一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒及其应用。

背景技术

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)俗称桂鱼、桂花鱼等，属于硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲈形目，广泛分布于我国中北部各大水系及其附属湖泊水库，属于完全淡水生活的鱼类，尤以长江流域地区最为常见。由于其鱼肉中刺少，肉质细嫩、厚实、味道鲜美、营养丰富，自古以来即为我国重要的淡水名贵鱼类之一，在我国淡水养殖业中占重要经济地位。随着鳜鱼养殖业的发展，其养殖规模不断扩大，养殖密度不断提升，水域生态环境不断遭到人为破坏，加之饲养管理不善，导致翘嘴鳜资源显著减少。不少商家为了谋求高额利润，在加工处理、市场流通等环节，存在以次充好、乱贴标签的现象。因此，对翘嘴鳜的快速鉴定非常重要。

鉴定翘嘴鳜主要包含三种方法：传统的形态学鉴定分析，蛋白质分析和DNA检测。对传统形态特征的分析要求鉴定人员具有相当的专业背景，由于鱼类的多样性和形态可塑性，结果很容易受到主观判断的影响。尽管蛋白质方法操作方便，但鱼肉样品在处理后可能会变性或降解，因此结果不准确。关于DNA检测的报道很多，包括线粒体DNA(mtDNA)，限制性片段长度多态性(RFLP)，DNA条形码和微卫星。虽然这些方法具有高特异性和灵敏度，但它们存在耗时长、操作复杂、重复性差等缺点。

目前基于实时PCR的检测方法作为一种高效、快速、特异的检测技术，已被广泛用于鉴定肉类物种。然而在实际检测中，标准物质非常关键，其中质粒标准物质是一种含有特异基因片段的重组DNA序列，它具有制备方便、操作简便、稳定性好、纯度高等优点，也被广泛应用在核酸检测标准品中。目前国内有类似鱼类标准样品，如黑线鳕鱼核酸标准样品，但国内外尚无翘嘴鳜核酸标准样品。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒及其应用，具备可广泛用于翘嘴鳜成鱼、苗种、鱼卵、鱼肉及其加工产品等物种鉴定工作中的质量控制，使得检测过程和检测结果有参考，保证鉴定结果的可靠性等优点，解决了翘嘴鳜检测领域的技术空白的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒，所述标准质粒采用线粒体细胞色素氧化酶I亚基COI基因，其基因序列如下：

CGTCCTTCCTTCTCCTTCTTGCGTCTTCCGGAGTAGAAGCTGGGGCCGGAACGGGATGAACCGTTTACCCACCCCTGGCGGGTAACTTAGCCCATGCAGGGGCATCCGTCGACCTGACCATTTTTTCTCTCCACTTAGCAGGAATTTCTTCCATCCTTGGAGCTATCAACTTCATTACAACTATTATTAACATGAAACCCCCTGCCATCTCCCAATACCAAACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTCCTGATTACTGACTTGAACGTAAAGTGCTTGGCTACATACAACTGCGAAAAGGTCCAAACATTGTACCTGCCATCTCCCAATACCAAACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTCCTATTTATTAAAGAACCCGTGCGCCCCTCAACCTCTTCCCCCATTCTCTTCCTTCTAACCCCGATGCTAGCCCTTACACTTGCCCTCACCCTGTGAGCCCCAATACCCCTTCCCTACCCAGTAATTGACCTAAACTTAGGTATCTTATTTATCTTAGCCCTCTCCAGCCTTGCAGTCTATTCAATTCTAGGCTCAGGCTGAGCATCAAATTCAAAATACGCCCTAATCGGTGCCCTTCGAGCCGTAGCGCAAACCATCTCATACGAAGTTAGCCTCGGACTCATCCTC；

所述标准质粒通过以下方法构建得到的：

S1、设计PCR特异性引物：根据翘嘴鳜线粒体细胞色素氧化酶I亚基COI基因设计PCR特异引物；

S2、获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；

S3、质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC57载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，鉴定为阳性质粒的即为于翘嘴鳜鱼特异性质粒分子pUC57-SC。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S1中，PCR特异性引物为一对，序列如下：

SC-1F:5'-CGTCCTTCCTTCTCCTT-3'，

SC-1R:5'-TGTAGCCAAATGGTTCT-3'。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中，获取目的片段的具体步骤如下：扩增所用引物为SC-1F和SC-1R，扩增体系为Premix Ex Taq PCR Mix 10μL，10μmol/L SC-1F引物1μL，10μmol/L SC-1R引物1μL，100ng/μL翘嘴鳜鱼DNA 2μL，加水补足至20μL；反应程序为：95℃5min预变性；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒的应用，所述应用包含一种检测方法，具体检测步骤如下：

S1、提取待检测样品基因组DNA；

S2、采用TaqMan探针实时荧光PCR法进行检测，检测体系为：Premix Ex Taq PCRMix 10μL，10μmol/L SC-2F引物0.8μL，10μmol/L SC-2R引物0.8μL，10μmol/L SC-2P引物0.4μL，样品基因组DNA 2μL，加水补足至20μL；反应程序为：95℃5min预变性；95℃15s，60℃45s，在60℃45s收集荧光信号，共计40个循环；特异性检测引物和探针为：

SC-2F:5'-CCTGCCATCTCCCAATACCA-3'，

SC-2R:5'-AGAGCAGAAGAAGTACAGCAGTAATCA-3'，

SC-2P:FAM-5'-ACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTC-3'-BHQ1；

S3、结果判断：将反应管中置于荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据样品扩增曲线进行判断：阳性对照出现“S”型扩增曲线，同时阴性对照为无“S”型扩增曲线，表明本次结果可靠，否则需要重新检测，待测样品出现“S”型扩增曲线，检测结果为阳性，含有翘嘴鳜鱼成分，待测样品无“S”型扩增曲线，检测结果为阴性，不含有翘嘴鳜鱼成分。

一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒的应用，所述应用还包含一种嘴鳜鱼物种鉴定用实时荧光PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述的翘嘴鳜鱼特异性质粒分子pUC57-SC及特异性检测引物和探针，所述检测试剂盒还包含PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

作为本发明的一种优选技术方案，所述PCR反应液含有Premix Ex Taq PCR Mix10μL，10μmol/L SC-2F引物0.8μL，10μmol/L SC-2R引物0.8μL，10μmol/L SC-2P引物0.4μL。

作为本发明的一种优选技术方案，所述阳性对照为翘嘴鳜鱼特异性质粒分子pUC57-SC，所述阴性对照为超纯水。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种翘嘴鳜鱼物种鉴定用标准质粒及其应用，具备以下有益效果：

本发明首次构建了含有翘嘴鳜鱼特异基因序列的标准质粒分子pUC57-SC，并且本发明构建的质粒分子pUC57-SC可用于TaqMan探针实时荧光PCR检测翘嘴鳜成鱼、苗种、鱼卵、鱼肉及其加工产品，适用性强，稳定性好，对实际样品的检测结果准确，很好的解决了翘嘴鳜鱼测过程中阳性标准物质缺乏的问题，具有极高的应用价值与市场前景。

附图说明

图1为标准质粒分子pUC57-SC图谱；

图2为标准质粒分子pUC57-SC均匀性检验实时荧光PCR检测结果图；

图3为标准质粒分子pUC57-SC短期稳定性检验放置0天实时荧光PCR检测结果图；

图4为标准质粒分子pUC57-SC短期稳定性检验放置7天实时荧光PCR检测结果图；

图5为标准质粒分子pUC57-SC短期稳定性检验放置14天实时荧光PCR检测结果图；

图6为标准质粒分子pUC57-SC长期稳定性检验放置0天实时荧光PCR检测结果图；

图7为标准质粒分子pUC57-SC长期稳定性检验放置3个月实时荧光PCR检测结果图；

图8为标准质粒分子pUC57-SC长期稳定性检验放置6个月实时荧光PCR检测结果图；

图9为标准质粒分子pUC57-SC长期稳定性检验放置12个月实时荧光PCR检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一，翘嘴鳜鱼特异基因序列的标准质粒分子pUC57-SC的构建：

步骤如下：

S1、设计PCR特异性引物：利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，根据翘嘴鳜线粒体细胞色素氧化酶I亚基COI基因设计PCR特异引物，引物序列如下：

SC-1F:5'-CGTCCTTCCTTCTCCTT-3'，

SC-1R:5'-TGTAGCCAAATGGTTCT-3'；

S2、获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；采用动物组织DNA提取试剂盒提取翘嘴鳜鱼基因组DNA，使用引物SC-1F和SC-1R进行PCR扩增，扩增体系为PremixEx Taq PCR Mix 10μL，10μmol/L SC-1F引物1μL，10μmol/L SC-1R引物1μL，100ng/μL翘嘴鳜鱼DNA 2μL，加水补足至20μL；反应程序为：95℃5min预变性；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

S3、质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC57载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，其序列如下：

CGTCCTTCCTTCTCCTTCTTGCGTCTTCCGGAGTAGAAGCTGGGGCCGGAACGGGATGAACCGTTTACCCACCCCTGGCGGGTAACTTAGCCCATGCAGGGGCATCCGTCGACCTGACCATTTTTTCTCTCCACTTAGCAGGAATTTCTTCCATCCTTGGAGCTATCAACTTCATTACAACTATTATTAACATGAAACCCCCTGCCATCTCCCAATACCAAACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTCCTGATTACTGACTTGAACGTAAAGTGCTTGGCTACATACAACTGCGAAAAGGTCCAAACATTGTACCTGCCATCTCCCAATACCAAACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTCCTATTTATTAAAGAACCCGTGCGCCCCTCAACCTCTTCCCCCATTCTCTTCCTTCTAACCCCGATGCTAGCCCTTACACTTGCCCTCACCCTGTGAGCCCCAATACCCCTTCCCTACCCAGTAATTGACCTAAACTTAGGTATCTTATTTATCTTAGCCCTCTCCAGCCTTGCAGTCTATTCAATTCTAGGCTCAGGCTGAGCATCAAATTCAAAATACGCCCTAATCGGTGCCCTTCGAGCCGTAGCGCAAACCATCTCATACGAAGTTAGCCTCGGACTCATCCTC，

所构建的质粒分子图谱如图1所示。

实施例二，紫外分光光度法鉴别标准质粒分子pUC57-SC纯度：

按照国家标准GB/T 24310-2009规定，以及《分子克隆》有关实验要求，采用紫外分光光度法对质粒的纯度进行考察，将实施例一获得的标准质粒分子pUC57-SC进行紫外光谱扫描，结果如表1所示：表1中A260/A280均大于1.8，A260/A230均大于2.0，证明标准质粒分子pUC57-SC纯度良好，满足实际使用要求。

表1标准质粒分子pUC57-SC紫外光谱扫描数据

实施例三，标准质粒分子pUC57-SC的均匀性紫外分光法检验：

按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，任意抽取分装好的一瓶实施例1制备的标准质粒分子pUC57-SC，约100μL。将抽取的一瓶按取样位置分上层、中层和下层3个子样，每个子样各抽取3个样本，每个1μL，共9个样本。每个取样量用紫外分光光度重复测定3次，取平均值，检测结果如表2所示：表2中的变异系数均小于5％，证明标准质粒分子pUC57-SC均匀性良好，满足实际使用要求。

表2翘嘴鳜鱼标准质粒分子pUC57-SC均匀性检验结果

实施例四，标准质粒分子pUC57-SC的均匀性实时荧光PCR法检验：

按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，任意抽取分装好的一瓶实施例1制备的标准质粒分子pUC57-SC，约100μL。随机抽取20份，采用TaqMan探针实时荧光PCR法进行检测。检测体系为：Premix Ex Taq PCR Mix 10μL，10μmol/L SC-2F引物0.8μL，10μmol/L SC-2R引物0.8μL，10μmol/L SC-2P引物0.4μL，样品基因组DNA 2μL，加水补足至20μL；反应程序为：95℃5min预变性；95℃15s，60℃45s，在60℃45s收集荧光信号，共计40个循环；特异性检测引物和探针为：

SC-2F:5'-CCTGCCATCTCCCAATACCA-3'，

SC-2R:5'-AGAGCAGAAGAAGTACAGCAGTAATCA-3'，

SC-2P:FAM-5'-ACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTC-3'-BHQ1；

将PCR反应管置于荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，检测结果如图2所示，图2中20管标准质粒扩增曲线重合，Ct值为8.16±0.19，CV值为2.33％，证明标准质粒分子pUC57-SC均匀性良好，满足实际使用要求。

实施例五，标准质粒分子pUC57-SC的短期稳定性检验：

随机抽取实施例1制备的标准质粒分子pUC57-SC，分别在-20、0、4、25、37℃条件下保存2周，采用TaqMan探针实时荧光PCR法进行检测。检测体系为：Premix Ex Taq PCR Mix10μL，10μmol/L SC-2F引物0.8μL，10μmol/L SC-2R引物0.8μL，10μmol/L SC-2P引物0.4μL，样品基因组DNA 2μL，加水补足至20μL；反应程序为：95℃5min预变性；95℃15s，60℃45s，在60℃45s收集荧光信号，共计40个循环；特异性检测引物和探针为：

SC-2F:5'-CCTGCCATCTCCCAATACCA-3'，

SC-2R:5'-AGAGCAGAAGAAGTACAGCAGTAATCA-3'，

SC-2P:FAM-5'-ACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTC-3'-BHQ1；

将PCR反应管置于荧光PCR仪中，实时读取荧光信号。保存0天的检测结果如图3所示，保存7天的检测结果如图4所示，保存14天的检测结果如图5所示。证明标准质粒短期稳定性良好。

实施例六，标准质粒分子pUC57-SC的长期稳定性检验：

随机抽取实施例1制备的标准质粒分子pUC57-SC，在-20℃条件下保存1年，于0、3、6、12个月各时间点采用TaqMan探针实时荧光PCR法进行检测。检测体系为：Premix Ex TaqPCR Mix 10μL，10μmol/L SC-2F引物0.8μL，10μmol/L SC-2R引物0.8μL，10μmol/L SC-2P引物0.4μL，样品基因组DNA 2μL，加水补足至20μL；反应程序为：95℃5min预变性；95℃15s，60℃45s，在60℃45s收集荧光信号，共计40个循环；特异性检测引物和探针为：

SC-2F:5'-CCTGCCATCTCCCAATACCA-3'，

SC-2R:5'-AGAGCAGAAGAAGTACAGCAGTAATCA-3'，

SC-2P:FAM-5'-ACCCCTCTGTTCGTGTGCGCAGTC-3'-BHQ1；

将PCR反应管置于荧光PCR仪中，实时读取荧光信号。保存0天的检测结果如图6所示，保存3个月的检测结果如图7所示，保存6个月的检测结果如图8所示，保存12个月的检测结果如图9所示。证明标准质粒长期稳定性良好。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。