一种基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器

技术领域

本发明提供了一种基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器，属于检测分析技术领域。

背景技术

DNase I是一种能裂解DNA分子磷酸二酯键的酶。DNase I存在于血液、尿液、汗液和其他体液中，它参与人体的各种生理过程，包括基因重组、DNA修复和DNA消化。同时，它也是基因组DNA探针、DNA模板消化和体外高通量测序的重要工具酶。DNase I的活性与许多疾病密切相关。临床研究表明，DNase I可以减轻呼吸道症状的恶化，抑制肿瘤细胞的增殖、转移，并增强细胞凋亡。最近的研究表明，胃癌和结直肠癌与DNase I活性降低密切相关。与此同时，DNase I目前在临床上用于治疗支气管扩张症、肺脓肿、囊性肺纤维化和与粘膜效应相关的口腔疾病。此外，它被认为是系统性红斑狼疮和心肌梗死面积的一个有希望的预测指标。这些研究表明，DNase I检测平台可以成为早期临床诊断的有力工具。DNase I的检测在临床上具有重要意义。

适配体是指能够特异性结合目标分子的单链核苷酸序列，通过“配体系统进化的指数富集”从随机单链核酸库中筛选出来。适配体可以通过核苷酸-碱基互补配对、氢键、π-π堆叠、静电力等相互作用，在自适应折叠后形成特定的三维结构。这种三维结构可以通过分子间作用力与目标分子特异结合。由于适配体与靶标结合的高度特异性和亲和力，以及易于大规模合成和灵活化学修饰的优点，近年来适配体作为一种新的分子识别元件被广泛应用于分析和传感领域。级联反应是指一系列连续的反应过程，可以将两个或多个反应集成在一起。前一反应的产物可在后续反应中消耗或影响后续反应。在生物传感器领域，由于级联反应具有信号放大和信号传输的优点，级联反应的设计和实现引起了研究人员的浓厚兴趣。其中，凝血酶适配体由于抑制凝血酶活性，在调节级联反应方面有着巨大的潜在应用。

在过去的研究中，已经设计并成功应用了许多DNase I检测方法，例如经典的荧光检测和凝胶电泳方法、电化学方法以及与纳米材料相结合的化学发光方法。尽管这些方法高度敏感和可靠，但成本高、耗时长，其中一些方法甚至需要有毒标记物。因此，开发一种简便、快速的DNase I检测新技术具有重要意义。

即时诊断（POCT）技术产品降低了对配套设备和操作专业性的要求，可用于现场快速检测和疾病前期筛查诊断，可应用到基层医疗单位或在资源有限的偏远地区实现患者在家中实现自检。生物传感器因其操作简单、灵敏度高、特异性好等优点，在POCT器件的开发中具有巨大潜力。生物传感器有多种构筑材料，如纳米材料、电子芯片和纸张。其中，纸张因其低成本和易于操作而在便携式生物传感器的开发中特别具有吸引力。目前，纸质生物传感器已应用于检测各种分析物，如酶、蛋白质、核酸和病原体。特别是基于距离的纸质传感器。它可以通过简单地测量距离的变化，直观地量化检测目标物。由于其良好的成本效益、简单的操作和快速的数据分析，纸基生物传感器引起了极大的关注。

综上所述，开发一种利用纸基，能够简单快速、灵敏检测DNase I的生物传感检测平台在实际应用中有着重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器。在无需复杂的仪器和操作程序的情况下，实现对DNase I的即时检测。

本发明通过以下技术方案实现的：

一种基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器，其构筑步骤如下：

（1）将凝血酶溶于缓冲溶液中，得到凝血酶溶液；将凝血酶适配体干粉溶于缓冲溶液中，得到适配体溶液；

（2）在0.5 ml冻干兔血浆中加入250 μL PBS缓冲溶液，均匀溶解得到兔血浆溶液；

（3）将DNase I溶解于缓冲液中，得到梯度浓度的DNase I标准溶液；

（4）将5μL适配体溶液添加到5μL DNase I溶液中，充分混合，并在37°C下培养30分钟。孵育后，向孵育液中加入10μL凝血酶溶液，得到20μL混合溶液。

（5）将混合物溶液在37°C下培养30分钟。培养后，向每个含有不同浓度DNase I的20μL混合物溶液中添加10μL兔血浆溶液，以获得30 μL待测溶液。

（6）将在25℃下孵育5分钟。为了更好地将待测溶液中的流动相水溶液与凝胶状态的血块分离，将待测溶液放置在离心机中离心60 s。最后，将上层的流动相水溶液吸出并滴到PVC基板上，并将pH指示条快速放置在液滴上。指示条上的水印区域没有变化后，使用智能手机拍照记录实验结果，并记录纸条上的水印爬行距离，绘制DNase I检测标准曲线。

（7）将含DNase I的待测样品溶解于缓冲溶液中，得到待测样品溶液，按照步骤（4）所述的方法测定待测样品混合物在pH试纸条上的移动距离，对照DNase I标准曲线，得到待测样品中DNase I的含量。

根据本发明优选的，步骤（1）中，所述凝血酶缓冲液配方为50 mM Na

根据本发明优选的，步骤（1）中，所述凝血酶溶液浓度为1 mg/mL。

根据本发明优选的，步骤（1）中，所述适配体缓冲液配方为50 mM Na

根据本发明优选的，步骤（1）中，所述适配体序列为AGAAAGGAGAGAGA

根据本发明优选的，步骤（1）中，所述适配体溶液浓度为20 μM。

根据本发明优选的，步骤（3）中，所述DNase I缓冲液配方为10 mM Tris-HCl, 2.5mM MgCl

根据本发明优选的，步骤（6）中，离心转速为4000 r/min。

根据本发明优选的，步骤（6）中，所述pH指示条为广范试纸条，尺寸为4.5 mm×60mm。

根据本发明，上述基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器，用于非疾病诊断血清中DNase I的检测。

本发明的检测原理如下：

在待测溶液中，当不存在DNase I时，凝血酶适配体可以特异性地结合凝血酶并有效抑制凝血酶活性，因此待测溶液保持液态，不能形成凝胶状态的血块。相反，当存在DNaseI时，适配体链被DNaseⅠ水解，不能正常结合凝血酶以抑制凝血酶活性，因此凝血酶能够正确凝结血浆并生成凝胶状态的血块，待测溶液发生分层现象。相应的，待测溶液中的流动相的体积减少。基于这一原理，我们开发了一种基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNaseI生物传感器，用于肉眼定量检测DNase I。在存在DNase I和不存在DNase I的这两种情况下，待测溶液中流动相水溶液的相对体积发生显著变化。水溶液的体积可以通过pH指示条进一步确定。DNase I的浓度可以通过测量指示条上水印的长度来量化。

有益效果

1、本发明提供的基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器，具有操作过程简单，成本低，试剂消耗少等优点，DNase I的检测限为0.2 U/mL，有效地解决了现有检测方法复杂、成本高的问题，为临床诊断和应用提供了发展前景。

2、本发明提供的基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器，可实现通过视觉读出含DNase I混合物在试纸条上流动的距离来对DNase I进行定量。将DNase I的浓度并与混合物在试纸条上爬行的距离建立间接关系，从而实现在不依赖复杂仪器的情况下，仅依靠纸基试纸条就能够实现快速定量、简单即时地检测DNase I。

附图说明

图1为基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器原理示意图。

图2为实施例1中纸基生物传感器对不同浓度凝血酶溶液的响应照片。

图3为实施例2中纸基生物传感器对不同浓度适配体溶液的响应照片。

图4为实施例3中纸基生物传感器对不同浓度DNase I溶液的响应照片。

图5为实施例3中DNase I浓度对灰度（

图6为实施例4中检测血清中DNase I的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明保护范围不限于此。

以下实施例中，凝血酶上海麦克林生化有限公司有售，DNase I北京索莱宝科技有限公司有售，适配体由上海生工生物工程公司合成。

若无其他特殊说明，本实施例中涉及的药品及试剂均为普通市售产品。

本发明检测方法的原理如图1所示，在待测溶液中，当不存在DNase I时，凝血酶适配体可以特异性地结合凝血酶并有效抑制凝血酶活性，因此待测溶液保持液态，不能形成凝胶状态的血块。相反，当存在DNase I时，适配体链被DNaseⅠ水解，不能正常结合凝血酶以抑制凝血酶活性，因此凝血酶能够正确凝结血浆并生成凝胶状态的血块，待测溶液发生分层现象。相应的，待测溶液中的流动相的体积减少。基于这一原理，我们开发了一种基于凝血酶适配体调节的酶级联反应的DNase I生物传感器，用于肉眼定量检测DNase I。在存在DNase I和不存在DNase I的这两种情况下，待测溶液中流动相水溶液的相对体积发生显著变化。水溶液的体积可以通过pH指示条进一步确定。DNase I的浓度可以通过测量指示条上水印的长度来量化。从而实现在不依赖复杂仪器的情况下，快速定量、简单即时地检测DNase I。

实施例1凝血酶浓度的确定

我们研究了凝血酶使兔血浆凝结的最佳浓度，在缓冲液（50 mM Na

我们研究了凝血酶凝结兔血浆的最佳浓度。如图2所示，随着凝血酶浓度的增加，待处理溶液中上层流动相溶液的量逐渐减少，相应指示条的水印覆盖率显著降低。然而，当凝血酶浓度大于1 mg/mL时，形成的流动相溶液的体积停止变化。并且发现按当凝血酶的浓度大于1 mg/mL时，血凝块的体积停止变化。因此，我们使用1 mg/mL凝血酶溶液作为纸基生物传感器制备的优化条件。

实施例2 适配体浓度的确定

适配体可以特异性地结合凝血酶并有效抑制凝血酶活性，因此选择合适的适配体浓度对实验系统至关重要。将适配体干粉溶解在缓冲液（50 mM Na

图2显示了与适配体浓度在0至30μM之间变化相对应的指示条的图片。随着适配体浓度的增加，导致待处理溶液中上层流动相溶液的体积逐渐增加，相应指示条的水印覆盖率显著增加。这表明更多凝血酶活性受到抑制。为了提高检测的灵敏度，我们选择了有效抑制凝血酶活性的适配体浓度的较小值（20μM）作为下一次实验的优化条件。

实施例3 DNase I的检测

我们研究了纸张流量传感器中不同浓度DNase I的响应。将DNase I溶解在缓冲液2中（10 mM Tris HCl，2.5 mM MgCl

图4显示了纸基生物传感器对浓度范围为0至100 U/mL的DNase I的响应的代表性照片。如图4所示，DNase I浓度的增加导致纸带上的水流距离减小，水印覆盖率显著降低。对于0-100 U/mL范围内的DNase I浓度，获得了指示条上水印覆盖率与CDNase I之间的线性关系（图5）。最终计算得出DNase I的检测限为0.2 U/mL（基于3σ/斜率）。

实施例4 本发明方法用于血清中DNse I的检测

将正常人血清用PBS缓冲液稀释40倍，然后向其中加入DNase I ，得到浓度为0 U/mL，0.2 U/mL，2 U/mL，20 U/mL的梯度血清标准品，然后按照实施例3所述的方法进行检测，结果如图6所示。

如图6所示，随着DNase I浓度的升高，试纸条上的水印长度越来越短，证明通过纸基生物传感器上的不同水流距离，可以清楚地区分不同浓度的DNase I。

以上所述仅为本发明的具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权力要求所界定的保护范围为准。