用GLRB基因CPG甲基化变化来诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物和其应用

技术领域

本申请要求2020年4月8日提交的韩国专利申请号10-2020-0042726的优先权，该申请全文是本申请的参考。

本发明涉及能够通过检测GLRB基因的CpG位点的甲基化水平诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物、试剂盒、核酸芯片和方法。

发明背景

结肠是消化系统的最后一部分，长度为2m，分成阑尾、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠。结直肠癌是结肠中发生的癌症，大部分对应腺癌，并且通过区域主要分成结肠癌和直肠癌。

结直肠癌甚至可在结肠/直肠任意部分发生，但约40％结直肠癌最常在直肠发生，其次约30％在直肠附近的乙状结肠中发生。由于饮食习惯变化，即使在韩国，结直肠癌发生率和所导致的死亡率显著增加，结直肠癌还作为美国和欧洲的癌相关死亡的主要病因(美国癌症协会2009年统计)。

诊断结直肠癌通过在健康检查期间进行粪便潜血试验来简单进行，但实际上需要额外检测和测试以确认结直肠癌。除了直肠指检和乙状结肠结肠镜检查外，测试主要通过结肠灌肠照片(钡灌肠照片)和结肠镜检查进行，但由于预后根据诊断时癌的进展而变化很大，早期检测结直肠癌患者对提高患者存活率极其重要。

同时，表观遗传学是在其中DNA基础序列未改变的状态下研究调节基因表达的领域。表观遗传学通过表观遗传变异如DNA甲基化和miRNA或组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，研究基因表达的调节。

在表观遗传变异中，DNA甲基化是研究最多的表观遗传变异。表观遗传变异可引起基因功能变化和肿瘤细胞变化。因此，DNA甲基化与胞内疾病的调控基因表达(或抑制和诱导)相关，近期推荐通过测量DNA甲基化的癌诊断方法。具体而言，由于癌特异甲基化即使在癌前组织中也经常事先发生，检测癌症特异甲基化很可能能用于诊断癌。

因此，需要开发结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的有效的特异性甲基化标记物，其能预测结直肠癌、直肠癌以及特征与结直肠癌类似的结直肠腺瘤的风险。

公开内容

技术问题

因此，发明人发现结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤中特定基因的CpG位点超甲基化，开发了能够检测甲基化水平诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的试剂盒、核酸芯片和方法，随后完成本发明。

本发明的一个目的是提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，包括测量特定基因的CpG位点甲基化水平的制剂。

本发明的一个目的还是提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，所述组合物由测量特定基因的CpG位点的甲基化水平的制剂组成。

本发明的一个目的还是提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，所述组合物基本由测量特定基因的CpG位点的甲基化水平的制剂组成。

本发明的另一个目的是提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的试剂盒，包含用于扩增包括特定基因的CpG位点的片段的PCR引物以及用于通过所述引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物。

本发明的另一个目的是提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的核酸芯片，其中固定了能够在严格条件下与包括特定基因的CpG位点的片段杂交的探针。

本发明的另一个目的是提供用于提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的信息的方法，所述方法包括测量患者样品的特定基因的CpG位点的甲基化水平并基于其确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生。

本发明的另一个目的是提供测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平的制剂在制备诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的制剂中的应用。

本发明的另一个目的是提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的方法，包括以下步骤：

a)从对象获得样品；

b)测量样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平；和

c)基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生。

技术方案

为了实现所述目的，本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，包含测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平的制剂。

本发明还提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，所述组合物由测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平的制剂组成。

本发明还提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，所述组合物基本由测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平的制剂组成。

为了实现本发明的另一目的，本发明还提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的试剂盒，包含用于扩增包括GLRB基因的CpG位点的片段的引物对。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的核酸芯片，其中固定了能够与包括GLRB基因的CpG位点的片段杂交的探针。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供用于提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的信息的方法，所述方法包括测量患者样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平，所述患者疑似患有结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤；和

基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供制剂在测量GLRB基因内CpG位点甲基化水平中的应用，以制备诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的制剂。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的方法，包括以下步骤：

a)从对象获得样品；

b)测量样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平；和

c)基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生。

除非另有定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。下列参考文献为技术人员提供本说明书所用多种术语的一般定义：Singleton等,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2th ed.1994)；THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.,1988)；和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。

本发明会在下文进一步详述。

本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的组合物，包含测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平的制剂。

如本文所用，术语“甲基化”指甲基附于构成DNA的碱基。本发明中，甲基化优选指甲基化是否在胞嘧啶，特定基因的CpG位点发生。当甲基化发生时，转录因子的结合受到干扰以抑制特定基因表达。相反，未甲基化或低甲基化时，特定基因表达增加。

在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了A、C、G和T以外，有称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)的第五碱基，具有附于胞嘧啶环第五碳的甲基。5-甲基胞嘧啶的甲基化仅在称为CpG的CG二核苷酸中的C出现(5’-mCG-3’)，CpG的甲基化抑制alu或转座子和基因组重复序列的表达。此外，由于CpG的5-mC天然脱氨基易成为胸腺嘧啶(T)，CpG是大部分表观遗传变化在哺乳动物细胞中最常出现的位点。

如本文所用，术语“测量甲基化水平”指测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平，且可通过根据亚硫酸氢盐处理的检测法或无亚硫酸氢盐检测法测量。甲基化水平可通过甲基化-特异性PCR检测，例如甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、实时甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR等。或者，甲基化水平可通过自动测序检测，如焦磷酸测序和亚硫酸氢盐测序，但不限于此。另外，甲基化水平可用10-11易位(TET)蛋白检测，作为无亚硫酸氢盐检测法。TET蛋白是作用于DNA且参与碱基化学变化的酶，当亚硫酸氢盐处理时，除了甲基化的C的所有C转变成T碱基，而在TET蛋白中，仅甲基化的C转变成T，从而能够有效检测。

GLRB基因的CpG位点优选指所述基因的DNA上存在的CpG位点。所述基因的DNA是包括基因表达所需的且彼此操作性连接的一系列结构单元的全部的概念，并且可包括例如启动子区、蛋白编码区(开放阅读框，ORF)和终止子区。因此，GLRB基因的CpG位点可存在于对应基因的启动子区、蛋白编码区(开放阅读框，ORF)和终止子区。

本发明中，测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平优选可指测量如下表1所示的基因的CpG位点的胞嘧啶甲基化水平。

表1

本发明中，GLRB基因的CpG位点位于基因转录起始位点(TSS)的+/-2000碱基(2kb)。

本发明中，人基因组染色体区的碱基序列根据2009年2月人参考序列(GRCh37)表示，但随着基因组序列的研究结果更新，人基因组染色体区的特定序列表达可能略有变化，本发明的人基因组染色体区的表示可根据所述变化而改变。因此，在本发明的根据2009年2月人参考序列(GRCh37)表示的人基因组染色体区中，由于人参考序列在本发明提交日期后更新，即使人基因组染色体区的表示与现在有所不同，显然本发明范围影响改变的人基因组染色体区。这些变化易由本发明所涉及领域的技术人员发现。

本发明中，测量CpG位点的甲基化水平的制剂可包括修饰胞嘧啶碱基的化合物或甲基化敏感性限制酶、特异于GLRB基因的甲基化的等位基因序列的引物以及特异于未甲基化的等位基因序列的引物。

修饰胞嘧啶碱基的化合物是修饰未甲基化的胞嘧啶或甲基化的胞嘧啶的化合物，且可以是亚硫酸氢盐或其盐，优选修饰未甲基化的胞嘧啶的亚硫酸氢钠，或修饰甲基化的胞嘧啶的TET蛋白，但不限于此。通过修饰胞嘧啶碱基来检测CpG位点是否甲基化的方法是本领域熟知的(WO01/26536；US2003/0148326A1)。

另外，甲基化敏感性限制酶可以是能够特异性检测CpG位点甲基化的限制酶，且可以是限制酶识别位点含有CG的限制酶。例如，甲基化敏感性限制酶包括SmaI、SacII、EagI、HpaII、MspI、BssHII、BstUI、NotI等，但不限于此。根据限制酶识别位点的C甲基化或未甲基化，限制酶剪切可变且可通过PCR或southern印迹分析检测。除了限制酶，甲基化敏感性限制酶是本领域熟知的。

引物可包括特异于GLRB基因的甲基化等位基因序列的引物以及特异于未甲基化的等位基因序列的引物。

本发明中，术语“引物”指有短游离3-末端羟基的核酸序列，和能够与互补模板形成碱基对的短核酸序列，并用作拷贝模板链的起始点。引物可在存在用于聚合的试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)以及4种不同三磷酸核苷的条件下在适当缓冲液和温度中起始DNA合成。另外，引物是有7-50个核苷酸的序列的有义和反义核酸，且可纳入额外特征而不改变用作DNA合成起始位点的引物基本性质。

本发明的引物优选根据特定CpG位点序列设计以分析甲基化，更优选可以是选自以下的至少一种：能够特异性扩增甲基化而不被亚硫酸氢盐修饰胞嘧啶的引物对，能够特异性扩增未甲基化而被亚硫酸氢盐修饰胞嘧啶的引物对，能够特异性扩增甲基化而被基于TET的蛋白修饰的胞嘧啶的引物对，和能够特异性扩增未甲基化且未被基于TET的蛋白修饰的胞嘧啶的引物对。

因此，本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的试剂盒，包括含用于扩增包括GLRB基因的CpG位点的片段的引物对。

在组合物和试剂盒中，除了所述制剂，还可以额外包括聚合酶、琼脂糖、电泳所需的缓冲溶液等。

另外，本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的核酸芯片，其中固定了能够与包括GLRB基因的CpG位点的片段杂交的探针。

本发明中，术语“核酸”指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其片段，单链或双链基因组或者合成来源的DNA或RNA，有义或反义链基因组或者合成来源的DNA或RNA，肽核酸(PNA)或者天然或合成来源的DNA或RNA类似物质。如果核酸是RNA，本领域技术人员清楚，核糖核苷酸A、G、C和U分别取代脱氧核苷酸A、G、C和T。

由于甲基化起始于基因的调控位点外并推进到其内部，参与细胞转化的基因可通过检测调控位点外的甲基化而早期诊断。

因此，用甲基化基因标志物能够早期诊断可能形成结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的细胞。当癌细胞中确认甲基化的基因在临床或形态表观正常的细胞内甲基化时，表观正常细胞正在癌化。因而，由于结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤特异性基因在表观正常细胞中的甲基化得到确认，可能早期诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤。

另外，本发明提供用于提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的信息的方法，所述方法包括测量患者样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平，所述患者疑似患有结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤；和

基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生。

检测甲基化水平的方法可选自：PCR，甲基化特异性PCR，实时甲基化特异性PCR，使用甲基化DNA特异结合蛋白的PCR，用甲基化敏感性限制酶测量是否有甲基化，定量PCR，DNA芯片，焦磷酸测序和亚硫酸氢盐测序，但不限于此。

具体地，甲基化特异性PCR是设计和使用不同类型引物的方法，取决于引物中的CpG二核苷酸是否甲基化以在亚硫酸氢盐处理样品DNA后进行PCR。如果引物结合位点已经甲基化，PCR通过甲基化引物进行，如果未甲基化，PCR通过正常引物进行。即，甲基化特异性PCR方法是用亚硫酸氢盐处理样品DNA、同时用2类引物进行PCR并比较结果的方法。

实时甲基化特异性PCR将甲基化特异性PCR方法转变成实时测量方法并通过用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，设计对应甲基化的PCR引物并使用这些引物进行实时PCR。此时，有2种方法：用与扩增的碱基序列互补TaqMan探针的检测方法和用SYBRgreen的检测方法。因此，实时甲基化特异性PCR可选择性仅定量分析甲基化的DNA。此情况中，实时甲基化特异性PCR是如下的方法：用体外甲基化DNA样品制备标准曲线，通过扩增碱基序列中无5’-CpG-3’的基因来定量分析甲基化水平，其共同作为标准化的负对照。

在用甲基化敏感性限制酶的甲基化检测方法中，甲基化敏感性限制酶采用CpG二核苷酸作为作用位点，且当此位点甲基化时不起酶的作用。因而，当样品DNA用甲基化敏感性限制酶处理并随后由PCR扩增以纳入酶靶位点时，在甲基化位点的情况中，限制酶不起作用，但由PCR扩增，但未甲基化的正常位点被限制酶剪切，而不由PCR扩增，从而检测特定DNA位点的甲基化。

在用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR或DNA芯片方法中，当特异性仅结合甲基化的DNA的蛋白与DNA混合时，蛋白仅特异性结合甲基化的DNA，从而仅甲基化的DNA被选择性分离。基因组DNA与甲基化DNA特异性结合蛋白混合后，仅甲基化DNA被选择性分离。此方法是使用对应于内含子位点的PCR引物扩增这些分离的DNA，随后通过琼脂糖凝胶电泳测量甲基化的方法。另外，甲基化甚至可通过定量PCR测量，并且通过甲基化DNA特异性结合蛋白分离的甲基化的DNA用荧光染料标记并与整合有互补探针的DNA芯片杂交以检测甲基化。在此，甲基化DNA特异性结合蛋白不限于MBD2bt。

另外，经亚硫酸氢盐处理DNA的焦磷酸测序是基于下列原理。当甲基化在CpG二核苷酸位点发生时，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，此情况中，修饰碱基在亚硫酸氢盐处理后变成尿嘧啶。如果CpG二核苷酸在提取自样品的DNA用亚硫酸氢盐处理时已经甲基化，则CpG二核苷酸保留为胞嘧啶且剩余未甲基化胞嘧啶变成尿嘧啶。经亚硫酸氢盐处理的DNA的测序可优选用焦磷酸测序法进行。焦磷酸测序的详细描述是本领域已知的[Ronaghi等,Science1998年7月17日,281(5375),363-365；Ronaghi等,Analytical Biochemistry 1996年11月1日,242(1),84-9；Ronaghi等.Analytical Biochemistry 2000年11月15日,286(2):282-288；Nyr,P.Methods Mol Biology 2007,373,114]。

同时，通过使用TET蛋白的无亚硫酸氢盐的检测法，仅甲基化的C可用TET蛋白转变成T，以检测在甲基化区域的碱基(参见LIU,Yibin等,Nature Biotechnology卷37,第424-429页(2019))。

当甲基化在CpG二核苷酸位点发生使得胞嘧啶形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)时，CpG二核苷酸在用10-11易位(TET)蛋白处理变成尿嘧啶时已经甲基化，未甲基化的胞嘧啶被保留。经TET处理DNA的测序不仅限于焦磷酸测序法，但可用诸如甲基化敏感PCR(MSP)、微阵列、下一代测序(NGS)等方法进行。

优选地，本发明的用于提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的信息的方法可通过包括以下步骤的方法进行：a)从对象获得样品，b)从样品获得基因组DNA，c)用修饰未甲基化的胞嘧啶碱基的化合物处理所得的基因组DNA，d)通过PCR扩增经处理的DNA获得PCR产物，所述PCR使用用于焦磷酸测序的能够扩增GLRB基因的启动子的引物进行，和e)通过使用测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序检测甲基化水平。

步骤b)中获得的基因组DNA可用苯酚/氯仿提取法、SDS提取法、CTAB分离法或本领域常用的市售可得的DNA试剂盒进行。

本发明中，“基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生”可以是如下确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生：测量患者样品GLRB基因的CpG位点的甲基化水平，所述患者疑似患有结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤，同时或依序测量正常对照样品中相同基因的CpG位点的甲基化水平，随后比较2个甲基化水平。另外，结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生可如下确定：事先测量正常对照样品中GLRB基因的CpG位点的甲基化水平以设置阈值，然后将所述阈值与测量患者样品的甲基化水平的值进行比较。当事先测量正常对照样品中GLRB基因内CpG位点的甲基化水平以设置阈值，而不需每次就各诊断测量正常对照的甲基化水平时，能仅通过检测患者样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平提供迅速诊断对应患者结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的信息。

本发明中，术语“样品”指广泛范围的体液，包括获自个体的所有生物学液体、体液、细胞系、组织培养物等，取决于待进行的分析类型。从哺乳动物获得体液和组织活检的方法一般广为人知，且本发明中，样品可优选选自人衍生物，包括组织、细胞、血液、血浆、血清、粪和尿。由于肿瘤组织的异常甲基化变化显示与获自生物学样品如细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液或尿的基因组DNA甲基化变化的显著相似性，在用本发明标志物的情况下，涉及预测结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生时，优势在于可能通过血液、体液等容易地诊断。

本发明提供测量GLRB基因的CpG位点的甲基化水平的制剂在制备用于诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的制剂中的应用。

本发明提供诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的方法，包括以下步骤：

a)从对象获得样品；

b)测量样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平；和

c)基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生。

一方面，本发明提供诊断和治疗对象结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的方法，包括下列步骤：

i)从对象获得样品；

ii)测量样品的GLRB基因的CpG位点的甲基化水平；

iii)基于所测量的甲基化水平确定结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的发生；和

iv)通过给所确定的对象施用用于治疗膀胱癌治疗性药物或通过手术治疗结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤。

在上述包括步骤a)-c)的方法基础上理解包括步骤i)-iv)的方法。

步骤iv)是通过给其中在步骤iii)中诊断了疾病的对象施用治疗性药物或通过手术来治疗疾病的步骤。

本发明术语“治疗”全面地涉及改善结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤或其症状，且可包括治疗或基本预防这些疾病，或改善其病症并包括缓解、治疗或预防衍生自结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的一个或大部分症状，但不限于此。

“治疗性药物”的类型不具体限制，只要治疗性药物是一般用于治疗结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的任何药物类型。另外，治疗性药物以“治疗有效剂量”给对象施用，用于患者的治疗有效剂量可由本领域技术人员考虑多种因素确定，如年龄、体重、健康状况、患者性别、疾病严重性、饮食和排泄率以及独特性质、施用途径和药物的治疗数目。治疗性药物的施用途径不具体限制，治疗性药物可口服或胃肠外施用，施用途径包括局部施用和全身施用。胃肠外施用不限于此，但可以是例如鼻内药物应用、皮下注射等，并且作为另一示例，可使用诸如肌肉注射、静脉注射等。

本发明的“样品”分离和获自疑似患病对象，但不限于此，但可选自细胞、组织、血液、血清、血浆、唾液、痰、粘液和尿。“对象”可以是动物，优选包括哺乳动物在内的动物，尤其是人，且可以是衍生自动物的细胞、组织、器官等。对象可以是需要治疗效果的患者。

本文所用术语“包含”与“包括”或“其特征在于”以相同含义使用，并且不排除在根据本发明的组合物或方法中未特别提及的额外成分或方法步骤。除非另外描述，术语“由...组成”意味着排除额外元素、步骤和成分等。术语“基本由...组成”意味着除了组合物或方法范围内所述的材料或步骤外，包括未实质影响其基本特性的材料和步骤。

有利效果

如上所述，由于GLRB基因内的CpG位点的超甲基化在结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤中特异性显示，使用本发明所述组合物、试剂盒、芯片或方法不仅可能准确快速，而且早期诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤。

附图简要说明

图1阐明在总共32种癌症类型中确认GLRB基因甲基化信息的结果。

图2阐明确认根据本发明选定的GLRB基因诊断结直肠癌的准确性的结果。

图3阐明确认在结直肠癌肿瘤组织(肿瘤)细胞系组与非结直肠癌肿瘤组织(其他)细胞系组之间的甲基化差异的结果。

图4阐明确认在结直肠腺瘤中的肿瘤组织(癌症)、结直肠腺瘤组织(腺瘤)和正常组织(正常)之间的甲基化差异的结果。

图5阐明确认在结直肠腺瘤中的肿瘤组织(癌症)与肿瘤邻近正常组织(非肿瘤)之间基于qMSP的甲基化差异的结果。

图6阐明确认作为比较实施例的OPLAH基因的甲基化信息的结果。

图7阐明基于微滴式数字PCR(ddPCR)确认在结直肠腺瘤(腺瘤)、肿瘤组织(肿瘤)和肿瘤邻近正常组织(非肿瘤)之间的甲基化差异的结果。

图8阐明在正常人和结直肠癌患者的血清中用微滴式数字PCR(ddPCR)分析甲基化差异的结果。

发明模式

下文推荐优选实施例以协助理解本发明。然而，下列实施例仅提供用于更易理解本发明且本发明内容不受实施例限制。

实施例1：筛选结直肠癌特异性甲基化基因

为筛选结直肠癌中特异性发现的甲基化基因，实施对获自结直肠癌患者癌手术的肿瘤组织与正常组织之间甲基化的大规模比较研究，使用2个大规模甲基化微阵列芯片(见表2)。用于对应研究的肿瘤组织指结直肠癌的肿瘤组织，非肿瘤组织指不是肿瘤组织的组织，包括正常组织。

表2

为了筛选结直肠癌特异性甲基化基因，从各组织提取DNA，遗传区域的甲基化水平用Infinium人甲基化450Beadchip微阵列确认。

提取自各组织的DNA通过亚硫酸氢盐处理转化。通过此，胞嘧啶碱基根据DNA区的甲基化而被修饰。用于对应微阵列实验的探针特异于甲基化和未甲基化设计以确认基因甲基化区域的胞嘧啶碱基是否被修饰。

微阵列实验通过代表各基因甲基化区的约450,000(450k)探针来检测基因甲基化水平，源自实验的各探针结果呈现为β值。β值具有0-1的值，确定越接近1，对应的遗传区域的甲基化水平越高。

为了鉴定肿瘤组与非肿瘤组之间的差异甲基化区(DMR)，通过使用经验贝叶斯t检验，微阵列数据(Limma)线性模型法，鉴定了组之间甲基化有统计学显著性差异的遗传区域。

已知Limma方法受数种甲基化统计分析方法的离群值影响最小，以鉴定组之间的差异。因此，所述方法是发现特异性标志物的合适方法，因为该方法不太受一些样品的异常测量值影响。本实验中，确定2个组之间的甲基化有显著差异，因为衍生自Limma方法的经调整的p值较小。

特定地，为了在肿瘤组与非肿瘤组之间β值有显著差异的遗传区域中搜索肿瘤特异性甲基化区域，肿瘤组织的甲基化高于非肿瘤组织的区域被选为癌症特异性生物标志物候选物。

因此，作为2个数据集中每一个的Limma分析的结果，相较于非肿瘤组，当比较肿瘤组时，有显著低p值(P值最低的前10％)且组之间β值为0.2或更高的大差异的遗传区域被选为肿瘤特异性超甲基化区。由此，在约450,000个遗传区域中，2个数据集内通常显示肿瘤特异性超甲基化的3,878个遗传区域被选为生物标志物候选物。

实施例2：筛选结直肠癌特异性超甲基化基因

在实施例1鉴定的作为生物标志物的3,878个遗传区域中，鉴定了并对比不是结直肠癌的肿瘤的各对应区域的甲基化水平，以发现生物标志物中结直肠癌或结直肠腺瘤特异性遗传区域。作为分析公开癌症基因数据库癌症基因组图谱(TCGA)的DNA甲基化450k阵列测试结果的结果，确认了对应于32种癌症类型的遗传区域的甲基化信息。其中，作为确认结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤中β值显著高于其他30种不是结直肠癌和直肠癌的癌症类型的遗传区域的结果，确认了在3,878个遗传区域中GLRB基因的遗传区域引起特异于结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的甲基化。

基因的甲基化水平如图1所示，这是通过对于所述基因的对肿瘤组织(结直肠癌的肿瘤组织)和非肿瘤组织(包括正常组织的肿瘤组织以外的组织)进行微阵列实验获得的。在甲基化水平中，源自实验的各探针结果表示为β值，且β值具有0-1的值，确定越接近1，对应的遗传区域的甲基化水平越高。

同时，在遗传区域情况下，当结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的肿瘤组织与非肿瘤组织比较观察到甲基化差异时，甲基化甚至还可在不是结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的癌症发生。即，不确定是结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤特异性甲基化。

例如，在5-羟脯氨酸酶(OPLAH,ATP-水解)基因情况下，在实施例1鉴定的3,878个遗传区域中，有一个在肿瘤组织与非肿瘤组织之间有最大甲基化差异，但如图5所示，确认高甲基化在除了急性髓性白血病、眼部黑色素瘤、嗜铬细胞瘤&副神经节瘤、胸腺瘤、甲状腺癌等的所有癌类型中发生。

32种癌类型如下：急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、大B细胞淋巴瘤、肝癌、低级别胶质瘤、肺腺癌、黑色素瘤、间皮瘤、眼部黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤&副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、胃癌、睪丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌和子宫癌肉瘤。

这些遗传区域中，当对应区域不是假基因时，存在CpG岛位点，位于选择离基因转录起始位点(TSS)+/-2000碱基(2kb)的遗传区域，存在于常染色体，对应区域选择为结直肠癌特异性超甲基化基因。因此，如下表3所示，选择一个基因(见图1)。

表3

实施例3：在细胞系中确认选定基因的结直肠癌特异性

为确认选定的GLRB基因是否显示对结直肠癌或直肠癌特异性的、区别于其他癌症的甲基化，主要衍生自14个组织的1,022个癌细胞系中的甲基化模式用公开数据库分析。对于对应的数据，根据厂商标准化甲基化分析测试过程，对提取自各细胞系的DNA进行Infinium人甲基化450Beadchip微阵列实验。

在所进行的实验的结果值中，基因的甲基化水平如实施例1通过约450,000探针测量，各探针的甲基化值如β值所示。β值具有0-1的值，确定越接近1，对应的遗传区域的甲基化水平越高。

14个组织如下：上呼吸消化道、血液、骨头、乳腺、消化系统、肾、肺、神经系统、胰腺、皮肤、软组织、甲状腺、泌尿生殖系统和其他组织。

为确认选定的GLRB基因的结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤特异性甲基化，源自1,022个细胞系的甲基化数据主要分类成结直肠癌细胞系组(n＝51)与非结直肠癌细胞系组(n＝971)。

为了鉴定2个分类组之间的差异甲基化区(DMR)，通过用经验贝叶斯检验，微阵列数据(Limma)线性模型法，鉴定了组之间有统计学显著的甲基化差异的遗传区域。

表4、结直肠癌细胞系组与非结直肠癌细胞系组之间的选定的GLRB基因的甲基化差异

甚至在用细胞系的分析中，确认了相较于其他癌细胞系，GLRB基因在甚至结直肠癌和直肠癌细胞系中具有显著更低的调整p值，是结直肠癌特异性。

实施例4：结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤的诊断标志物候选物的诊断表现评估

为确认选定的基因作为诊断标志物在结直肠癌中的有效性，评估根据甲基化水平诊断结直肠癌的准确性。

为了评估诊断准确性，使用敏感性和特异性。接受者操作特征(ROC)曲线代表根据截断值的敏感性和特异性变化，可通过对于连续诊断试验测量值的可行截断值计算敏感性和特异性值而显示。诊断准确性可通过ROC曲线下面积(AUC)测量。AUC值具有0.5-1的值，经评估，值越高，诊断准确性越高。如果AUC值是1，意味着诊断结果是完全准确的测试，但如果AUC值是0.5，确定诊断结果与随机结果相同。

作为根据非肿瘤组织与肿瘤组织之间甲基化水平分析癌症分类的准确性的结果，所述分析通过使用收集的甲基化数据集使用所选定的基因进行，如图2所示，确认所有选定基因具有0.920或更高的曲线下面积(AUC)，具有高诊断准确性，从而所选定的基因用于诊断结直肠癌。

实施例5：确认所选定的基因的腺瘤中的甲基化

腺瘤是处于发展到结直肠癌前阶段的疾病，大部分结直肠癌发生自腺瘤。因此，早期诊断结直肠癌需要快速检测腺瘤。为确认通过先前研究选择的超甲基化生物标志物是否甚至在腺瘤中显示超甲基化特征，检测选自64个结直肠癌肿瘤组织、42个结直肠腺瘤组织和41个非肿瘤组织的基因的超甲基化特征。

作为源自人甲基化450Beadchip微阵列实验的甲基化数据的分析结果，如图4所示，确认所选定的基因不仅在结直肠癌中，而且在结直肠腺瘤中显示与非肿瘤组织相比相同的显著超甲基化特征模式。

因此，发现可使用所选定的基因，甚至用于诊断结直肠腺瘤以及结直肠癌。

实施例6：测量组织中所选定的基因的基于qMSP的甲基化

为确认肿瘤组织中GLRB基因的结直肠癌和腺瘤特异性甲基化，肿瘤组织与非肿瘤组织之间的甲基化差异用甲基化特异性定量PCR(qMSP)技术测量。为此，基因组DNA分离自12个结直肠癌患者的肿瘤组织与肿瘤邻近组织对以及4个腺瘤患者的肿瘤组织，并用亚硫酸氢盐处理，然后根据通用qMSP实验方法观察GLRB特异性遗传区域的扩增和甲基化水平。

另外，使用特异性结合亚硫酸氢盐修饰遗传区域的ACTB基因，其被扩增且不涉及甲基化，以使对应区的扩增值标准化。

通过PCR扩增的亚硫酸氢盐修饰的DNA的甲基化水平表示为ΔCt，这是用作为内对照的ACTB循环阈值(Ct)调整的值。ΔCt如下定义。

ΔCt＝ACTB基因的Ct值-待检测基因Ct值

如图5所示，确认GLRB基因的甲基化相较于肿瘤邻近的正常组织具有相对高的ΔCt值，无论结直肠癌组织的肿瘤阶段如何，且尤其在作为癌症前期的腺瘤中具有非常高的ΔCt值，从而GLRB基因在结直肠癌和结直肠腺瘤中超甲基化。此结果实际显示，所选定的GLRB基因的甲基化作为诊断(特别是早期诊断)结直肠癌的生物标志物是有效的。

因此，发现所选定的基因甚至可用于诊断结直肠腺瘤以及结直肠癌。

实施例7：测量组织中所选定的基因的基于数字PCR的甲基化

肿瘤组织与非肿瘤组织之间的甲基化差异用数字PCR技术测量，其显示相较于一般实时PCR方法的优良检测敏感性。为此，基因组DNA分离自16个结直肠癌患者的肿瘤组织和肿瘤邻近组织的对(通过肿瘤分期的4对)以及5个腺瘤患者的肿瘤组织，并用亚硫酸氢盐处理，然后根据微滴式数字PCR(ddPCR)方法观察GLRB特异性遗传区域的扩增和甲基化水平。

ACTB基因用作亚硫酸氢盐修饰遗传区域和用PCR扩增遗传区域的内对照。

通过ddPCR扩增由亚硫酸氢盐修饰的cfDNA的甲基化水平计算为拷贝数。

如图7所示，无论结直肠癌组织的肿瘤阶段如何，确认GLRB基因的甲基化相较于肿瘤邻近正常组织具有相对高拷贝数，且尤其在作为癌症前期的腺瘤中具有非常高的拷贝数，从而GLRB基因在结直肠癌和结直肠腺瘤中超甲基化，如同用实时PCR的结果一样。此结果显示，不仅可以通过实时PCR，而且可以通过数字PCR有效检测所选定的GLRB基因的甲基化。

因此，发现所选定的基因能用多种分子生物技术诊断。

实施例8：在血浆中测量基于数字PCR的甲基化

为确认结直肠癌在血液样品中的特异性甲基化，结直肠癌患者与正常人之间的甲基化差异用ddPCR检测。为此，无细胞DNA(cfDNA)如下分离：收集来自10个结直肠癌患者的血浆样品和来自正常人的血浆样品，并用亚硫酸氢盐修饰，然后根据ddPCR方法观察GLRB特异性遗传区域的扩增和甲基化水平。

如图8所示，显示相较于正常人，GLRB基因的甲基化在结直肠癌血浆样品中表现出高甲基化水平，并且可以100％准确性测量。此结果显示，不仅基于组织并且基于血液，所选定的GLRB基因的甲基化对于诊断结直肠癌是有效的。

工业实用性

如上所述，由于GLRB基因的CpG位点超甲基化在结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤中特定显示，能够不仅准确快速，而且早期诊断结直肠癌、直肠癌或结直肠腺瘤，使用本发明所述组合物、试剂盒、芯片或方法。