一种检测Rh血型抗原的方法、系统及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测Rh血型抗原的方法、系统及其应用，属于生物检测领域。

背景技术

红细胞血型是经典的人类遗传标记，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域均占据重要地位。

目前已知红细胞有43个血型系统，其中临床输血中ABO血型系统的意义最为重要，其次是Rh血型系统。Rh血型系统是人类红细胞系统中最复杂的一个血型系统，有18种表型，46个血型抗原，包含D抗原、C抗原、E抗原、c抗原、e抗原等，其中，D抗原在临床输血、母婴血型不合导致的新生儿溶血中的意义尤为重要，因此，常常以将D抗原阳性称之为Rh阳性，D抗原阴性称之为Rh阴性。

Rh血型不配合的血液输入受血者体内会刺激受血者的免疫系统产生同种抗体，这种抗体在受血者再次输血时有可能造成血管外溶血，因此，Rh血型系统中的D抗原已经被列入《临床输血技术规范》中输血前检测的必查项目。近些年，由D抗原以外的其他Rh血型抗原引起的溶血反应和交叉配血困难也屡见报道，由Rh血型系统引起的新生儿溶血也常有发生。因此，在输血前，对输血对象，尤其是对于一些需要反复输血的病人进行Rh血型系统的检测，以及，对育龄妇女、孕妇、胎儿进行Rh血型系统的检测，对于预防由Rh血型系统引起的输血后溶血以及新生儿溶血具有非常重要的意义。

血型分型可分正定型和反定型。正定型是用血型抗体去鉴定红细胞上有没有相应的血型抗原，反定型是用具有抗原的红细胞去鉴定被检者血清(血浆)中有无相应的血型抗体。目前，通用的Rh血型分型方法是利用血型抗体和红细胞在体外发生凝集反应的原理，常用的方法有试管法、微板法、微柱凝胶法等(试管法、微板法、微柱凝胶法均记载于《全国临床检验操作规程》中)。

但是，这些方法均存在缺陷，例如：

试管法需要人工进行混匀的步骤，费时费力，并且，试管法在对凝集程度进行判定时需要晃动试管，力度对检测结果易造成影响，同一份样本不同的人可能会产生不同的判定结果，尤其是对于一些弱阳性样本，容易产生人工误差；

微板法抗体和红细胞的加样量和抗体批间差异会影响结果的稳定性；

微柱凝胶法在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，气温对凝胶分子筛的大小也会产生影响，从而对最终检测结果的稳定性和可靠性产生影响。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种检测Rh血型抗原的方法，所述方法包含分型步骤；所述分型步骤为：将待分型红细胞与Rh血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞与该Rh血型抗体对应的Rh血型抗原为阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不被吸附，则待分型红细胞与该Rh血型抗体对应的Rh血型抗原为阴性。

在本发明的一种实施方式中，所述Rh血型抗体包含各物种来源的Rh血型抗体；所述各物种来源的Rh血型抗体包含各物种来源的抗人红细胞Rh系统血型抗原的IgM抗体和IgG抗体中的至少一种。

在本发明的一种实施方式中，当物种为人时，所述IgM抗体包含抗D抗体、抗C抗体、抗c抗体、抗E抗体和抗e抗体中的至少一种。

在本发明的一种实施方式中，所述其他物种第二抗体包含其他物种抗相应Rh血型抗体的二抗；所述其他物种抗相应Rh血型抗体的二抗包含其他物种抗相应Rh血型抗体的IgM抗体和其他物种抗相应Rh血型抗体的IgG抗体中的至少一种。例如，当Rh血型抗体为人源Rh血型抗体时，所述其他物种第二抗体包含羊抗人二抗和鼠抗人二抗中的至少一种，所述羊抗人二抗包含羊抗人IgM抗体和羊抗人IgG抗体中的至少一种，所述鼠抗人二抗包含鼠抗人IgM抗体和鼠抗人IgG抗体中的至少一种。

在本发明的一种实施方式中，所述分型步骤为：

将待分型红细胞和RhD血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh D阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh D阴性；

和/或，将待分型红细胞和RhC血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh C阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh C阴性；

和/或，将待分型红细胞和Rhc血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh c阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh c阴性；

和/或，将待分型红细胞和RhE血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh E阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh E阴性；

和/或，将待分型红细胞和Rhe血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh e阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh e阴性。

在本发明的一种实施方式中，所述离心的转速为90～360g、时间为1～30min。

在本发明的一种实施方式中，所述离心的转速为190～360g、时间为1～3min。

在本发明的一种实施方式中，所述分型步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待分型红细胞稀释至浓度为0.3～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述稀释步骤为：用Liss(低离子强度溶液)或生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为0.3～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述稀释步骤为：用生理盐水将待分型红细胞洗涤3～5次后，用Liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至浓度为0.3～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器中的添加量为10～100μL。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有其他物种第二抗体的容器的制备方法为：将其他物种第二抗体添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有BSA(牛血清蛋白)和Tween20(吐温-20)的缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到包被有其他物种第二抗体的容器。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液；所述BSA在缓冲液中的体积浓度为0.1～5％；所述Tween20在缓冲液中的体积浓度为0.02～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有其他物种第二抗体的容器的制备方法包含如下步骤：

包被步骤：用pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液将其他物种第二抗体稀释至浓度为0.5～10μg/mL，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；

第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到经洗涤的容器；

封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含有体积浓度为0.1～5％的BSA和体积浓度为0.02～1％的Tween20的pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到经封闭的容器；

第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到包被有其他物种第二抗体的容器。

在本发明的一种实施方式中，所述容器为微孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述微孔板为U型微孔板。

本发明还提供了利用上述方法进行检测的系统，所述系统包含包被其他物种第二抗体的容器以及Rh血型抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述容器为微孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述微孔板为U型微孔板。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有其他物种第二抗体的容器的制备方法为：将其他物种第二抗体添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有BSA和Tween20的缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到包被有其他物种第二抗体的容器。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液；所述BSA在缓冲液中的体积浓度为0.1～5％；所述Tween20在缓冲液中的体积浓度为0.02～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述包被有其他物种第二抗体的容器的制备方法包含如下步骤：

包被步骤：用pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液将其他物种第二抗体稀释至浓度为0.5～10μg/mL，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2～8℃包被8～16h，得到经包被的容器；

第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到经洗涤的容器；

封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含有体积浓度为0.1～5％的BSA和体积浓度为0.02～1％的Tween20的pH 8.9～9.8的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭1～6h，得到经封闭的容器；

第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5～7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3～5次，得到包被有其他物种第二抗体的容器。

本发明还提供了上述方法或上述系统在检测Rh血型抗原中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一种基于固相吸附的检测Rh血型抗原的正定型方法，所述方法为将待分型红细胞与Rh血型抗体添加至包被有其他物种第二抗体的容器中进行离心，离心结束后，观察待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部是否被吸附，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞与该Rh血型抗体对应的Rh血型抗原为阳性，若待分型红细胞在包被有其他物种第二抗体的容器底部不被吸附，则待分型红细胞与该Rh血型抗体对应的Rh血型抗原为阴性；所述方法与试管法相比，避免了人工操作，具有易于自动化操作和稳定性高的优势，所述方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果清晰宜读，具有灵敏度高和特异性强的优势，并且，所述方法与微柱凝胶法相比，摆脱了对价格较高的凝胶的依赖，通过5个微孔和微量抗体与样本红细胞就可以鉴定一个样本红细胞的所有Rh血型抗原，具有成本低的优势。

附图说明

图1：一种检测Rh血型抗原的方法的检测原理图。图1中，从左至右依次为：包被有其他物种第二抗体的容器，添加了待分型红细胞和Rh血型抗体的包被有其他物种第二抗体的容器，红细胞被吸附的包被有其他物种第二抗体的容器，红细胞没有被吸附的包被有其他物种第二抗体的容器。

图2：一种检测Rh血型抗原的方法的检测结果图。图2中，阳性结果为红细胞在Rh血型抗体的介导下被容器底部的其他物种第二抗体吸附，根据吸附程度的高低，阳性结果分为4+、3+、2+和1+；阴性结果为红细胞不能在Rh血型抗体的介导下被容器底部的其他物种第二抗体吸附，从而在容器底部形成圆形细胞扣。

图3：Rh血型分型实验结果图(抗C\c\E\e抗体)。

图4～5：Rh血型分型实验结果图(以试管法和微柱凝胶法为对照)。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗D)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将鼠抗人IgM抗体稀释至浓度为1μg/mL，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔250μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔250μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 9.6的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔250μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水待分型红细胞洗涤3次后，用Liss分别待分型红细胞稀释至浓度为0.5％，得到待分型红细胞悬液；

(6)检测：以每孔75μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待分型红细胞悬液，同时，以每孔25μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入人源IgM抗D抗体，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh D阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh D阴性。

实施例2：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗D)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 8.9的碳酸盐缓冲液将鼠抗人IgM抗体稀释至浓度为0.5μg/mL，得到稀释液；将稀释液以每孔120μL的添加量添加至U型微孔板后，于2℃包被8h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔200μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 6.5的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔200μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为0.1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 8.9的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭1h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔200μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 6.5的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤3次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水待分型红细胞洗涤3次后，用Liss分别待分型红细胞稀释至浓度为0.3％，得到待分型红细胞悬液；

(6)检测：以每孔90μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待分型红细胞悬液，同时，以每孔10μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入人源IgM抗D抗体，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh D阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh D阴性。

实施例3：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗D)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 9.8的碳酸盐缓冲液将鼠抗人IgM抗体稀释至浓度为10μg/mL，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型微孔板后，于8℃包被16h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔300μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔300μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为5％的BSA和体积浓度为1％的Tween20的pH 9.8的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔300μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.8的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水待分型红细胞洗涤5次后，用Liss分别待分型红细胞稀释至浓度为1％，得到待分型红细胞悬液；

(6)检测：以每孔80μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待分型红细胞悬液，同时，以每孔20μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入人源IgM抗D抗体，于360g的转速下离心3min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh D阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh D阴性。

实施例4：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗D)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法包括如下步骤：

(1)包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将鼠抗人IgM抗体稀释至浓度为5μg/mL，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；

(2)第一次洗板步骤：以每孔250μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

(3)封闭：以每孔250μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 9.6的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

(4)以每孔250μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

(5)稀释：用生理盐水待分型红细胞洗涤3次后，用Liss分别待分型红细胞稀释至浓度为0.5％，得到待分型红细胞悬液；

(6)检测：以每孔95μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入待分型红细胞悬液，同时，以每孔5μL的添加量在经洗涤的微孔板B中加入人源IgM抗D抗体，于90g的转速下离心30min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh D阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh D阴性。

实施例5～8：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗E)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法为在实施例1～4的基础上，将人源IgM抗D抗体替换为人源IgM抗E抗体；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh E阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh E阴性。

实施例9～12：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗e)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法为在实施例1～4的基础上，将人源IgM抗D抗体替换为人源IgM抗e抗体；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh e阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh e阴性。

实施例13～16：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗C)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法为在实施例1～4的基础上，将抗人源IgM抗D抗体替换为人源IgM抗C抗体；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh C阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh C阴性。

实施例17～20：一种检测Rh血型抗原的方法(Rh抗c)

本实施例提供了一种检测Rh血型抗原的方法(检测原理见图1，可能的检测结果见图2)，所述方法为在实施例1～4的基础上，将人源IgM抗D抗体替换为人源IgM抗c抗体；观察经离心的微孔板，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部被吸附，则待分型红细胞为Rh c阳性，若待分型红细胞在包被有鼠抗人IgM抗体的容器底部不发生吸附，则待分型红细胞为Rh c阴性。

实验例1：Rh血型抗原分型实验(以抗C、抗c、抗E、抗e抗体与红细胞的反应为例)

1.1实验材料

1.1.1主要试剂及耗材

试剂：人源抗D IgM抗体(效价256，购自Millipore公司)，人源抗C IgM抗体(效价32，购自Millipore公司)，人源抗c IgM抗体(效价32，购自Millipore公司)，人源抗E IgM抗体(效价32，购自Millipore公司)，人源抗e IgM抗体(效价8，购自Millipore公司)，鼠抗人IgM二抗(购自Thermofisher公司)，pH 9.6的碳酸盐缓冲液(购自Sigma公司)，pH 7.2的PBS缓冲液(购自Sigma公司)，Tween20(购自Sigma公司)、BSA(购自Thermofisher公司)，Liss(购自江苏力博医药生物技术股份有限公司)，两份未知Rh血型抗原的红细胞样本。

耗材：试管离心机，微板离心机，全自动微板操作系统，10～1000μL加样枪，U型可拆卸96孔板(购自NUNC Maxisorp公司)。

1.2Rh血型抗原分型实验方法

Rh血型抗原分型实验使用实施例5、9、13、17中的检测Rh血型抗原的方法，包含如下步骤：

1.2.1包被：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将鼠抗人IgM二抗稀释至浓度为1μg/mL，得到稀释液；将稀释液以每孔100μL的添加量添加至U型可拆卸96微孔板后，于4℃包被12h，得到经包被的微孔板；

1.2.2第一次洗板步骤：以每孔250μL的添加量在经包被的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板A；

1.2.3封闭：以每孔250μL的添加量在经洗涤的微孔板A中加入含有体积浓度为1％的BSA和体积浓度为0.02％的Tween20的pH 9.6的碳酸盐缓冲液后，于37℃封闭2h，得到经封闭的微孔板；

1.2.4以每孔250μL的添加量在经封闭的微孔板中加入pH 7.2的PBS缓冲液进行洗涤，重复洗涤5次，每次洗涤均需将微孔板中的剩余液体吸干，得到经洗涤的微孔板B；

1.2.5稀释：用生理盐水分别将两份未知Rh血型抗原的红细胞样本洗涤3次后，用Liss分别将两份未知Rh血型抗原的红细胞样本稀释至浓度为0.3％，得到两份待定型红细胞悬液；

1.2.6检测：以每孔75μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入两份待定型红细胞悬液，同时，以每孔25μL的添加量在经洗涤的微孔板B中分别加入人源抗C IgM抗体、人源抗c IgM抗体、人源抗E IgM抗体、人源抗e IgM抗体，于190g的转速下离心1min，得到经离心的微孔板；观察经离心的微孔板

1.3Rh血型抗原分型实验结果

如图3所示，每个样本4个孔，自上而下前4孔为第一个样本的检测结果，检测结果为：C阳性、c阴性、E阴性、e阳性；自上而下后4孔为第二个样本的检测结果，检测结果为：C阴性c阳性、E阳性、e阴性。

实验例2：Rh血型抗原分型方法的准确度实验

2.1实验材料

参见实验例1。

2.2Rh血型抗原分型方法的准确度实验方法

Rh血型抗原分型方法的准确度实验方法以试管法和微柱凝胶法(试管法和微柱凝胶法记载于《全国临床检验操作规程》中)为对照，采用实验例1相同的检测试剂和方法，区别在于，将两份未知Rh血型抗原的红细胞样本替换为另外两份未知Rh血型抗原的红细胞样本；观察检测结果，结果见图4～5。

2.3Rh血型抗原分型方法的准确度实验结果

如图4～5所示，使用实施例1中的检测试剂和方法对未知Rh血型抗原的红细胞样本进行Rh血型抗原分型的结果与试管法和微柱凝胶法相符(其中，图4中红细胞样本的定型结果为C+c-E-e+，图5中红细胞样本的定型结果为C-c+E+e-)。可见，使用实施例1中的检测试剂和方法对红细胞进行Rh血型抗原分型的结果准确。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。