一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法。

背景技术

根肿病是由与受到根肿菌侵染所引起的病症，对十字花科易感病作物的危害比较严重。根肿菌侵染植物的根部，引起根部异常的肿大，从而水分和营养不能被植株正常吸收，从而影响植植株。由于植株受到根肿菌的侵染，导致在生长环境条件不正常情况下对作物生长的各个时期均能造成危害。苗期受害最为严重，影响作物营养生长的同时，导致产量和品质严重下降。成株作物受侵染危害相对较轻，受害作物地上部分病状表现不明显，但随着侵染时间的增加，未被根肿菌侵染的植株表现正常，而接菌后的植株出现发黄的叶片，矮小等病状。在后期的生长过程中，会出现开花期分枝少或无分枝而导致角果数量少，从而造成产量和品质下降。根肿病的发生很难防治，传染力极强。

根肿病目前已成为十字花科蔬菜作物最严重的病害之一，十字花科蔬菜作物根肿病抗性遗传规律的研究对资源创新和抗病育种具有重要作用。目前育种者为了选出抗病品种，对大量的芸薹属作物进行了研究并对根肿病抗性基因进行了定位并且得到了与抗病位点相关的标记。芸薹属蔬菜中CR基因(根肿病抗性基因)的定位取得了很大的进展，目前已知的定位如图表1所示：

表1芸薹种中定位的抗根肿病基因

BSA称为分离体分组混合分析法或混合分组分析方法或者集群分离分析方法，是一种非常实用的省时省力的基因定位的方法。BSA在植物中是省时省力的基因标记定位的方法，它的广泛应用不仅可以仅对目标性状进行选择还可以保证其它性状的遗传背景基本相同，将外界环境以及人为可能产生影响能够被完全忽略掉，能够获得更为精准和可靠的试验数据。利用BSA法，能够将难以得到近等基因系的植物打破原有的局限性，这种方法更能够节省时间和人力物力。目前，BSA方法应用广泛，许多科研人员利用BSA方法用来研究某些作物基因的分子标记。

发明内容

本发明目的是提供一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，包括以下操作步骤：

(1)在大白菜根部接种根肿菌，接菌六周后进行抗病性调查，根肿病发生部位在根部，将洗好的植株依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级并观察记录，其中抗病性调查分4个等级，0级为根部无瘤，1级为主根无瘤、须根和侧根部分有少量小瘤，2级为主根有小瘤、侧根有较大瘤，3级为主根和侧根都膨大、并且主根瘤较大，0级和1级作为抗病植株，2级和3级为感病植株；

(2)以对大白菜抗病植株和感病植株为亲本进行自交后获得大白菜植株的F

(3)在F

(4)对大白菜抗根肿病的田间鉴定结果数据进行描述性统计分析，根据在亲本中筛出的具有多态性的标记引物，对F

具体地，上述步骤(1)中，根肿菌菌液的制备方法如下：

(1)称取新鲜或解冻的根瘤20g，用灭菌手术刀将根瘤切成1cm方块，放入250ml烧杯中，向烧杯中加入灭菌蒸馏水100ml，得到悬浮液；

(2)匀浆机5000rpm/min粉碎根瘤2-3min，医用纱布折叠8层，覆盖在250ml烧杯中；

(3)将步骤(1)烧杯中悬浮液经步骤(2)所准备的8层纱布过滤，滤液摇匀后用移液器取2μl放入1.5ml离心管，灭菌蒸馏水稀释100倍，摇匀后取稀释后菌液再次稀释10倍后用血细胞计数板计算浓度；

(4)依据滤液浓度用蒸馏水稀释至接菌所需浓度1×10

具体地，大白菜根部接种根肿菌前，根肿菌菌液于4℃下放置5-10小时，每颗大白菜接种根肿菌菌液的量为1mL。

具体地，上述步骤(2)中，对F

(1)对植株叶片的幼嫩部分进行采样，采样前对植株进行编号，在离心管上写好编号备用，将采取0.5g的新鲜叶片放入写好对应植株号码的2.0ml离心管中，放入干净的钢珠于离心管内盖好离心管，将采好的叶片保存备用；

(2)提取DNA前设置恒温水浴锅于65℃，待水温达到后将配置好的质量分数为2％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液于恒温水浴锅中进行预热处理，使其充分溶解；

(3)取出装有叶片的离心管，快速用液氮进行冷冻处理，迅速将冷冻好的叶片在样品磨样机器中进行研磨，每研磨一分钟要取出进行液氮处理，直至样品磨成粉末为止；

(4)将预热好的十六烷基三甲基溴化铵水溶液取出加入600μl缓冲液于磨好样品的离心管中，放置在恒温水浴锅中30至40min，将样品进行颠倒处理，使样品与缓冲液充分接触；

(5)水浴时间达到后，将离心管中加入600ul的抽提液，设置离心机的程序为12000rpm/min，4℃进行13min的离心过程；

(6)手保持平稳的状态取出离心好的离心管，吸取450μl的上清液于1.5ml离心管中并写好对应的植株编号，加入在-20℃放置后的无水乙醇，加入的量为吸取上清液的2倍，进行充分混匀；

(7)放置在-20℃冰箱中30min后，12000rpm/min在4℃程序下进行12min的离心；

(8)倒掉上清液，70％的无水乙醇加入500μl，12000rpm/min在4℃程序下离心3min；

(9)倒掉上清液，将开盖的离心管室温下放置或放入灭菌后的超净工作台中，10h后加入超纯水，使DNA溶解，将获得的DNA利用Themer2000酶标DNA进行纯度检测，将平均OD值在1.8-2.0的DNA溶液放在-20℃冰箱保存备用。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，以F

附图说明

图1为欧氏距离计算结果图。

图2为亲本在部分SSR引物中的多态性扩增产物的电泳图。

图3为标记sau6127在部分F

图4为多态性分子标记在第8条染色体上物理图谱(左,单位Mb)遗传图谱(右,单位cM)的位置。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，包括以下操作步骤：

1.在大白菜根部接种根肿菌，大白菜根部接种根肿菌前，根肿菌菌液于4℃下放置5-10小时，每颗大白菜接种根肿菌菌液的量为1mL，接菌六周后进行抗病性调查，根肿病发生部位在根部，将洗好的植株依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级并观察记录，其中抗病性调查分4个等级，0级为根部无瘤，1级为主根无瘤、须根和侧根部分有少量小瘤，2级为主根有小瘤、侧根有较大瘤，3级为主根和侧根都膨大、并且主根瘤较大，0级和1级作为抗病植株，2级和3级为感病植株，其中根肿菌菌液的制备方法如下：(1)称取新鲜或解冻的根瘤20g，用灭菌手术刀将根瘤切成1cm方块，放入250ml烧杯中，向烧杯中加入灭菌蒸馏水100ml，得到悬浮液；(2)匀浆机5000rpm/min粉碎根瘤2-3min，医用纱布折叠8层，覆盖在250ml烧杯中；(3)将步骤(1)烧杯中悬浮液经步骤(2)所准备的8层纱布过滤，滤液摇匀后用移液器取2μl放入1.5ml离心管，灭菌蒸馏水稀释100倍，摇匀后取稀释后菌液再次稀释10倍后用血细胞计数板计算浓度；(4)依据滤液浓度用蒸馏水稀释至接菌所需浓度1×10

2.以对大白菜抗病植株和感病植株为亲本进行自交后获得大白菜植株的F

3.在F

4.对大白菜抗根肿病的田间鉴定结果数据进行描述性统计分析，根据在亲本中筛出的具有多态性的标记引物，对F

实施例1

实施材料：供试材料的父本为‘377’，亲本‘377’抗4号生理小种，表现为高抗根肿病材料，母本为极感材料‘12A’，抗病材料‘377’与感病材料‘12A’为母本,配置杂交组合，‘377’与‘12A’为母本进行杂交获得F

大白菜根肿病抗性遗传分析：按照根肿病抗病性调查分级标准，表2是F

表2大白菜根肿病抗性鉴定结果统计

注：R:感病植株S：抗病植株；卡平方适应性检验中，X20.05＝3.84。

BSA测序数据分析：使用Illumina平台测序获得的数据为“377”F

SSR引物在感病亲本和抗病亲本基因组DNA中的多态性扩增：根据群体分离分析法，用F

多态性SSR引物在F

抗根肿病基因遗传图谱的构建及定位：在初步确定了亲本‘377’根肿病抗性基因所在A08染色体后，利用筛出的10对SSR连锁分子标记，所有引物均由武汉泓迅生物公司合成，10对引物详细信息见表3。以‘377’X‘12A’构建的F

表3定位基因的SSR标记引物信息

经过对F

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。