一种辣椒活体再生方法

技术领域

本发明涉及一种辣椒活体再生方法，对辣椒组织再生、转基因和基因编辑技术具有极大的促进作用，属于植物基因工程领域。

背景技术

植物组织再生是植物转基因和基因编辑技术顺利实施的前提，因为转基因过程中外源基因需要插入到受体细胞DNA中，携带有外源基因的受体细胞重新进行分裂、分化、再生，最终形成新的转基因植株。虽然很多植物可以顺利进行离体组织培养获得再生植株，但是仍然有很大比重的植物无法或很难通过离体组织培养获得再生植株，极大的限制了转基因技术和基因编辑技术的实施。

辣椒属于再生顽拗型植物，存在严重的基因型依赖，无法建立通用的离体组织再生体系。离体培养中，辣椒再生芽的诱导和分化是影响辣椒再生的关键因素，不同研究采用不同基因型、不同的再生外植体和不同的激素配比，得到的结果也不相同，无法获得统一的结论。辣椒离体培养中再生芽的伸长是辣椒再生的另一难点，需要大量试验筛选最优的诱导生长培养基。根的再生同样需要筛选诱导根再生培养基，再生时间很长，有些材料需要2-3月的时间才能长出再生根系。

活体再生技术在其他植物上有成功报道，最为成功的是番茄和柑橘。番茄上活体再生技术，所用的外植体为5-6片真叶植株。由于辣椒茎的木质化程度远超番茄，在5-6片真叶时去掉生长点，辣椒无法在伤口出形成愈伤，无法再生出新的植株。柑橘活体再生技术中所用外植体为去除生长点和子叶的下胚轴，由于柑橘为木本植物，而辣椒为草本植物，二者再生机理不同。在辣椒上利用去掉生长点和子叶的下胚轴，伤口处会萎蔫干枯，也无法再生出新的植株。

目前辣椒上主要是通过离体组织培养获得再生植株，活体再生尚未见报道。由于缺少通用的离体再生体系，不同实验室在相关研究方面均需要从头开始，花费大量的人力、物力进行相关研究，并且大部分研究结果表明再生效率很低。针对辣椒离体组织再生中存在的问题，创建一种新的辣椒活体再生方法提高再生效率势在必行。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前辣椒离体组织再生困难，工作量大，效率低等问题，建立了一套新的活体再生方法，有效解决辣椒再生困难，提高再生效率。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种辣椒活体再生方法，包含以下步骤：

1)播种消毒后的种子,以子叶完全展开，第一片新叶长出时的幼苗作为外植体，用于辣椒活体再生；

(2)将幼苗生长点及侧芽生长点完全切除，保留子叶完整；用无菌棉包裹住切口，每天用微量移液器将380-400μL的改良MS液体培养基滴在无菌棉上，保持其湿润，促进愈伤组织的再生；

(3)处理后的植株放置于光照培养箱中，光照为10000-12000LX，光照周期为昼/夜：14-16h/8-10h，昼夜温度24-26℃/19-21℃，相对湿度70％-75％条件下培养，正常管理；28-32d后，愈伤组织上出现芽点，将无菌棉去除，40-48d再生芽伸长，58-65d长成含再生芽的新植株。

作为本发明的一种优选，所述的改良MS液体培养基配方为：含维生素的MS培养基4-5g/L+蔗糖28-30g/L+TDZ 2.0-2.5mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L，Ph 5.8。

作为本发明的进一步优选，所述的改良MS液体培养基配方为：含维生素的MS培养基4.43g/L+蔗糖30g/L+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，Ph 5.8。

作为本发明的一种优选，辣椒种子55℃温水浸种30分钟，杀菌消毒，消毒后的种子播种于装满辣椒专用育苗基质的50孔穴盘中，每穴1粒种子。

作为本发明的一种优选，处理后的植株放置于光照培养箱中，光照为12000LX，光照周期为昼/夜：16h/8h，昼夜温度26℃/20℃，相对湿度75％条件下培养，正常管理。约30d后，愈伤组织上出现芽点，将无菌棉去除，45d再生芽伸长，60d长成新的植株，新的植株有2-3个再生芽。

作为本发明的更进一步优选，所述的辣椒活体再生方法包含以下步骤：

1)辣椒种子55℃温水浸种30分钟，杀菌消毒，消毒后的种子播种于装满辣椒专用育苗基质的50孔穴盘中，每穴1粒种子，子叶完全展开，第一片新叶长出时的幼苗作为外植体，用于辣椒活体再生；

(2)用锋利的手术刀将幼苗生长点及侧芽生长点完全切除，保留子叶完整，用无菌棉包裹住切口，每天用微量移液器将400μL的改良MS液体培养基滴在无菌棉上，保持其湿润，促进愈伤组织的再生；所述的改良MS液体培养基配方为：含维生素的MS培养基4.43g/L+蔗糖30g/L+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，Ph 5.8；

(3)处理后的植株放置于光照培养箱中，光照为12000LX，光照周期为昼/夜16h/8h，昼夜温度26℃/20℃，相对湿度75％条件下培养，正常管理，30d后，愈伤组织上出现芽点，将无菌棉去除，45d再生芽伸长，60d长成新的植株，一般新的植株有2-3个再生芽。

有益效果：

本发明的发明点在于创制了辣椒活体再生方法。相比于离体组织再生方法，本发明方法无需无菌环境下操作，操作更为简单，环境要求宽松；该方法主要利用植株自身的内源激素促进芽的再生，无需花费大量时间优化培养基中激素配比，克服了离体组织再生的基因型依赖问题；利用植株自身的根系，避免了离体再生中根系再生困难及时间长的问题。本发明对辣椒材料CM334进行了再生验证，可以在2个月内成功获得再生植株，且每个植株有2-3个再生芽，效率较高。以上结果表明该方法可以用于辣椒的组织再生，为辣椒转基因技术和基因编辑奠定基础。

附图说明

图1.辣椒活体再生植株处理方式，a：待处理植株大小；b：手术刀去除生长点；c：MS液体培养基浸湿的无菌棉包裹切口。

图2.辣椒活体再生的过程,a：愈伤组织处出现芽点；b：再生芽伸长；c：再生芽伸长形成新的植株。

具体实施方式

CM334辣椒种子55℃温水浸种30分钟，杀菌消毒。消毒后的种子播种于装满辣椒专用育苗基质的50孔穴盘中，每穴1粒种子。子叶完全展开，第一片新叶长出时的幼苗作为外植体，用于辣椒活体再生(图1a)。

用锋利的手术刀将幼苗生长点及侧芽生长点完全切除，保留子叶完整(图1b)。用无菌棉包裹住切口，每天用微量移液器将400μL的MS液体培养基(MS basal medium withvitamins(PhytoTech)4.43g/L+sucrose 30g/L+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，Ph 5.8)滴在无菌棉上，保持其湿润(图1c)，促进愈伤组织的再生。

处理后的植株放置于光照培养箱中，光照为12000LX，光照周期为16h/8h(昼/夜)，昼夜温度26℃/20℃，相对湿度75％条件下培养，正常管理。

本试验中，选用辣椒材料CM334作为试验材料，转化效果如图2。利用活体再生方法在30d左右愈伤组织出现芽点(图2a)，40d左右再生芽伸长(图2b)，50d左右长成新的植株，一般新的植株有2-3个再生芽(图2c)。以上结果说明辣椒活体再生方法可以有效的形成再生植株，并且提高了再生效率，缩短了再生时间。