从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于生物碱类化合物提取技术领域，具体的说，涉及一种从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物及其制备方法与用途。

背景技术

兰茂牛肝菌（

在中国西南地区市场上，兰茂牛肝菌是销量较大的野生菌之一，因其具有独特的风味且营养丰富、味道鲜美而在中国野生菌市场上大受欢迎，因此也成为许多百姓重要的经济来源之一。但是不正确的食用方法会使人中毒，初次食用烹饪时间过短（少于15分钟），或者剩余的下顿食用前没有充分加热，都会导致食用者中毒者产生幻觉或其他行为，根据已经报道的牛肝菌致幻实例中，不同的患者会出现不同的症状，包括视觉和触觉，有的患者会出现看到“小人”的幻觉，这些“小人”或与患者进行互动行为，根据个体原有认知的差异，患者看到的不同的情景，有的伴有“手舞足蹈”的行为，重者会导致死亡或出现自杀行为。

对于食用牛肝菌中毒，最早可追溯到1975年中国科学院微生物所真菌组主编的《毒蘑菇》一书中，记载到牛肝菌科物种可引起神经系统疾病，但由于当时牛肝菌科分类系统尚未完善，因此许多科学家尝试去研究见手青的致幻因子都没有得到进展。近年来，研究确定了引起致幻的见手青为兰茂牛肝菌，为研究致病因子提供了科学的指导，对兰茂牛肝菌中致幻物质的研究有着重大意义，可以对患者治疗提供科学依据。目前，还未发现关于兰茂牛肝菌生物碱类化合物及其提取方法的研究。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物及其制备方法与用途。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物，该化合物命名为牛肝菌素，其分子结构式为：

。

本发明还提供一种从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物的制备方法，包含以下步骤：

S1，将新鲜的兰茂牛肝菌清洗切片后翻炒10分钟；

S2，翻炒后的牛肝菌沥干油分并研磨，加入提取液，充分搅匀成匀浆；其中，提取液为体积比是甲醇：水：0.01M盐酸=5:4:1的混合物，加提取液的量为牛肝菌干重的2倍；

S3，将匀浆在4℃13000 rpm高速离心5min，然后使用0.22μm的过滤器过滤离心上清液；

S4，将过滤后的上清液进行四次HPLC分离，具体分离条件如下：

a、第一次HPLC：使用的色谱柱型号是PN ACE-121-2546，4.6 X 250 mm，填料粒径2.7μm；流动相A液为：体积比为乙腈：醋酸铵水溶液=1:9，使用冰醋酸调pH至5.3的溶液；流动相B液为乙腈；梯度洗脱：0~1 min，A 100%→38%；1~11 min，A 38%→100%；11~15 min，A100%→0%，流动相流速为1.0 ml/min，使用波长为280nm和29 nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分，收集该流分，冷冻干燥后加水溶解，用于第二次HPLC；

b、第二次HPLC：使用的色谱柱型号是Poroshell 120，PN 695975-902(T) ，4.6X100 mm，填料粒径2.7μm；流动相A液为0.1%的甲酸水溶液，流动相B液为含有0.1%TFA的乙腈；梯度洗脱：0~2 min，A 100%→88%；2~7min，A 88%→88%；7~13min，A 88%→82%；13~18min，A 82%→100%，流动相流速为0.5 ml/min，使用波长为210nm和250nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分，收集该流分，冷冻干燥后加水溶解，用于第三次HPLC；

c、第三次HPLC：使用的色谱柱型号是XAmide19170510315， 3.0X150mm，填料粒径5μm；流动相A液为0.1%的甲酸水溶液，流动相B液为含有0.1%TFA的乙腈；梯度洗脱：0~7min，A65%→60%；7~13min，A 60→65%；13~18min，A65%→0%，流动相流速为1.0ml/min，使用波长为280nm和330nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分，收集该流分，冷冻干燥后加水溶解，用于第四次HPLC；

d、第四次HPLC：使用的色谱柱型号是Zorbax SB-C18，4.6X250 mm，填料粒径5μm；流动相A液为0.1%的甲酸水溶液，流动相B液为含有0.1%TFA的乙腈；梯度洗脱：0~7min，A88%→86%；7~13min，A86%→0%，流动相流速为0.7ml/min，使用波长为280nm和330nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分，收集该流分，冷冻干燥后即可得牛肝菌素固体。

进一步的，所述的牛肝菌素的单晶体结晶方法为：在溶剂甲醇：水：甲酸=9:3:2的条件下，室温缓慢蒸发结晶即得到牛肝菌素的单晶。

本发明还提供兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物在检测、识别含有该化合物的蘑菇以及制备治疗抑郁症和高血压药物中的用途。

有益效果

一、本发明提供了一种从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物牛肝菌素的提取方法和该牛肝菌素单晶结晶方法。

二、本发明依据牛肝菌素的分离纯化方法和分子量，提供了检测、鉴定、识别含有该毒素的有毒蘑菇（包括由此衍生的菌类产品）的方法。a、色谱的保留时间可以快速和较为准确地从菌类中识别该毒素（通过HPLC色谱图）。b、该毒素可以通过高分辨率质谱精准识别（通过LC-MS谱图）。c、该毒素亦可通过核磁共振作最终结构的鉴定（通过核磁谱图）。d、未来还可通过制备该毒素的特异性抗体，建立免疫学方法检测含有该毒素的有毒蘑菇。

三、本发明依据同源建模和药物靶点预测提供一种从兰茂牛肝菌中提取的生物碱类化合物在制备治疗抑郁症和高血压药物中的用途。

附图说明

图1是本发明中牛肝菌素的LC-MS谱；

图2是本发明中牛肝菌素的结晶图；

图3是本发明中牛肝菌素的X-ray确定的构型图；

图4是本发明中牛肝菌素的结构模拟图，牛肝菌素通过Thermo Fisher TF20型冷冻电镜获得结构以后，利用eTasED软件半自动MicroED数据采集，然后用XDSGUI在XDS软件包中处理电子衍射数据，用eTasED软件中的cryoec_diffview包获得每个数据集的中心，然后下载到XDS中，应用XDS包将数据集与XSCALE合并，然后XPREP将其转换为SHELX格式即得图4，其中仅展示了牛肝菌素的部分结构；

图5是本发明中牛肝菌素的

图6是本发明中牛肝菌素的

图7是本发明中牛肝菌素的HSQC谱；

图8是本发明中牛肝菌素的

图9是本发明中牛肝菌素的HMBC谱；

图10是本发明中牛肝菌素的ROESY谱；

图11是本发明中牛肝菌素的HRESIM数据；

图12是本发明中碳谱信号数值的归属图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

本发明的实施中，如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温（10-30℃）。

实施例一牛肝菌素的分离和鉴定

1.1 牛肝菌生物碱的提取与分离

兰茂牛肝菌子实体，2022年7月购买于云南生昆省明市盘龙区茨坝菜市场，由中国科学院昆明植物研究所杨祝良研究员和吴刚副研究员鉴定。

兰茂牛肝菌子实体的湿重共2kg，买回后清除表面泥土，清洗后切片翻炒10分钟，沥干油分后得到样品0.8kg，取1.6kg提取液（甲醇：水：0.01M盐酸=5:4:1）浸泡研磨，将充分研磨后的匀浆4℃13000rpm高速离心5分钟，取上清液并通过0.5μm的过滤器过滤，即可得到包含有牛肝菌素的粗提物。

HPLC需要经过4根色谱柱：

a、第一次HPLC：使用PN ACE-121-2546色谱柱(4.6 X 250 mm，2.7μm)；流动相A液为：体积比为乙腈：醋酸铵水溶液=1:9，使用冰醋酸调pH至5.3的溶液；流动相B液为乙腈；梯度洗脱：0~1min，A 100%→38%；1~11min，A 38%→100%；11~15min，A 100%→0%，流动相流速为1.0 ml/min，使用波长为280nm和295nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分（t

b、第二次HPLC：使用Poroshell 120，PN 695975-902(T) 色谱柱（4.6X100mm，2.7μm）；流动相A液为0.1%的甲酸水溶液，流动相B液为含有0.1%TFA的乙腈；梯度洗脱：0~2 min，A 100%→88%；2~7min，A 88%→88%;7~13min，A 88%→82%；13~18min，A 82%→100%，流动相流速为0.5 ml/min，使用波长为210nm和250nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分（t

c、第三次HPLC：使用XAmide19170510315色谱柱（3.0X150mm，5μm）；流动相A液为0.1%的甲酸水溶液，流动相B液为含有0.1%TFA的乙腈；梯度洗脱：0~7min，A 65%→60%；7~13min，A 60→65%；13~18min，A65%→0%，流动相流速为1.0ml/min，使用波长为280nm和330nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分（t

d、第四次HPLC：使用Zorbax SB-C18,色谱柱（4.6X250mm，5μm）；流动相A液为0.1%的甲酸水溶液，流动相B液为含有0.1%TFA的乙腈；梯度洗脱：0~7min，A88%→86%；7~13min，A86%→0%，流动相流速为0.7ml/min，使用波长为280nm和330nm的紫外吸收光检测，上样量为100μl，分离得含有牛肝菌素的流分（t

牛肝菌素固体密封保存于4℃。将牛肝菌素固体溶解在水中进行高分辨质谱，确定其相对分子质量。

将牛肝菌素溶解在DMSO中进行核磁鉴定。将牛肝菌素在溶剂体积比为甲醇：水：甲酸=9:3:2的混合液中，室温缓慢蒸发结晶得到牛肝菌素的单晶，该晶体可保存为种子晶体，再次取牛肝菌素溶解构建新的结晶体系后，将上述种子晶体取少量置于新的结晶体系中，可提升其结晶的效率。单晶进行X射线衍射、冷冻电镜来确定其构型。

1.2 牛肝菌素分离与结构鉴定

分离得到的牛肝菌素为淡黄色固体。参照附图1-12和表1-3：

HRESIMS（高分辨电喷雾电离质谱）([M+H]

牛肝菌素的

根据2D-NMR数据，牛肝菌素由variegatic acid部分和ergothioneine部分组成。

根据HMBC数据和碳原子碳谱信号数值归属图12，可以得出：H-2 (δ

通过

关于氢谱：该分子结构复杂，在溶液中存在构象变化，所以氢谱中氢原子的峰有裂分且不固定，而且溶剂峰遮挡了许多重要的信号，所以没有办法一一对应。最终结果是综合二维图谱及晶体结构的结果。将说明书附图2中的D所示的晶体用带有Excillum MetalJet系列X-射线源的Bruker D8 VENTURE metal jet PHOTON II来分析，得到构型图，如图3所示。数据来源于150 kV的冲击冷却，并以1.1 Å的分辨率阐明了首尾相接的牛肝菌素（boletin）对。已揭示的结构表明，在牛肝菌素（boletin）中有两个部分:variegatic acid部分和ergothioneine部分。

表1是本发明中牛肝菌素晶体结构数据：

表2是本发明中牛肝菌素冷冻电镜数据：

表3是本发明中牛肝菌素的NMR数据：

实施例二牛肝菌素同源建模和药物靶点预测

我们通过SuperPred对牛肝菌素进行了同源建模和药物靶点预测，结果显示，牛肝菌素的最强靶点是Cathepsin D（CTSD），属于T67102（前ID: TTDR00447）类，与高血压（靶点相关疾病）有关。其他两个主要靶点包括DNA-（无嘌呤或无嘧啶位点）裂解酶和甲状腺激素受体（表4）。基于以上原因，牛肝菌素在治疗抑郁症和高血压等疾病方面具有潜力。

Ergothioneine（麦角硫氨酸）部分的咪唑基可能是主要发挥功能的官能团。它是一种含氮杂环，具有抗菌、抗癌、抗结核、抗真菌、镇痛等多种生物活性。关于咪唑啉受体，已经提出了三种亚型（I1, I2和I3），其中I2受体激动剂有中枢介导的作用，包括抗接种和神经保护，与麦角硫氨酸的性质一致。

表4牛肝菌素的作用靶点预测数据

实施例三牛肝菌素对小鼠行为的影响

实验小鼠使用C57BL/6J，18-22克,采购自SPF（Beijing）Biotechnology Co.,Ltd.（Certificate No. SCXK2019-0010）.动物的饲养与实验流程依照Guide for the Careand Use of Laboratory Animals (ISBN-10:0-309-15396-4)。实验流程：取20μg牛肝菌素纯品溶解于150μL纯水中，用 1 mL针筒将溶液通过标准腹腔注射方法（intraperitonealinjection）注入小鼠，并将小鼠放置于60cm*60cm*40cm的纸箱中进行观察，纯水和variegatic acid作为本实验的对照。本实验进行三组生物学重复，小鼠表现出的神经意识方面的改变包括频繁自舔、活动范围显著减小、神志不清、颤抖等表现，具体结果见表5。

表5牛肝菌素在中小鼠中的生物学活性

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。