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新颖的酶

文献发布时间：2023-06-19 16:08:01

相关申请的交叉引用

本申请是2019年12月13日提交的美国专利申请号16/714,320的国际PCT申请，并通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及用于对活细胞基因组进行合理和直接编辑的新颖的酶。

发明背景

在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的方法不构成现有技术的权利。

对活细胞的基因组进行精确的、靶向的改变的能力一直是生物医学研究和开发的长期目标。最近，已经鉴定出允许操纵基因序列从而操纵基因功能的多种核酸酶。这些核酸酶包括核酸引导的核酸酶。然而，核酸引导的核酸酶可以识别的靶序列的范围受需要特定PAM定位于期望的靶序列附近的限制。PAM是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列，在该处gRNA/核酸酶复合体指导靶序列的编辑。用于不同的核酸引导的核酸酶的精确的PAM序列和PAM长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5’或3’。跨物种筛选存在的核酸引导的核酸酶的天然多样性可以允许发现在特定生物体中使用时具有增强的核酸酶活性或增加的裂解保真度的酶；这两种变化都可以增加核酸引导的核酸酶对某些编辑任务的多功能性。

因此，在核酸引导的核酸酶基因编辑领域中存在对具有在来自不同生物体的细胞中的不同活性和/或改变的酶保真度的改进的核酸酶的需求。本文描述的新颖的MAD系列核酸酶满足了这一需求。

发明概述

提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势将是从下面撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面明显的。

本公开内容提供了具有在来自不同生物体的细胞中的不同活性的新颖的MAD系列核酸酶。

因此，提供了新颖的MAD系列核酸酶，其具有密码子优化的核酸序列，该密码子优化的核酸序列包含与SEQ ID No.3-7、11、13、15-22和24中任一项的至少65％同源性。在一些方面，具有密码子优化的核酸序列的新颖的MAD系列核酸酶包含与SEQ ID No.3-7、11、13、15-22和24中任一项的至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。

在一些方面，新颖的MAD系列核酸酶在包含gRNA的系统中，该gRNA具有包含UGUU、UCUU或UAUU的最佳crRNA可变环。

还提供了用于在细菌中编辑的新颖的MAD系列核酸酶，其包含与SEQ ID No.4、11、15、16、17、19、21、22或24中任一项的至少80％同源性；和用于在酵母中编辑的新颖的MAD系列核酸酶，其包含与SEQ ID No.3-6、13、15-22或24中任一项的至少80％同源性。

下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。

附图简述

图1描绘了crRNA序列的最小结构，勾画了支架(可变环序列)、核酸酶靶向引导序列的位置和延伸的手柄结构。

图2是用于鉴定、产生和筛选新颖的MAD系列酶的靶向核酸酶活性的示例性工作流程。

图3显示了具有所示可变环序列的所示的MAD系列核酸酶在大肠杆菌(E.coli)中的编辑结果，如通过比色筛选galK基因座中的精确编辑评估的。

图4显示了使用具有所示可变环序列的所示的MAD系列核酸酶在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的编辑结果，如通过Can1基因座中的精确编辑诱导的在含刀豆氨酸培养基中的生长评估的。

图5显示了使用另外的可变环支架，由MAD7和MAD41在酿酒酵母中编辑的结果。

图6显示了由具有所示可变环的所示的核酸酶诱导的HEK293T人类细胞的位点特异性核酸酶裂解诱导的插入缺失的比率。

详细描述

下文结合所附的附图阐述的描述意图描述所公开主题的多种说明性实施方案。结合每种说明性实施方案描述了特定特征和功能；然而，对本领域技术人员将明显的是，所公开的实施方案可以在没有这些特定特征和功能的每一种的情况下实践。此外，除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合一种实施方案描述的所有功能意图适用于本文描述的另外的实施方案。例如，除非特征或功能与替代实施方案不兼容，否则在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。

除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、生物乳液产生和测序技术的常规技术和描述，这些都在本领域从业的人员的技术内。这样的常规的技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接以及使用标记物的杂交检测。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然，也可以使用其他等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如Green等人编著(1999),Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries(卷I-IV)；Weiner,Gabriel,Stephens,编著(2007),Genetic Variation:ALaboratory Manual；Dieffenbach,Dveksler,编著(2003),PCR Primer:A LaboratoryManual；Bowtell和Sambrook(2003),DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual；Mount(2004),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis；Sambrook和Russell(2006),Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual；以及Sambrook和Russell(2002),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,New York N.Y.；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach”1984,IRL Press,London；Nelson和Cox(2000),Lehninger,Principles ofBiochemistry第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg等人(2002)Biochemistry,第5版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,编著,John Wiley&Sons 1998)；Mammalian Chromosome Engineering–Methods and Protocols(G.Hadlaczky,编著,Humana Press2011)；Essential Stem Cell Methods,(Lanza和Klimanskaya,编著,Academic Press 2011)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸酶特异性技术可以见于，例如，Genome Editing and Engineering From TALENs and CRISPRs toMolecular Surgery,Appasani和Church,2018；以及CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren和Charpentier,2015；这两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。酶工程化的基本方法可以见于，Enzyme Engineering Methods and Protocols,Samuelson,编著,2013；Protein Engineering,Kaumaya,编著,(2012)；以及Kaur和Sharma,“DirectedEvolution:An Approach to Engineer Enzymes”,Crit.Rev.Biotechnology,26:165-69(2006)。

注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“寡核苷酸”是指一种或更多种寡核苷酸，并且提及“自动化系统”包括提及本领域技术人员已知的用于该系统的等同步骤和方法，等等。此外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、“外(outer)”仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等，仅标识如本文公开的许多部分、组件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有的出版物为了描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的设备、方法和细胞群体的目的，以引用方式并入。

在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，将那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。

在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域普通技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，尚未描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。

如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此形成氢键的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-TAGCTG-3’的区域是100％互补的。

术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。

如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸引导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点侧翼的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和大小。在许多情况下，并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。

术语“引导核酸”或“引导RNA”或“gRNA”或“crRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列和2)能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列(参见例如，图1)。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见地是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被对齐。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置数而变化。

“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列起作用以指导编码序列的表达，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。

“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、引导RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型或诱导型，并且在一些实施方案中，特别地在许多采用选择的实施方案中，核酸引导的核酸酶编辑系统的至少一种组分的转录处于诱导型启动子的控制下。

如本文使用的术语“选择标记(selectable marker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的选择标记是本领域普通技术人员熟知的。可以采用药物选择标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、鼠李糖、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，选择标记包括但不限于人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可用荧光MTX底物)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；可用荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的抗性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂白消安缀合；CD34+细胞中的化学保护性选择标记)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)的抗性的人类CAD基因；人类多耐药性-1(MDR-1；可通过增加的耐药性选择或通过FACS富集P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；可通过Mab-FITC检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；可通过卡莫司汀(carmustine)选择)；和胞苷脱氨酶(CD；可通过Ara-C选择)。如本文使用的“选择性培养基”是指向其中添加了选择选择标记或针对选择标记进行选择的化学化合物或生物部分的细胞生长培养基。

术语“靶基因组DNA序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如基因组)中的期望使用核酸引导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。

“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。如本文使用的，短语“引擎载体”包含用于本公开内容的核酸引导的核酸酶系统和方法中的核酸酶的编码序列。在细菌系统中，引擎载体还可以包含λRed重组工程系统或其等同物。引擎载体通常还包含选择标记。如本文使用的，短语“编辑载体”包含供体核酸和gRNA编码序列，所述供体核酸任选地包括对靶序列的改变，所述改变在编辑发生后阻止核酸酶在靶序列中的PAM或间隔区(spacer)处结合。编辑载体还可以包括选择标记和/或条形码。在一些实施方案中，可以将引擎载体和编辑载体组合；即，引擎载体的内容物可以在编辑载体上找到。此外，引擎载体和编辑载体包含可操作地连接至例如核酸酶编码序列、重组工程系统编码序列(如果存在)、供体核酸、引导核酸和一种或更多种选择标记的控制序列。

核酸引导的核酸酶在基因组系统中的编辑

核酸引导的核酸酶已被用于将各种生物体的基因组工程化；然而，不同生物体内的固有DNA切割活性、蛋白质表达水平、细胞毒性和活性的差异仍然是巨大的挑战，这要求在每个生物体内筛选许多进行编辑的候选酶。因此，在体外和/或体内在细菌、真菌或哺乳动物中证明具有活性的核酸引导的核酸酶是非常有用的。本公开内容提供了具有在不同类型细胞中的不同PAM偏好、改变的RNA引导的酶保真度和/或改变的细胞毒性或活性的新颖的基因编辑MAD系列核酸酶。也就是说，新颖的MAD系列核酸酶可以用于编辑不同的细胞类型，包括古细菌(archaeal)、原核细胞和真核(例如，酵母、真菌、植物和动物)细胞。

本文描述的新颖的MAD系列核酸酶改进了RNA引导的酶编辑系统，其中使用核酸引导的核酸酶(例如，RNA引导的核酸酶)来编辑生物体的基因组中的特定靶区域。与适当的合成的引导核酸在细胞中复合的核酸引导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。引导核酸有助于核酸引导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的DNA。通过操纵引导核酸的核苷酸序列，核酸引导的核酸酶可以被编程为靶向任何DNA序列用于裂解，只要适当的前间区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)在附近。

可以将新颖的MAD系列核酸酶作为多肽递送到待编辑的细胞；可选地，将编码新颖的MAD系列核酸酶的多核苷酸序列转化或转染到待编辑的细胞中。编码新颖的MAD系列核酸酶的多核苷酸序列可以针对特定细胞诸如古细菌、原核细胞或真核细胞中的表达被密码子优化。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。待采用的新颖的MAD系列核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。新颖的MAD系列核酸酶可以由载体(例如，引擎载体)上的DNA序列编码，并且处于组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，编码核酸酶的序列处于诱导型启动子的控制下，并且该诱导型启动子可以与控制引导核酸转录的诱导型启动子分开但相同；即，分开的诱导型启动子可驱动核酸酶和引导核酸序列的转录，但是这两个诱导型启动子可以是相同类型的诱导型启动子(例如，二者都是pL启动子)。可选地，控制核酸酶表达的诱导型启动子可以与控制引导核酸转录的诱导型启动子不同；即，例如，核酸酶可以处于pBAD诱导型启动子的控制下，并且引导核酸可以处于pL诱导型启动子的控制下。

通常，引导核酸(例如，gRNA)，也称为CRISPR RNA(例如，crRNA)，可以与相容的核酸引导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶指导至靶序列。gRNA可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的DNA序列编码，或者编码序列可以驻留于编辑盒内，并且处于组成型启动子的控制下，或者在一些实施方案中，在如下文描述的诱导型启动子的控制下。图1描绘了crRNA序列的最小结构，勾画了支架(可变环序列)以及核酸酶靶向引导序列的位置、假结(pseudoknot)和延伸的手柄结构。

引导核酸包含引导序列，其中引导序列是具有与靶序列足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸引导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。引导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，引导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，引导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。

在本发明的方法和组合物中，引导核酸作为待由质粒或载体表达的序列提供，并且包含引导序列和支架序列二者作为启动子控制下的，并且在一些实施方案中，诱导型启动子控制下的单一转录物。通过改变引导序列，使得引导序列与期望的靶序列互补，从而允许引导序列和靶序列之间的杂交，可以将引导核酸工程化成靶向期望的靶序列。通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由引导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对原核细胞或真核细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM或“垃圾”DNA(“junk”DNA))。

引导核酸可以是编码供体核酸的编辑盒的一部分。可选地，引导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在引擎或编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码引导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后将供体核酸插入例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码引导核酸的序列。在又其他情况下，编码引导核酸和供体核酸(例如，插入编辑盒中)的序列同时但分开插入或组装到载体中。在又其他实施方案中，编码引导核酸的序列和编码供体核酸的序列二者均包含在编辑盒中。

靶序列与PAM相关，PAM是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸引导的核酸酶的精确的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5’或3’。核酸引导的核酸酶的PAM相互作用结构域的工程化可以允许改变PAM特异性、改进保真度或降低保真度。在某些实施方案中，靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入靶序列，例如细胞的基因组DNA，又去除靶序列中的前间区突变(PAM)区，使靶序列中的前间区突变(PAM)区突变或失活。使靶序列处的PAM失活排除了对该靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续的编辑轮中随后暴露于与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶时。因此，具有期望的靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以使用与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶来选择，所述合成的引导核酸与靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的靶序列编辑和PAM改变的细胞不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且会继续生长和繁殖。

核酸引导的核酸酶系统的另一组分是供体核酸。在一些实施方案中，供体核酸与引导核酸在同一多核苷酸(例如，编辑载体或编辑盒)上，并且可以(但不必然)处于与引导核酸相同的启动子的控制下(例如，驱动引导核酸和供体核酸二者转录的单一启动子)。供体核酸被设计成用作与靶序列同源重组的模板，该靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸引导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。在许多实施方案中，供体核酸包含位于供体核酸和靶模板之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与靶序列互补的区域)。供体核酸包含与靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。

通常，供体核酸以编辑盒提供，其被插入到载体骨架中，其中载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子和gRNA编码序列，或者载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子，但不包含gRNA本身。此外，可以存在多于一个，例如两个、三个、四个或更多个引导核酸/供体核酸盒插入到引擎载体中，其中每个引导核酸处于分开的不同启动子、分开的相似启动子的控制下，或者其中所有引导核酸/供体核酸对处于单个启动子的控制下。在一些实施方案中——诸如采用细胞选择的实施方案中——驱动gRNA和供体核酸(或驱动多于一个gRNA/供体核酸对)转录的启动子是诱导型启动子。诱导型编辑的优点在于，在启动编辑前，单个化的细胞可以生长几倍至许多倍的细胞倍增，这增加具有编辑的细胞将存活的可能性，因为由有效编辑(active editing)引起的双链切割对细胞有很大毒性。这种毒性既导致编辑的集落中的细胞死亡，也导致确实存活但必须在编辑后修复和恢复(recover)的编辑的细胞生长延滞。然而，在编辑的细胞具有恢复的机会后，编辑的细胞集落的尺寸最终会赶上未编辑的细胞集落的尺寸。参见例如，2019年4月30日提交的USSN 16/399,988；2019年6月26日提交的USSN16/454,865；和2019年8月14日提交的USSN 16/540,606。此外，引导核酸可以有效指导编辑盒中多于一个供体核酸的编辑；例如，如果期望的编辑在靶序列中彼此接近。

除了供体核酸之外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。

此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含代表例如供体核酸的全基因或全基因组文库的供体核酸的集合。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码缔合。

此外，在一些实施方案中，编码核酸引导的核酸酶系统的组分的表达载体或盒还编码包含一个或更多个细胞核定位序列(NLS)诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS的新颖的MAD系列核酸酶。在一些实施方案中，新颖的核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或组合。

引擎和编辑载体包含可操作地连接至待转录的组分序列的控制序列。如以上陈述的，驱动新颖的MAD系列核酸酶编辑系统的一种或更多种组分转录的启动子可以是诱导型的，并且如果要进行选择，可能采用诱导型系统。已经开发了用于在植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中控制基因表达的许多基因调控控制系统，包括pL启动子(通过CI857阻遏物的热失活诱导)、pBAD启动子(通过将阿拉伯糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。其他系统包括四环素控制的转录激活系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，EnvironMol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达系统(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMC Biotechnology,6:43(2006))、以及他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic Acids Research,24:543-548(1996))以及其他。

通常，在活细胞中进行基因组编辑要求用进行核酸引导的核酸酶编辑所必需的组分转化细胞。例如，细胞可以用分开的引擎载体和编辑载体同时转化；细胞可能已经表达新颖的MAD系列核酸酶(例如，细胞可能已经用引擎载体转化，或者新颖的MAD系列核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中)，使得仅需要将编辑载体转化到细胞中；或者细胞可以用包含进行核酸引导的核酸酶基因组编辑所需的所有组分的单个载体转化。

可以使用各种递送系统将核酸引导的核酸酶编辑系统组分引入(例如，转化或转染)宿主细胞。这些递送系统包括酵母系统、脂质体转染系统、显微注射系统、基因枪系统、病毒微体(virosome)、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子、脂质:核酸缀合物、病毒粒子(virion)、人工病毒粒子、病毒载体、电穿孔、细胞可渗透肽、纳米粒子、纳米线、外泌体(exosome)的使用。可选地，可以使用分子特洛伊木马(trojan horse)脂质体跨越血脑屏障递送核酸引导的核酸酶组分。特别感兴趣的是电穿孔的使用，特别地流通式电穿孔(作为独立的仪器或作为自动化多模块系统中的模块)的使用，如以下中描述的：USSN 16/024,831；62/566,375；62/566,688；和62/567,697。

在将细胞用进行核酸引导的核酸酶编辑所必需的组分转化后，使细胞在促进编辑的条件下培养。例如，使用如果组成型启动子驱动新颖的MAD系列核酸酶和/或gRNA的转录，转化的细胞仅需要在典型条件下(例如，温度、CO

实施例

提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意图限制发明人视作其发明的范围，它们也不意图代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有的实验。本领域的技术人员应该明白，可以在对具体方面中所示的发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在各个方面中被认为是说明性的而非限制性的。

图2示出了用于创建和用于体外筛选新颖的MAD系列酶的示例性工作流程200。在第一步骤201，进行使用MAD7作为查询序列的计算序列同源性搜索，并选择一组推定的RNA引导的核酸酶。在步骤203，选择与MAD7具有不同水平同源性的序列进行具有大肠杆菌优化的密码子偏倚的DNA合成。所选序列包括MAD7的四个非常接近的直系同源物，命名为MAD7v1、MAD7v2、MAD7v3和MAD7v4。与MAD7差异较大的序列被命名为MAD2至MAD110。在步骤205，将这些合成基因克隆到载体骨架中，并且得到正确序列的单个菌落通过Sanger DNA测序证实。

用新颖的MAD系列酶转化的细胞排列在96孔板中207，用于储存。在步骤209，取来自每个孔的细胞的等份，并从每个等份扩增MAD系列序列。在另一步骤211，构建表达gRNA的质粒，并将其与扩增的MAD系列核酸酶组合进行体外转录和翻译，以制备活性核糖核酸酶蛋白复合体213。构建合成的靶文库215，其中测试每一个MAD系列变体的靶耗尽217。在靶耗尽之后，使用下一代测序产生用于分析的扩增子219，并进行测序数据分析221以确定靶耗尽。

将新颖的MAD系列酶编码序列克隆到pUC57载体中，其中T7启动子序列附接到编码序列的5’末端，并且T7终止子序列附接到编码序列的3’末端。

首先，使用pUC57质粒作为MAD系列模板的来源，使用Q5热启动2x主混合物(mastermix)试剂(NEB,Ipswich,MA)扩增新颖的MAD系列序列。正向引物5’-TTGGGTAACGCCAGGGTTTT[SEQ ID No.27]和反向引物5’-TGTGTGGAATTGTGAGCGGA[SEQ ID No.28]扩增了pUC57载体中新颖的MAD系列变体侧翼的序列，包括分别在新颖的MAD系列变体5’-末端和3’-末端被附接至MAD7变体序列的T7-启动子和T7-终止子组分。PCR反应中使用1μM引物和5ng/uL pUC57模板来产生编码新颖的MAD系列变体的线性dsDNA产物。使用表1所示的PCR条件：

表1：

使用

表2：

制备具有除了PCR扩增的T7-MAD系列变体之外的所有试剂的主混合物，并保持在冰上。在96孔板的每个孔中分配7.3μL的主混合物后，添加1μL在T7启动子控制下的PCR扩增的MAD系列变体。将96孔板密封，并且在热循环仪中在37℃孵育4小时。将板保持在室温直至添加靶池以进行靶耗尽反应。

孵育4小时以允许产生新颖的MAD系列变体和gRNA后，将4μL的靶文库池(10ng/μL)添加至体外转录/翻译反应混合物中。添加靶文库后，将反应混合物在37℃孵育过夜。将靶耗尽反应混合物稀释到包含RNA酶A的PCR级水中，并且然后在95℃煮沸5min。然后扩增混合物并测序。PCR条件示于表3：

表3

表4显示了体外测定的结果。

表4：

Gibson反应用150ng骨架、100ng插入物和

图3显示了具有所示的可变环序列的所示蛋白对大肠杆菌的体内编辑的结果，如通过比色筛选galK基因座中的精确编辑评估的。表5显示了体内大肠杆菌编辑的结果：

表5：

对于在体外显示活性的酶，在酿酒酵母中体内测试了基因组编辑活性。构建了具有KanMX抗性基因的两微米(two micron)质粒，用于顺序引入包含具有SNR52启动子驱动的crRNA和CYC1启动子驱动的核酸酶蛋白的编辑盒的DNA。编辑盒由引导核酸酶在特定DNA序列处切割的crRNA、短pentaT接头和修复模板组成，所述修复模板包含侧翼为与基因组同源的区域的感兴趣突变。筛选质粒通过StuI限制性内切核酸酶线性化，并且通过等温组装将编辑盒引入SNR52p启动子的下游。编辑盒(参见下表6)全部靶向CAN1基因座中的TTTV PAM序列，并引入过早终止密码子来敲除功能性Can1蛋白。

表6：测试的酵母编辑盒序列的列表

核酸酶蛋白用寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应扩增以在N末端引入SV40核定位序列，该序列由对应于MAPKKKRKVL[SEQ ID NO.26]的蛋白质序列的DNA序列ATGGCACCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTTA[SEQ ID No.25]组成。然后将所得的扩增的DNA片段(400ng，纯化的)与已经包含以上编辑盒之一的PsiI线性化筛选质粒(250ng)一起共转化，来通过体内缺口修复组装完整的编辑质粒。在包含200mg/L遗传霉素的酵母蛋白胨-右旋糖(YPD)中在加湿振荡培养箱中在30℃持续3天，选择包含修复的质粒的细胞。将所得饱和培养物以1:100至1:200稀释到不含精氨酸且包含50mg/L刀豆氨酸的合成的完全酵母培养基中，并在加湿振荡培养箱中在30℃生长过夜。由于Can1蛋白的敲除允许酵母在存在原本毒性的类似物刀豆氨酸的情况下生长，过夜培养物的相对OD600与由转化的核酸酶蛋白诱导的基因组突变率成比例。表7显示了体内酿酒酵母编辑的结果：

表7：

图4显示了使用具有所示可变环序列的所示的核酸酶的酿酒酵母的体内编辑结果，如通过Can1基因座中的精确编辑诱导的在含刀豆氨酸的培养基中的生长评估的。图5显示了使用另外的可变环支架，由MAD7和MAD41对酿酒酵母的体内编辑的结果。

将HEK293T细胞在96孔板中用2μL polyfect和各200ng的引擎质粒和编辑质粒转染。48小时后，抽吸培养基，并加入100μL含蛋白酶K(最终1mg/mL)的Taq裂解缓冲液(10XTaq裂解缓冲液：100mM Tris pH8、500mM NaCl、15mM MgCl

图6显示了由具有所示可变环的所示的核酸酶诱导的HEK293T人类细胞中的位点特异性核酸酶裂解诱导的插入缺失的比率。hsMAD7是人类密码子优化的核苷酸序列[SEQID No.53]，而MAD7表示用于大肠杆菌和酿酒酵母研究的广谱密码子使用核苷酸序列[SEQID No.1]。

表8：MAD7序列

虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，但是如结合本发明的优选的实施方案详细描述的，应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域的技术人员可以作出许多变化而不脱离本发明的精神。本发明的范围将通过附加的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,

序列表

<110> 因思科瑞普特公司

<120> 工程化的酶

<130> INSC059PCT

<140> USPCT/US20/64727

<141> 2020-12-12

<140> 16/714,320

<141> 2019-12-13

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3792

<212> DNA

<213> 直肠真杆菌(Eubacterium rectale)

<400> 1

atgaacaacg gcacaaataa ttttcagaac ttcatcggga tctcaagttt gcagaaaacg 60

ctgcgcaatg ctctgatccc cacggaaacc acgcaacagt tcatcgtcaa gaacggaata 120

attaaagaag atgagttacg tggcgagaac cgccagattc tgaaagatat catggatgac 180

tactaccgcg gattcatctc tgagactctg agttctattg atgacataga ttggactagc 240

ctgttcgaaa aaatggaaat tcagctgaaa aatggtgata ataaagatac cttaattaag 300

gaacagacag agtatcggaa agcaatccat aaaaaatttg cgaacgacga tcggtttaag 360

aacatgttta gcgccaaact gattagtgac atattacctg aatttgtcat ccacaacaat 420

aattattcgg catcagagaa agaggaaaaa acccaggtga taaaattgtt ttcgcgcttt 480

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tcatcaagca gctgccatcg catcgtcaac gacaatgcag agatattctt ttcaaatgcg 600

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gatatgaaag attcattaaa agaaatgagt ctggaagaaa tatattctta cgagaagtat 720

ggggaattta ttacccagga aggcattagc ttctataatg atatctgtgg gaaagtgaat 780

tcttttatga acctgtattg tcagaaaaat aaagaaaaca aaaatttata caaacttcag 840

aaacttcaca aacagattct atgcattgcg gacactagct atgaggtccc gtataaattt 900

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catatagtcg aaagattacg caaaatcggc gataactata acggctacaa cctggataaa 1020

atttatatcg tgtccaaatt ttacgagagc gttagccaaa aaacctaccg cgactgggaa 1080

acaattaata ccgccctcga aattcattac aataatatct tgccgggtaa cggtaaaagt 1140

aaagccgaca aagtaaaaaa agcggttaag aatgatttac agaaatccat caccgaaata 1200

aatgaactag tgtcaaacta taagctgtgc agtgacgaca acatcaaagc ggagacttat 1260

atacatgaga ttagccatat cttgaataac tttgaagcac aggaattgaa atacaatccg 1320

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atcatgaatg cgtttcattg gtgttcggtt tttatgactg aggaacttgt tgataaagac 1440

aacaattttt atgcggaact ggaggagatt tacgatgaaa tttatccagt aattagtctg 1500

tacaacctgg ttcgtaacta cgttacccag aaaccgtaca gcacgaaaaa gattaaattg 1560

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acgggggtgg aaacgtataa accgagcgcc tatatcctag aggggtataa acagaataaa 1860

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aaaaactgta ttgcaattca tcccgagtgg aaaaacttcg gttttgattt tagcgacacc 1980

agtacttatg aagacatttc cgggttttat cgtgaggtag agttacaagg ttacaagatt 2040

gattggacat acattagcga aaaagacatt gatctgctgc aggaaaaagg tcaactgtat 2100

ctgttccaga tatataacaa agatttttcg aaaaaatcaa ccgggaatga caaccttcac 2160

accatgtacc tgaaaaatct tttctcagaa gaaaatctta aggatatcgt cctgaaactt 2220

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cagaaatttg aaaccatgct catcaataaa ctcaactatc tggtatttaa agatatttcg 3000

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tgctttacat ttgactacaa taactttatt acgcaaaaca cggtcatgag caaatcatcg 3300

tggagtgtgt atacatacgg cgtgcgcatc aaacgtcgct ttgtgaacgg ccgcttctca 3360

aacgaaagtg ataccattga cataaccaaa gatatggaga aaacgttgga aatgacggac 3420

attaactggc gcgatggcca cgatcttcgt caagacatta tagattatga aattgttcag 3480

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gcattaaaag ggttatatga aattaaacaa attaccgaaa attggaaaga agatggtaaa 3720

ttttcgcgcg ataaactcaa aatcagcaat aaagattggt tcgactttat ccagaataag 3780

cgctatctct aa 3792

<210> 2

<211> 3792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类密码子优化的MAD7

<400> 2

atgaataatg gcactaacaa ctttcagaat ttcataggca tcagtagtct ccaaaagacg 60

ttgcgcaacg cacttattcc aaccgagaca actcaacagt tcatcgtgaa gaatgggatt 120

attaaagagg acgaactccg aggagagaac cggcaaattc ttaaggacat catggacgat 180

tattacagag ggtttatttc tgagacatta tcaagtattg acgacatcga ctggacctca 240

ctgttcgaga agatggaaat tcagttgaag aacggagaca acaaggacac tctaatcaag 300

gaacaaacag agtaccggaa agctatacat aagaagtttg ccaatgatga ccggtttaag 360

aacatgttct ccgcgaaact catcagcgac attctgccag aattcgtgat ccacaacaat 420

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gatatgaaag atagtctcaa ggaaatgtca ctcgaagaaa tttatagcta cgagaaatac 720

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aagttacata agcagatcct gtgtattgca gatacctcct atgaagtgcc atataagttt 900

gagtctgacg aggaagtgta tcaatccgta aatgggttcc tcgacaacat cagctctaag 960

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acaatcaata cagccctcga aatccactac aataatatcc tacccggcaa tgggaaatcc 1140

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aagcgcgagt tcatcaagaa gtttgacagc atcaggtacg actcagaaaa gaacctcttc 3240

tgtttcacat tcgattataa caactttatt actcagaata ctgtcatgag taagtcatcc 3300

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gacagagatt atgatagact aatcagtccg gttctgaacg agaacaatat cttctacgat 3600

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tttagcaggg ataagctgaa gattagtaac aaagattggt ttgactttat acagaataag 3780

cgttatctgt aa 3792

<210> 3

<211> 3792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 变体MAD7核酸序列

<400> 3

atgaacaacg gcacaaataa ttttcagaac ttcatcggga tctcaagttt gcagaaaacg 60

ctgcgcaatg ctctgatccc cacggaaacc acgcaacagt tcatcgtcaa gaacggaata 120

attaaagaag atgagttacg tggcaaaaac cgccagattc tgaaagatat catggatgac 180

tactaccgcg gattcatctc tgagactctg agttctattg atgacataga ttggactagc 240

ctgttcgaaa aaatggaaat tcagctgaaa aatggtgata ataaagatac cttaattaag 300

gaacaggcgg agaaacggaa agcaatctat aaaaaatttg cggatgacga tcggtttaag 360

aacatgttta gcgccaaact gattagtgac atattacctg aatttgtcat ccacaacaat 420

aattattcgg catcagagaa aaaagaaaaa acccaggtga taaaattgtt ttcgcgcttt 480

gcgactagct ttaaagatta cttcaagaac cgtgcaaatt gcttttcagc ggacgatatt 540

tcatcaagca gctgccatcg catcgtcaac gacaatgcag agatattctt ttcaaatgcg 600

ctggtctacc gccggatcgt aaaaaacctg agcaatgacg atatcaacaa aatttcgggc 660

gatatgaaag attcattaaa agaaatgagt ctggaagaaa tatattctta cgagaagtat 720

ggggaattta ttacccagga aggcattagc ttctataatg atatctgtgg gaaagtgaat 780

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