聚乙烯醇在制备治疗溃疡性结肠炎相关药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及聚乙烯醇在制备治疗溃疡性结肠炎相关药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以结肠上皮黏膜的持续性损伤为主要病理改变的临床难治性疾病。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等。UC可发生于各年龄层，难治愈，且发病率呈逐年升高趋势，已被世界卫生组织(WHO)列为现代难治性疾病之一。UC治愈难度大，常易复发，有癌变倾向，目前尚无特效疗法。治疗溃疡性结肠炎的药物包括柳氮磺胺吡啶、肾上腺皮质激素等广谱抗炎药物和免疫抑制、免疫调节剂等，目前尚无治疗溃疡性结肠炎的特效药物。因此，发掘新的治疗药物，对于阻断溃疡性结肠炎的病程进展具有重要的临床价值。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供聚乙烯醇在制备治疗溃疡性结肠炎相关药物中的应用。本发明经试验发现，聚乙烯醇(PVA)水溶液可以缓解溃疡性结肠炎，改善组织损伤及症状，为溃疡性结肠炎的临床治疗提供了新的思路与方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种聚乙烯醇在制备治疗溃疡性结肠炎相关药物中的应用。

优选的，所述聚乙烯醇为聚乙烯醇水溶液，浓度为1mg/ml-3mg/ml。

优选的，所述药物的给药方式为灌肠、注射。

优选的，所述药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、微囊微球制剂、栓剂、软膏剂、喷雾剂或靶向制剂中的一种。

优选的，所述聚乙烯醇在制备促进肠干细胞扩增的药物中的应用。

优选的，所述聚乙烯醇在制备促进结肠类器官数目扩增的药物中的应用。

优选的，所述聚乙烯醇在制备抑制炎症因子释放药物中的应用。

进一步优选的，所述炎症因子包括CD45、CD68、MPO。

优选的，所述聚乙烯醇在制备恢复肠粘膜损伤药物中的应用。

另一方面，一种药剂，所述药剂包括聚乙烯醇，聚乙烯醇作为唯一活性成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现PVA水溶液可以缓解溃疡性结肠炎，改善组织损伤及症状，其机制可能与PVA水溶液促进肠干细胞扩增，进而促进肠黏膜损伤修复有关，为溃疡性结肠炎的临床治疗提供了新的思路与方法。

本发明通过建立DSS诱导的溃疡性结肠炎模型，观察不同浓度的PVA水溶液对模型小鼠的治疗作用，通过记录小鼠体重变化、临床疾病活动指数、结肠长度、组织病理学及炎症因子水平评估小鼠结肠组织损伤程度、炎症程度及缓解情况；并进一步利用小鼠结肠类器官培养，体外观察不同浓度的PVA水溶液对类器官数目的影响。结果发现DSS可以导致小鼠体重减轻、结肠组织损伤、结肠炎症加重，通过PVA水溶液(1mg/ml和3mg/ml)治疗可以明显缓解模型小鼠体重丢失(p<0.05)，并且显著改善组织损伤(p<0.05)，肠黏膜组织炎症因子水平降低。体外类器官培养也证实PVA水溶液可以促进小鼠结肠类器官数目明显扩增(p<0.05)。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1小鼠体重变化曲线；

图2为本发明实施例1小鼠组织学评分；

图3为本发明实施例1小鼠CD45得分情况；

图4为本发明实施例1小鼠ki67得分情况；

图5为本发明实施例1小鼠CD68得分情况；

图6为本发明实施例1小鼠MPO得分情况；

图7为本发明实施例1小鼠结肠类器官培养第0天与第1天的图片；

图8为本发明实施例1小鼠结肠类器官培养第2天与第3天的图片；

图9为本发明实施例1小鼠结肠类器官培养第4天与第5天的图片；

图10为本发明实施例1小鼠结肠类器官增值数量图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1、聚乙烯醇在制备治疗溃疡性结肠炎相关药物中的应用

1、建立治疗模型：

选择54只6-8周C57BL/6J雄性小鼠作为实验对象，进行随机分为9组。所有小鼠适应环境一周，在室温25℃，通风良好的条件下，Co660鼠维持料、纯水喂养。开始实验后进行动物模型建立，饲养环境不变，随机抽取其中6组小鼠，将配置好的2.5％DSS溶液替代纯水喂养小鼠诱导溃疡性结肠炎，平均每只小鼠每天饮水大约8ml，及时补充DSS溶液，并且每天更换垫料，喂养一周。

2、采用不同浓度的PVA水溶液治疗

未建立动物模型的3组小鼠为对照组，每日分别采用纯水+生理盐水、0.3mg/mlPVA水溶液、3mg/mlPVA水溶液对3个对照组的小鼠进行灌肠，每天一次，每次0.2ml。已建立动物模型的6组小鼠，每日采用0.2ml的不同浓度PVA水溶液(0.1mg/ml、0.3mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、10mg/ml)分别给5个动物模型组进(即，5个治疗组)行灌肠治疗以观察治疗效果，采用0.2ml生理盐水对剩余的1个动物模型组(即，非治疗组)行灌肠治疗以观察治疗效果，每日灌肠一次。

自动物模型建立第一天开始，称重每只小鼠并记录，体重保留2位小数，灌肠后放置其于空笼子中，待其排出粪便后观察粪便记录腹泻及便隐血情况，可用便潜血试纸检测出血情况，并进行临床疾病活动指数评估。

临床疾病活动指数评估规则如下：

体重减轻(无变化0分；<5％＝1分；6～10％＝2分；11～20％＝3分；>20％＝4分)；

大便(正常＝0分；软质、形态良好＝1分；软质无小球＝2分；腹泻＝4分)；

出血(无血＝0分；直肠可见血＝1分；直肠大出血＝2分；皮下可见血＝4分)。

喂养6天，实验结束后，解剖小鼠，取结肠(取自回盲瓣至肛门，可切开耻骨联合)，测量并记录长度。切取结肠病变浸泡于中性福尔马林溶液中，随后进行包埋切片制片，通过病理切片(HE)评价组织损伤程度，评价内容及规则如下：

a.组织损伤程度评分：

0＝固有层内无或少量炎症细胞；1＝固有层内炎症细胞增多；2＝炎症细胞向黏膜下层扩散；3＝炎症细胞浸润的跨壁延伸。

b.损伤深度评分：

0＝无黏膜损伤；1＝淋巴上皮病变；2＝黏膜糜烂或溃疡；3＝透壁损伤。

c.隐窝损伤评分：

0＝无；1＝小于5％受累；2＝33％损伤；3＝66％损伤；4＝整个隐窝和上皮正常结构消失。

d.涉及面积百分比评分：

1＝1-25％；2＝26-50％；3＝51-75％；4＝76-100％。

随后进行免疫组化检测(即，免疫组织化学染色)：CD45、CD68、MPO、Ki-67，评估方法如下：

根据细胞染色强度评分为4级，无阳性着色(阴性)计0分，淡黄色(弱阳性)计1分，棕黄色(阳性)计2分，棕褐色(强阳性)计3分；

根据阳性细胞百分比评为4级，≤25％计1分，26％-50％计2分，51％-75％计3分，＞75％计4分，将两项评分相乘得出最终评分结果。

计算阳性细胞数：计数20倍镜下随机5个视野下的阳性细胞数，求平均值。

CD45、CD68、MPO得分越高代表炎症程度越高，Ki-67可反应粘膜上皮增值情况。综合判断结肠粘膜损伤情况及缓解情况。

如图1-6所示，DSS可以导致小鼠体重减轻、结肠组织损伤、结肠炎症加重，通过PVA水溶液(1mg/ml和3mg/ml)治疗可以明显缓解模型小鼠体重丢失(p<0.05)，并且显著改善肠粘膜损伤，组织评分明显减低(p<0.05)，肠黏膜组织炎症因子CD45、CD68即MPO水平显著降低。而Ki-67明显升高，说明促进了肠黏膜上皮增殖。总之，PVA水溶液明显缓解了溃疡性结肠炎，抑制了炎症。

3、小鼠结肠类器官的增殖

1)取无任何处理的正常小鼠，杀死后用酒精棉球擦拭腹部，迅速剖开腹腔，灌入冰冷无菌的PBS，取结肠到PBS中，转移到无菌操作台中。

2)将结肠放到平皿中，用PBS浸没(以下步骤尽量全程保持肠组织处于冰冷无菌的PBS中)；清理干净肠外的脂肪组织和肠系膜组织，用针头或枪头将肠中的食物残渣冲出。

3)将结肠纵向剪开，用PBS清洗结肠直到干净。

4)将结肠剪成2-4mm的小片段，转移到50ml离心管中，加入30mlPBS，吹打后弃上清，反复三到五次，直至上清澄清透明。

5)弃去上层PBS，加入30ml冷2MmEDTA/PBS，用封口膜封口，4℃下摇床震摇60min，100rpm。

6)将肠子转至操作台，静置，移除上清液。

7)加20mlPBS，用吸管吹打50次，静置后将上清液转至新的50ml离心管，做标记，取20ul上清液镜检，重复该步直到大部分隐窝释放下来。

8)选取隐窝多且完整的管子，封口膜封口，4℃，300g，5min离心。

9)用1ml的冰冷DMEM悬浮沉淀(1x双抗)，提取20ul镜检，要求每50ul基质胶200-500个隐窝，根据所需隐窝数量取部分转移到15ml离心管中，封口，低速离心(4℃，200g，3min)移除单个细胞。

10)弃上清，用冰冷DMEM悬浮沉淀(1x双抗)重悬浮隐窝，加入等体积基质胶(

11)添加50μL/40μL/10μL基质胶到预热的24/48/96孔板中(预先放在37℃恒温箱中)，基质胶需要添加到中间的孔中来形成半球状的小滴，接种后应该迅速转移到培养箱凝固20分钟(冬天应相应延长凝固时间)，每孔加500μL/250μL/100μL小鼠结肠类器官扩增培养基(biogeneousTM，#K2204-MC)。

12)在培养箱中培养，一天后弃去培养基，分别用0mg/mL，1mg/mL，3mg/mL的PVA(Sigma-Aldrich,#363146)溶液刺激隐窝，每3天更换一次培养基，第6天使用细胞修复液(Corning，#354253)溶解基质胶，收集类器官。

如图7-10所示，在小鼠结肠类器官培养过程中，1mg/ml和3mg/ml的PVA水溶液明显促进了小鼠结肠类器官的增殖，表现为自第四天和第五天开始类器官数目明显增加，而类器官大小变化不明显，结果说明PVA水溶液促进类器官的扩增。总之，体外类器官培养证实PVA水溶液可以促进小鼠结肠类器官数目明显扩增(p<0.05)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。