一种紫杉烷类药物与环磷酰胺共载载药脂质体制备方法

技术领域

本发明涉及脂质体制剂技术领域，具体为一种紫杉烷类药物与环磷酰胺共载载药脂质体制备方法。

背景技术

紫杉烷类脂质体药物包括紫杉醇脂质体、多西他赛脂质体。紫杉醇属于植物药，紫杉醇是由紫衫的树干、树皮或针叶中提取或半合成的有效成分。目前紫杉醇脂质体在2003年已经上市，制成的脂质体后明显降低了毒性，并且与紫杉醇或多西他赛注射液有相同的抗肿瘤活性。环磷酰胺主要能杀死肿瘤细胞，可用于治疗多发性骨髓瘤、乳腺癌等肿瘤疾病的治疗。

乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下发生增殖失控的现象，疾病早期常表现为乳房肿块，乳头溢液，腋窝淋巴结肿大等症状，晚期可因癌细胞发生远处转移，出现多器官病变，直接威胁患者的生命。化疗是指化学药物治疗，是通过使用细胞毒性药物杀灭癌细胞的全身治疗手段，化疗方案的选择要根据肿瘤的生物学行为和患者的身体状况进行选择。乳腺癌化疗的方案中，TC方案中T通常指的是紫杉烷类药物，C通常指的是环磷酰氨，主要适用于中低危复发人群使用。TC方案具体为：紫杉烷类药物75mg/m

为了解决上述问题，本申请提供了一种紫杉烷类药物与环磷酰胺共载载药脂质体制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫杉烷类药物与环磷酰胺共载载药脂质体制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种紫杉烷类药物与环磷酰胺共载载药脂质体制备方法。

一种紫杉烷类药物与环磷酰胺共载载药脂质体制备方法，包括以下步骤：

步骤A：取紫杉烷类药物、磷脂、附加剂、有机溶剂，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物；

步骤B：将环磷酰胺与缓冲液在30-60℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液；

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以水下注入的方式注入至环磷酰氨溶液中，进行水化，得到水化后的脂质体；将水化后的脂质体采用高温-低温依次循环的条件完成挤出，得到挤出后的脂质体样品；

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至25-27℃，除菌、过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

较为优化地，步骤A中，紫杉烷类药物为多西他赛、紫杉醇中的任意一种或多种；

磷脂为氢化大豆磷脂、大豆磷脂、蛋黄磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油中的任意一种或多种；

附加剂为胆固醇、十八胺、磷脂酸、维生素E、大豆油、橄榄油中的任意一种或多种；

有机溶剂为乙醇、甲醇、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、叔丁醇、异丙醇中的任意一种或多种。

较为优化地，所述紫杉醇药物磷脂复合物包括以下成分：按照重量计，1份紫杉烷类药物、13-20份磷脂、2份附加剂、50份有机溶剂。

较为优化地，步骤B中，缓冲液的制备方法为，取物料、注射用水，搅拌均匀，用稀盐酸调节pH至6.5，得到缓冲液。

较为优化地，所述物料为组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、果糖中的任意一种或多种。

较为优化地，所述缓冲液的浓度为10％-30％。

较为优化地，步骤C中，将紫杉醇药物磷脂复合物以水下注入的方式注入至环磷酰氨溶液中，控制高度为液面以下的30％-60％，控制注入速度为10g/min-200g/min，水化温度为40℃-70℃，时间为5min-20min，进行水化，得到水化后的脂质体。

较为优化地，将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温范围为50℃-70℃，低温范围为0-50℃，挤出模孔径为80-500nm，挤出压力为10-30bar，循环10-20次，得到挤出后的脂质体样品。

较为优化地，脂质体样品的粒径在80-200nm之间

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：

(1)脂质体是将药物包封于类脂制双分子层内，形成的微型泡囊，而且脂质体还可以降低药物的毒性。本发明中的紫杉烷类药物和环磷酰胺共载载药脂质体，具有良好的物理稳定性、生物兼容性和生物可降解性，紫杉烷类药物与环磷酰胺分别包裹在磷脂内部和中间，能够有效的减少载药后药物的泄露。此外该产品为冻干脂质体，具有贮存效期长的特点。

更为重要的是，乳腺癌化疗的TC方案中，两种肿瘤药物是分别进行静脉滴注，使用本发明的共载脂质体，可减少给药时间，从而能够减少不良反应以及其它并发症的可能性。此外使用本发明的共载脂质体能够同时延缓两种药物在体内的释放，同时靶向肿瘤组织，提高治疗效果。

本发明使用组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、果糖中的任意一种或多种配制缓冲液，可以作为冻干保护剂，保护脂质体。

本发明中提供的“水下注入”方式能快速的形成脂质体载药，载药量高，水化时间短，环磷酰胺以及脂质体产品稳定，降低了其降解和氧化风险。

本发明中采用“高温-低温”循环挤出，能够提高脂质体磷脂的韧性，从而提高脂质体的稳定性，延长含药脂质体的贮存时间。

本发明采用的脂质体制备方法，工艺简单、易于操作、节省节能，适合工业化生产。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明实施例1共载脂质体复溶后的粒径图；

图2是本发明实施例1共载脂质体复溶后的释放曲线图；

图3是本发明实施例2共载脂质体复溶后的粒径图；

图4是本发明实施例2共载脂质体复溶后的释放曲线图；

图5是本发明实施例3共载脂质体复溶后的粒径图；

图6是本发明实施例3共载脂质体复溶后的释放曲线图；

图7是本发明实施例4共载脂质体复溶后的粒径图；

图8是本发明实施例4共载脂质体复溶后的释放曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、采用HPLC原理，检测溶血磷脂含量。取10ml三乙胺，加500ml水，冰醋酸调节PH值至6.5，配制缓冲液。使用高效液相色谱仪-Waters E2695、蒸发光散射检测器ELSD6000。

取溶血磷脂对照品适量，用无水甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.08mg、0.12mg、0.16mg、0.2mg溶血磷脂溶液，摇匀，分别作为对照溶液(1)、对照溶液(2)、对照溶液(3)、对照溶液(4)；精密称取共载脂质体0.2g，置于10ml量瓶中，加水0.5ml，加甲醇稀释定容至刻度，作为供试品溶液；分别精密量取各对照溶液和供试品溶液各20μl，按上述色谱条件，分别注入液相色谱仪。

系统适用性：量取20μl对照溶液(2)，按上述色谱条件反复进样5次，所得主峰面积的标准偏差小于5.0％。

以各对照溶液的主峰面积对数值lnA和配制浓度对数值lnC绘制线性方程，相关系数不少于0.999，将供试品溶液主峰面积对数值lnAi代入线性方程计算溶血磷脂的量。

仪器参数与色谱条件：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流速1.0ml/min，柱温35℃，进样量：20μl，采用蒸发光散射检测器，氮气流速2.0ml/min，蒸发温度为70℃。

流动相A：乙醇；B：甲醇：乙腈：缓冲液＝4:3:3；C：甲醇：乙腈：缓冲液＝4:4:2

2、采用HPLC原理，检测紫杉烷类药物与环磷酰胺含量。使用高效液相色谱仪-Waters E2695+UV。取紫杉烷类对照品20mg，于10ml量瓶中，加适量水，换用甲醇溶解定容至刻度，制成约含取紫杉烷类药物2mg/ml的悬浮液。再精密量取1ml置50ml容量瓶中，同时精密称取环磷酰胺对照品20mg置上述50ml容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，作为对照品溶液。

精密称取共载脂质体约0.25g置50ml容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，作为供试品溶液。系统适用性：精密量取20μl对照溶液按上述色谱条件注入液相色谱仪，反复操作5次，所得两个主峰面积的标准偏差应均不大于2.0％。两主峰的分离度应大于1.5。按外标法以峰面积分别计算每瓶中紫杉烷类含量和环磷酰胺含量。

仪器参数与色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；UV检测器(检测波长209nm)；流速1.2ml/min，柱温35℃，进样量：20μl。

流动相：甲醇-乙腈-注射用水＝30:25:55。

3、检测包封率。

取凝胶柱G-25轻敲让填料至管底，去红色帽盖并放入2ml离心管中，加入500μl水，30min后以8000转/分钟离心5min，弃滤液后，再加入500μl水，15min后以8000转/分钟离心5min，弃滤液后加0.9％氯化钠溶液500μl以8000转/分钟离心5min，弃滤液，再离心5min，更换离心管备用。

称取样品约2.5g，置于10ml量瓶中，加水溶解稀释定容至刻度，制成悬浮液。精密量取悬浮液200μl至活化好的G-25柱上，等10分钟后，以8000转/分钟离心5分钟，再加入500μl水于G-25柱上以8000转/分钟离心5分钟，合并滤液至10ml容量瓶中，用甲醇洗涤离心管3次并转移至容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积记为A包封。上述G-25柱再依次以50％乙醇3ml、100％乙醇5ml分次离心洗脱，洗脱液全部转移至另一10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积记为A游离。精密量取悬浮液200μl至10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照含量测定项下的色谱方法，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积记为A总药物。通过两主峰面积分别计算两主要的包封率和回收率。

4、检测体外释放度：

称取氯化铵5.35g、L-组氨酸1.55g，加水40ml溶解后，用2mol/L盐酸溶液调节pH至6.5，并定容至50ml，摇匀，即得释放液。称取样品约2.5g，置于10ml量瓶中，加水溶解稀释定容至刻度，制成供试品溶液。量取供试品溶液3ml，加释放液1ml，混匀，平行制备两份，分别置2个试管中，放置于52℃水浴中。按释放时间要求，分别在0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、12h，分别立即取出置冰水浴中冷却，按包封率的检测方法检测释放后的包封率。释放％＝＝原包封率％-释放后的包封率％。

5、粒径检测

取样品悬浮液40ul，加0.9％氯化钠溶液1960ul，摇匀，取此混悬液，置自动粒径仪中测定粒径。

实施例1

步骤A：取1g多西他赛、18g氢化大豆磷脂、2g胆固醇、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将168g葡萄糖、32g组氨酸溶于800g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成20％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，采用直径为0.5mm不锈钢注入针，直插入环磷酰胺溶液中，确保注入针的出口处在液面以下30％高度范围，然后用蠕动泵将“紫杉醇药物磷脂复合物”通过注入针转移至环磷酰胺溶液中，通过调节蠕动泵泵速从而控制注入速度为10g/min。此时，高度为液面以下的30％高度，控制注入速度为10g/min，水化温度为50℃，时间为10min，搅拌速度为300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温65℃，低温40℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至26℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

共载脂质体加速稳定性数据如下表1所示。

表1

实施例2

步骤A：取1g紫杉醇、16g氢化大豆磷脂、2g胆固醇、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将129g蔗糖、21g组氨酸溶于850g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成15％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的40％高度，控制注入速度200g/min，水化温度50℃，时间10min，搅拌速度300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温60℃，低温30℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至25℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

共载脂质体加速稳定性数据如下表2所示。

表2

实施例3

步骤A：取1g多西他赛、20g二棕榈酰磷脂酰胆碱、2g维生素E、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将213g果糖、37g甘氨酸溶于750g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成25％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的50％高度，控制注入速度60g/min，水化温度50℃，时间10min，搅拌速度300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温55℃，低温10℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至27℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂

共载脂质体加速稳定性数据如下表3所示。

表3

实施例4

步骤A：取1g紫杉醇、14g二棕榈酰磷脂酰胆碱、2g维生素E、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将100g果糖、20g甘氨酸溶于880g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成12％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的60％高度，控制注入速度150g/min，水化温度50℃，时间10min，搅拌速度300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温70℃，低温20℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至25-27℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

共载脂质体加速稳定性数据如下表4所示。

表4

对比例1

步骤A：取1g多西他赛、18g氢化大豆磷脂、2g胆固醇、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将168g葡萄糖、32g组氨酸溶于800g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成20％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的20％高度，控制注入速度为5g/min，水化温度为50℃，时间为10min，搅拌速度为300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温65℃，低温40℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至26℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

共载脂质体加速稳定性数据如下表5所示。

表5

对比例2

步骤A：取1g紫杉醇、16g氢化大豆磷脂、2g胆固醇、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将129g蔗糖、21g组氨酸溶于850g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成15％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的70％高度，控制注入速度250g/min，水化温度50℃，时间10min，搅拌速度300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温60℃，低温30℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至25℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

共载脂质体加速稳定性数据如下表6所示。

表6

对比例3

步骤A：取1g多西他赛、20g二棕榈酰磷脂酰胆碱、2g维生素E、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将213g果糖、37g甘氨酸溶于750g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成25％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的50％高度，控制注入速度60g/min，水化温度50℃，时间10min，搅拌速度300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温80℃，低温60℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至27℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂

共载脂质体加速稳定性数据如下表7所示。

表7

对比例4

步骤A：取1g紫杉醇、14g二棕榈酰磷脂酰胆碱、2g维生素E、50g乙醇，搅拌均匀，得到紫杉醇药物磷脂复合物。

步骤B：将100g果糖、20g甘氨酸溶于880g注射用水中，用稀盐酸调节pH至6.5，制成12％的缓冲液；

将10g环磷酰胺与60g缓冲液在50℃条件下溶解混合均匀，得到环磷酰氨溶液。

步骤C：将紫杉醇药物磷脂复合物以液面以下的水下注入方式注入至环磷酰氨溶液中，高度为液面以下的60％高度，控制注入速度150g/min，水化温度50℃，时间10min，搅拌速度300rpm/min，得到水化后的脂质体；

将水化后的脂质体采用“高温-低温”依次循环的条件下完成挤出，高温40℃，低温5℃，挤出压力15bar，循环15次，通过挤出控制脂质体粒径在80-200nm之间，得到挤出后的脂质体样品。

步骤D：将挤出后的脂质体样品降温至25-27℃，经交叉切向流设备用缓冲液置换后，成品中乙醇含量在1％重量分数以下，经0.22um除菌设备除菌过滤、灌装、冻干制成的含药共载脂质体。

共载脂质体加速稳定性数据如下表8所示。

表8

实验

取实施例1至实施例4、对比例1至对比例4，通过高效液相色谱仪检测紫杉烷类药物含量、环磷酰胺含量、溶血磷脂含量；通过Nicomp380ZLS纳米粒度仪检测粒径。

结论：通过实施例1与对比例1、实施例2与对比例2进行对比可知，在步骤C中通过控制注入高度和注入速度，可以提高药物的包封率和稳定性。

通过实施例3与对比例3、实施例4与对比例4进行对比可知，在步骤C中通过挤出“高温-低温”温度参数，可以降低溶血磷脂的生成，同时提高药物的包封率。

由表上数据可知，本发明制备的紫杉烷类药物和环磷酰胺共载载药脂质体，具有良好的物理稳定性、生物兼容性，含量、包封率高，具有贮存效期长的特点。本发明的共载脂质体延缓两种药物在体内的释放，同时靶向肿瘤组织，提高治疗效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。