱以0.4mL/min的流速进行。使用流动相执行平衡。

对于分析运行，注射装载量由100μg总蛋白质组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。通过使用来自Protein Metrics的Intact软件来分析质谱数据。

用不同浓度的流动相进行的两次运行表明，如从双特异性抗体在不同流动相中的洗脱时间所观察到的，较高的盐浓度可在SEC分离期间增强疏水性相互作用。这种效应使得双特异性抗体与其O-聚糖变体之间的分离增加(参见图6)。

实施例3.使用Zenix SEC-300，3μm，

3.1双特异性抗体与同源二聚体混合物标准品的样品制备

两种同源二聚体杂质在双特异性抗体(BsAb1)(Fc*/Fc)：同源二聚体1(Fc*-Fc*)和同源二聚体2(Fc/Fc)的生产期间产生(参见图2)。

3.2 MM-SEC-MS

使用Zenix SEC-300 MK柱(7.8×300nm，3μm)在如上所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。通过280nm处的UV监测洗脱。

进行两组实验。在第一实验中，流动相包含140mM乙酸铵和10mM碳酸氢铵，而在第二实验中，流动相包含420mM乙酸铵和30mM碳酸氢铵。洗脱以0.4mL/min的流速进行。

对于分析运行，注射装载量由50μg总蛋白质组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。类似于从2.2中获得的结果，用不同浓度的流动相进行的两次运行表明，如从双特异性抗体和同源二聚体在不同流动相中的洗脱时间所观察到的，较高的盐浓度可在SEC分离期间增强疏水性相互作用。总盐浓度为450mM的流动相执行了同源二聚体1和同源二聚体2与双特异性抗体的改进的分离(参见图7)。

实施例4.使用MM-SEC-MS、SEC-MS和RP LC-MS比较双特异性抗体中的同源二聚体杂质的检测。

4.1双特异性抗体和同源二聚体混合物标准品的样品制备

使用实施例3中例示的方法制备样品。

4.2 RP LC-MS

将样品稀释至0.5mg/mL。将此溶液以0.5μg注射用于LC-MS分析。在ThermoFisherFusion Lumos Tribrid质谱仪上执行LC-MS实验。Waters BioResolveTM mAb聚苯基，

4.3 SEC-MS

在ACQUITY UPLC蛋白质BEH SEC柱(

4.4 MM-SEC-MS

采用实施例3.2中所例示的方法使用含有420mM乙酸铵和30mM碳酸氢铵的流动相等度地在MM-SEC-MS系统上进行分析运行。

4.5结果

对Lumos上的RP LC-MS(参见图8)、EMR上的SEC-MS和EMR上的MM-SEC-MS的总离子色谱(TIC)和原生MS谱的比较显示，双特异性抗体中的同源二聚体得到了显著分离和检测。来自RP LC-MS的原始质谱图不能区分同源二聚体和双特异性抗体。来自SEC-MS的原始质谱图能够分离和检测同源二聚体1和双特异性抗体，但所述分离不足以分离和检测同源二聚体2和双特异性抗体。仅来自MM-SEC-MS的原始质谱显示出同源二聚体1、同源二聚体2和双特异性抗体的充分分离和检测。这种比较证明了MM-SEC-MS在生物制药产品中的杂质检测方面优于SEC-MS和RP-LC-MS的概念。

实施例5.使用Zenix SEC-300，3μm，

为评估在连续运行中检测的数据质量，使用MM-SEC-MS系统对含有双特异性Ab、同源二聚体1和同源二聚体2(如4.1中所例示的那样制备)的样品进行三次分析运行。使用4.2中所例示的方法和包含280mM乙酸铵和20mM碳酸氢铵的流动相执行分析运行。

三次运行的原始质谱和提取的离子色谱图(XIC)显示数据质量和信噪比下降(参见图9)。这种影响可能是由于使用了大柱子(7.8×300mm)，其需要大量的蛋白质样品

进一步地，纳米分流器可以处理的大柱子和相对低的流速(最大～0.4mL/min)导致宽的峰宽(～1.5min)，这在一些情况下会影响MS强度和分辨率。晚洗脱时间也减缓了整体分析时间(每个样品30min)。

实施例6.使用Zenix SEC-300，3μm，

6.1双特异性抗体和同源二聚体混合物标准品的样品制备

可通过3.1中所例示的方法来制备双特异性抗体和同源二聚体混合物标准品。

6.2 MM-SEC-MS

使用Zenix SEC-300 MK柱(4.6×300nm，3μm)在如上所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。通过280nm处的UV监测洗脱。

进行了四组实验。在第一实验中，流动相包含140mM乙酸铵和10mM碳酸氢铵，在第二实验中，流动相包含280mM乙酸铵和20mM碳酸氢铵，在第三实验中，流动相包含420mM乙酸铵和30mM碳酸氢铵，且在第二实验中，流动相包含560mM乙酸铵和40mM碳酸氢铵。以0.3mL/min的流速进行洗脱。

对于分析运行，注射装载量由10μg蛋白质组成。使用由乙酸铵(缓冲液A)和碳酸氢铵(缓冲液B)组成的等度梯度进行洗脱。大于150mM总盐浓度的浓度的使用显示出了对同源二聚体和双特异性抗体的分离和检测的改进(参见图10)。与使用较大的柱(7.8×300nm)的总分析时间和峰宽相比，使用较小的柱(4.6×300nm)的总分析时间减少至约18分钟，且峰宽减少至少于1分钟。图11示出了差异的表示。

实施例7.在Zenix-SEC柱上对双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基化混合物的MM-SEC-MS分析

7.1双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基化混合物的制备

将每种蛋白质在45℃下用肽N-糖苷酶F(PNGase F；1IUB毫单位/10μg蛋白质)处理持续1小时，以从每个重链恒定区中完全去除聚糖链。

7.2 MM-SEC-MS

使用Zenix SEC-300 MK柱(4.6×300nm，3μm)在如上所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。通过280nm处的UV监测洗脱。

进行了六组实验。在第一实验中，流动相包含9.3mM乙酸铵和0.7mM碳酸氢铵，在第二实验中，流动相包含46.7mM乙酸铵和3.3mM碳酸氢铵，在第三实验中，流动相包含93.3mM乙酸铵和6.7mM碳酸氢铵，在第四实验中，流动相包含186.7mM乙酸铵和13.3mM碳酸氢铵，在第五实验中，流动相包含280mM乙酸铵和20mM碳酸氢铵，且在第六实验中，流动相包含420mM乙酸铵和30mM碳酸氢铵。以0.3mL/min的流速进行洗脱。

对于分析运行，注射装载量由10μg蛋白质组成。

10mM总盐浓度的使用显示出了同源二聚体1、双特异性抗体和同源二聚体2的显著分离。在10mM盐浓度下，同源二聚体2具有比双特异性抗体更晚的保留时间，所述双特异性抗体显示出比同源二聚体1更晚的保留时间。然而，在大于10mM的浓度下，同源二聚体1具有比双特异性抗体更晚的保留时间，所述双特异性抗体显示出比同源二聚体2更低的保留时间(参见图12和图13)。这种影响可能是由于这三种蛋白质与所使用的尺寸排阻色谱树脂的相互作用：电荷、形状或疏水性的类型不同所致。给定盐浓度下蛋白质上的电荷取决于其pI值(表2)。通过使用具有10mM的低盐浓度的流动相或者通过使用具有大于100mM的高盐浓度的流动相获得了显著分离。在较低的盐浓度下，保留可由电荷-电荷相互作用驱动。举例来说，在MM-SEC-MS系统中，可通过使用具有较低盐浓度的流动相来分离碱性分子。在较高的盐浓度下，保留由疏水性相互作用驱动。举例来说，在MM-SEC-MS系统中，可通过使用具有较高盐浓度的流动相来分离酸性或疏水性分子(参见图14和图15)。

理想的SEC分离应仅基于蛋白质的流体动力学体积，且在蛋白质和固定相之间不应该需要其它相互作用。由于基于二氧化硅的柱基质可能由于硅烷醇基团而展现出负电荷(离子交换特性)，二氧化硅颗粒的衍生化有助于降低硅烷醇的影响，但同时可能引入新的相互作用机制(疏水性)。因此，这可以产生具有功能的SEC树脂，如使用Zenix SEC柱所观察到的。这解释了当在Zenix-SEC柱中进行时，具有不同浓度的蛋白质的洗脱顺序的差异。

表2.

实施例8.双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基(苷)化混合物在Waters BEH SEC柱上的MM-SEC-MS分析

8.1双特异性抗体、同源二聚体1和同源二聚体2的去糖基(苷)化混合物的制备。

使用与7.1相同的方法制备去糖基化混合物

8.2 MM-SEC-MS

使用Waters BEH SEC柱在如上所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。通过280nm处的UV监测洗脱。

进行了六组实验。在第一实验中，流动相包含14mM乙酸铵和1mM碳酸氢铵，在第二实验中，流动相包含18.7mM乙酸铵和1.3mM碳酸氢铵，在第三实验中，流动相包含28mM乙酸铵和2mM碳酸氢铵，在第四实验中，流动相包含70mM乙酸铵和5mM碳酸氢铵，在第五实验中，流动相包含93.3mM乙酸铵和6.7mM碳酸氢铵，且在第六实验中，流动相包含280mM乙酸铵和20mM碳酸氢铵。以0.2mL/min的流速进行洗脱。

对于分析运行，注射装载量由10μg蛋白质组成。

使用15mM总盐浓度显示了同源二聚体1、双特异性抗体和同源二聚体2的显著分离。在15mM盐浓度下，同源二聚体2具有比双特异性抗体更早的保留时间，所述双特异性抗体显示比同源二聚体1更早的保留时间。随着流动相浓度的增加，保留时间的差异减小。此外，在流动相的盐浓度为300mM时，同源二聚体1具有比双特异性抗体更早的保留时间，所述双特异性抗体显示比同源二聚体2更早的保留时间(参见图16和图17)。如图14和图15中所描述，这种效果是由于在SEC柱上开发了附加相互作用。附加相互作用取决于流动相的盐浓度。在较低浓度下，电荷-电荷相互作用在柱上占主导地位且决定了蛋白质在柱上的保留率。

实施例9.在Waters BEH SEC柱上对IgG1分子和其氧化变体进行的MM-SEC-MS分析

9.1 IgG1分子-Ab1的氧化变体的制备

将Ab1在45℃下用肽N-糖苷酶F(PNGase F；1IUB毫单位/10μg蛋白质)处理1小时以从每个重链恒定区完全去除聚糖链。

9.2 MM-SEC-MS

使用Waters BEH SEC柱在如上所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。通过280nm处的UV监测洗脱。

进行了三组实验。在第一实验中，流动相包含93.3mM乙酸铵和6.7mM碳酸氢铵，在第二实验中，流动相包含140mM乙酸铵和10mM碳酸氢铵，且在第三实验、第六实验中，流动相包含280mM乙酸铵和20mM碳酸氢铵。以0.2mL/min的流速进行洗脱。

对于分析运行，注射装载量由10μg蛋白质组成。

在使用100mM、150mM和300mM盐浓度的流动相时，抗体Ab1和其氧化变体在MM-SEC-MS系统上显著分离(参见图18，上图)。IgG1抗体Ab1的pI为8.65。对于具有较高PI值的IgG1分子，与具有低pI值的IgG4分子相比，电荷相互作用起更主导的作用。

实施例10.在Waters BEH SEC柱上对IgG1分子进行的MM-SEC-MS分析

10.1 IgG1分子-Ab2的制备

将Ab2在45℃下用肽N-糖苷酶F(PNGase F；1IUB毫单位/10μg蛋白质)处理1小时以从每个重链恒定区完全去除聚糖链。

10.2 MM-SEC-MS

使用Waters BEH SEC柱在如实施例8.2中所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。比较两种IgG1分子-Ab1和Ab2的保留时间，观测到Ab2分子具有更低的保留时间(参见图18，下图)。

这可解释为是由于Ab1与Ab2之间的疏水性差异所致。对于疏水性更强的分子，与疏水性较弱的分子相比，“盐析”效应在较低的盐浓度下开始出现。此点也被称为转变点(参见图19)。

实施例11.使用MM-SEC-MS定量双特异性抗体中的同源二聚体杂质

使用图20中所示的方法来产生标准品。

使用Zenix SEC-300 MK柱(4.6×300nm，3μm)在所描述的系统上等度地执行使用MM-SEC-MS进行的采集。使用具有300mM盐浓度和70mM盐浓度的流动相洗脱蛋白质。对于完整浓度以及亚单位水平，在具有较高量的同源二聚体的样品中观测到使用MM-SEC-MS进行的较高的检测(参见图21和图22)。在流动相的盐浓度为70mM时，还检测到双特异性抗体的附加Fc杂质。

在完整水平下，同源二聚体1/双特异性抗体理论值与检测到的同源二聚体1/双特异性抗体的关系图以及同源二聚体2/双特异性抗体理论值与检测到的同源二聚体2/双特异性抗体的关系图对以0.1％到50％存在的同源二聚体的定量显示出良好的线性(参见图23)。

在亚单位水平下，同源二聚体1/双特异性抗体理论值与检测到的同源二聚体1/双特异性抗体的关系图以及同源二聚体2/双特异性抗体理论值与检测到的同源二聚体2/双特异性抗体的关系图对以0.1％到50％存在的同源二聚体的定量显示出良好的线性(参见图24)。与完整水平相比，在亚单位水平下获得了更好的准确性。

实施例12.用于原生MS检测的双特异性和同源二聚体抗体的混合模式SEC分离。

将四种具有不同pI值和疏水性的bsAb分子(表3)与其对应同源二聚体抗体混合且用作测试标准品。每个bsAb分子(HH*L2)均含有两个同一的轻链(LC)和两个不同的重链(HC和HC*)，而每个同源二聚体抗体(H2L2或H*2L2)含有两个同一的轻链和两个同一的重链(HC或HC*)。

表3.

*表观HIC保留因子是基于通过HIC分析的蛋白质分子的保留时间计算的。在YMCBioPro HIC BF柱(4μm，100mm X 4.6mm)中施加3.3M铵缓冲液的流动相“A”和水的流动相“B”。在18min内以0.4mL/min的流速执行从100％到97％A的梯度。表观HIC保留因子是通过将其超过18分钟的保留时间归一化到10级来计算的。

随后使用三种不同的盐浓度(75mM、150mM和300mM)在Waters BEH柱上分析四种bsAb混合物，然后执行在线原生MS检测。所得的基本峰色谱图(BPC)显示在图25的左侧图中。与来自先前研究的观察结果一致，随着盐浓度的增加，具有不同pI值的mAb分子在保留时间方面展现出不同的趋势。利用每种抗体在不同盐浓度下的不同保留行为，我们因此探索了通过调节盐浓度将同源二聚体与bsAb分离的可能性。举例来说，在bsAb2混合物中，随着盐浓度从300mM降至75mM，两个酸性分子H2L2同源二聚体(pI＝6.1)和HH*L2 bsAb(pI＝6.5)均较早地被洗脱，这可能是由于在低盐浓度下疏水性和静电相互作用降低所致。相反，中性分子H*2L2同源二聚体(pI＝7.2)随着盐浓度被调节而在保留时间方面几乎保持不变，推测是因为低盐浓度下增强的静电相互作用抵消了疏水相互作用的降低。此外，由于与HH*L2 bsAb相比，H2L2同源二聚体展现出保留时间的显著减少(这可能是由于其pI值较低，且因此静电相互作用较弱)，所以在较低的盐浓度下，也实现了两者之间的分离度改善。结果，在75mM盐浓度下，实现了同源二聚体与bsAb2之间的良好色谱分离。

类似地，当盐浓度从300mM降低到75mM时，bsAb3和其两个同源二聚体之间的分离也得到显著改善。这是因为H2L2同源二聚体(pI＝6.6)、HH*L2 bsAb(pI＝7.4)和H*2L2同源二聚体(pI＝8.3)的保留时间分别减少、保持不变或增加。值得注意的是，尽管两个实例中的任一实例均未达到基线分辨率，但由于MS作为检测器的高特异性，同源二聚体的鉴定和定量不应受到共洗脱物质的显著影响，因为它们将被用于基于UV的定量。

在bsAb5混合物中，相对于高盐条件，BEH柱上的盐浓度为75mM时，再次实现了更好的分离。这是因为相对碱性的分子HH*L2bsAb(pI＝8.1)和H*2L2同源二聚体(pI＝8.5)均展现越来越晚的保留时间，而相对中性的H2L2同源二聚体(pI＝7.4)随着盐浓度降低未显示出保留时间的变化。然而，尽管色谱分离良好，但这种条件对于同源二聚体定量来说并不理想，因为在低盐浓度下，H*2L2同(源)聚体由于其高碱性而开始出现峰拖尾和蛋白质回收损失。此外，bsAb4混合物表明，通过将盐浓度从300mM降低到75mM不能实现改进的分离。这可能是因为这三种分子都具有接近中性的pI(表3)，且因此展现出与对应盐浓度变化相似的保留行为。虽然进一步降低盐浓度以增强静电相互作用可能会改善分离，但可能会出现严重的峰拖尾，从而影响定量。还有趣的是注意到，随着盐浓度的增加，bsAb4混合物的洗脱曲线变宽。在300mM盐浓度下，通过XIC(数据未示出)确定这三种分子的洗脱顺序为H*2L2同源二聚体、HH*L2 bsAb和H2L2同源二聚体，这与其通过疏水相互作用色谱法测定的疏水性等级一致(表3)。因此，通过使用甚至更高的盐浓度进一步增强疏水性相互作用将可能改善bsAb4混合物在此柱上的分离。不幸的是，基于我们的经验，高于300mM的盐浓度通常会造成去溶剂化问题且显著损害原生MS敏感性。

为进一步检查bsAb混合物的分离，同时使用有利于MS分析的盐浓度，评估了SepaxZenix SEC-300柱的混合模式相互作用。此柱中的3μm二氧化硅珠粒被化学键合的直立单层涂布，这可能有助于此柱的中等疏水性，如先前研究(Yang等人,2016,同上；Wong等人,同仁；Pavon等人,同上)中所报告。在150mM和300mM盐浓度下，四种bsAb混合物中的每一种均在此柱上被分离用于随后的原生MS检测，且生成的BPC显示在图25的右图中。如所预期，当在相同的盐浓度下操作时，与BEH柱相比，bsAb4混合物在Zenix柱上显示出改进的分离。这三种分子的洗脱顺序也与其相对疏水性一致，疏水性最强的H2L2同源二聚体最晚洗脱。注意，与150mM的盐浓度相比，在300mM的盐浓度下bsAb4混合物的色谱分辨率得到了进一步提高，这是预料之中的，因为较高的盐浓度会促进疏水相互作用。另外，与BEH柱相比，bsAb5混合物在Zenix柱上能被更有效地分辨，推测是由于混合物组分之间与柱基质的疏水相互作用的差异很大所致。总之，通过调节具有不同特性的两个SEC柱上的盐浓度，我们证明了在有利于后续原生MS检测的盐浓度下，实现了所有四种bsAb混合物的良好色谱分离。通过提供新颖的混合模式相互作用，未在本研究中测试的其它SEC柱也可能会进一步扩展此方法的适用性。

实施例13.通过原生MM-SEC-MS定量同源二聚体杂质。

通过基于MS的途径进行的相对定量经常需要对每种分析物的MS响应(例如，电离效率和离子传输效率)有很好的了解。由于尺寸相似，bsAb和同源二聚体在原生MS分析期间应展现出相似的离子传输效率。另一方面，洗脱时的溶剂组成和共洗脱物质的存在都可能会影响电离效率。由于MM-SEC-MS方法利用等度洗脱，因此可以消除如梯度洗脱方法(例如，IEX质谱)中所常见的不同溶剂组成对电离的影响。为了评估MM-SEC-MS方法评定同源二聚体杂质的相对定量的表现，制备了一系列bsAb2加标样品用于分析，所述样品含有相对丰度范围介于0.1％到10％的同源二聚体杂质。应用使用75mM盐浓度流动相的Waters BEH柱在bsAb2与对应同源二聚体之间实现了MM-SEC分离。为了评定bsAb2样品内存在的每种同源二聚体的相对定量，基于同源二聚体类物质或bsAb2的四个最丰富电荷态的m/z产生XIC，且将峰面积积分并用于定量每种同源二聚体的量。如图26所示，通过此方法可容易地实现范围介于0.1％到10％的同源二聚体杂质的可靠定量。另外，即使在0.1％的加标水平下，仍可获得H2L2和H*2L2同源二聚体类物质的高质量原生质谱(图27，右图)，从而实现高可信度的鉴定和定量。

已经开发了一种新的MM-SEC-MS方法并且已针对bsAb样品中同源二聚体杂质的高敏感性检测和定量对该方法进行了评估。我们首先研究了在不同盐浓度下SEC分离期间抗体分子与柱基质之间的混合模式相互作用。使用八种具有变化pI的不同抗体，观察到在限定的pH条件下，与酸性分子相比，碱性分子展现出更强的与柱基质的静电相互作用，且此类相互作用可通过降低盐浓度来增强。另一方面，在SEC分离期间增加盐浓度可减少静电相互作用，同时促进抗体与柱基质之间的疏水相互作用。这些混合模式相互作用为分离具有相似流体力学体积但具有不同表面特征的抗体提供了独特的机会。利用不同的柱特性，通过使用静电相互作用或疏水相互作用的MM-SEC方法完成四种bsAb混合物的色谱分离，这很容易通过调节盐浓度来实现。我们还证明了所实现的色谱分离对于通过后续的原生MS分析获得改进的低丰度同源二聚体杂质检测至关重要。在两个bsAb实例中，使用此MM-SEC-MS方法成功检测到以0.01％(bsAb2)和0.1％(bsAb4)存在的同源二聚体杂质。据我们所知，这一新进展代表了检测bsAb样品中的同源二聚体杂质的最灵敏方法。最后，使用一系列加标标准品，我们证明了MM-SEC-MS方法可以提供对以不同水平存在的同源二聚体杂质的可靠定量。由于灵敏度高，即使在低至0.1％的水平下也可以获得高可信度的鉴定和定量。总之，这种新开发的MM-SEC-MS方法为bsAb样品中同源二聚体杂质的检测和定量提供了一种高度灵敏的途径，且因此可用于支持治疗性bsAb开发。最后，此方法的应用可能会扩展到其它领域，如共同配制的治疗剂中存在的抗体混合物的表征。