毛蕊花糖苷在促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及毛蕊花糖苷在促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化中的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，可以分化成各种细胞类型，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞和肌细胞。它们也具有骨髓支持能力、抗炎和免疫调节等多功能特性。可植入人体内，促进体外诱导后骨修复，解决来源稀缺、损伤大的问题，有望用于骨缺损和骨不连骨折的治疗。促进骨髓基质细胞(BMSCs)在骨折缺损周围的微环境中的募集并诱导其成骨分化以促进骨愈合是至关重要的。它们不仅直接分化为骨细胞，而且还释放一些旁分泌因子影响周围的微环境，支持周围组织的生存，间接促进骨形成。然而骨髓间充质干细胞在骨髓中含量很低，且由于其具有分化的能力，因此它的增殖速度缓慢。极大地限制了其在临床上的应用。

毛蕊花糖苷，Acteoside，结构式如下：

毛蕊花糖苷是从中国骨科传统中草药地黄中的分离得到的有效成分之一。据报道有多种药理活性，包括抗纤维化、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗氧化应激等。以往研究发现，毛蕊花糖苷抑制破骨细胞前体的分化和成熟。然而，毛蕊花糖苷在骨髓间充质干细胞增殖和成骨方向的研究尚不清楚。在此基础上，申请人进一步研究毛蕊花糖苷促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨的生物活性。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了毛蕊花糖苷在促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

第一方面，本发明保护一种毛蕊花糖苷在制备促进骨髓间充质干细胞增殖和/或成骨分化的相关药物中的应用。

申请人研究发现，毛蕊花糖苷能够促进体外培养鼠源骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。

所述毛蕊花糖苷在培养液中的浓度40μM时，应用于鼠源骨髓间充质干细胞增殖显著。

所述毛蕊花糖苷在培养液中的浓度在20和40μM时，应用于鼠源骨髓间充质干细胞成骨分化效果显著。

所述毛蕊花糖苷在培养液中的浓度在20和40μM时，促进鼠源骨髓间充质干细胞Runx2和OPN蛋白的表达来发挥其成骨分化的作用。

在具体的实施方案中，与成骨分化相关的疾病选自骨折、骨缺损和骨质疏松中的一种或多种。

第二方面，本发明还保护毛蕊花糖苷在制备治疗骨科相关疾病的药物中的应用。

在具体的实施方案中，所述骨科相关疾病选自骨折、骨缺损和骨质疏松中的一种或多种。

第三方面，本发明还保护一种药物组合物，所述药物组合物包括毛蕊花糖苷，以及药学上可接受的载体或辅料；所述药物组合物选自如下功能(A1)或(A2)：

(A1)促进骨髓间充质干细胞增殖和/或成骨分化；

(A2)治疗骨科相关疾病。

在具体的实施方案中，所述药学上接受的载体选自填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂中的一种或多种。

在具体的实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的促进骨髓间充质干细胞增殖和/或成骨分化的药物或其他相关活性物质。

在具体的实施方案中，所述药物组合物包括口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂或黏膜给药制剂。

本发明的单体化合物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明单体化合物或药物组合物的给药剂量依照所要治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。

本发明单体化合物或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物或药物组合物与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

第四方面，本发明还保护一种治疗骨科疾病相关的方法，通过施加毛蕊花糖苷来实现。

所述毛蕊花糖苷为市售高纯度的毛蕊花糖苷，纯度≥98％，也可以按照常规方法进行制备。

本发明有益效果是：毛蕊花糖苷促进骨髓间充质干细胞增殖，还可以促进其成骨分化，可为治疗骨折、骨缺损和骨质疏松等疾病的干细胞治疗提供充足的细胞，同时降低机体的免疫排斥反应。

附图说明

图1为本发明提供MTT法检测毛蕊花糖苷对骨髓间充质干细胞增殖的柱状图。

图2为本发明提供的蛋白印迹法检测在α-MEM培养液中加入不同浓度的毛蕊花糖苷和未添加毛蕊花糖苷的对照组中Runx2(Runt-related transcription factor 2)，OPN(osteopontin)的表达情况图；其中，图A为毛蕊花糖苷提高了骨髓间充质干细胞Runx2和OPN蛋白水平的表达；图B为毛蕊花糖苷作用后Runx2的相对蛋白量表达。其中，使用t检验分析给药组与对照组之间的差异，p<0.05表示具有统计学意义；与对照组相比，**代表P<0.01，***代表P<0.001；图C为毛蕊花糖苷作用后OPN的相对蛋白量表达。其中，与对照组相比，ns代表无显著性差异，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

图3为本发明提供的茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察骨髓间充质干细胞成骨的现象图。染色越深，成骨越明显。A为诱导成骨诱导21天后使用茜素红染色检测成骨的照片。B为诱导成骨诱导14天后使用碱性磷酸酶染色检测成骨的照片。染色越深，促成骨作用越强。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。下述实施例所采用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试药α-MEM培养液(Gibco BRL，美国)；胎牛血清(FBS，Gibco BRL，美国)0.25％胰酶(Gibco BRL，美国)；青霉素-链霉素溶液(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；Thiazolyl Blue(MCE，中国)；鼠源骨髓间充质干细胞(中科院上海细胞所，中国)。

实施例1、MTT法检测毛蕊花糖苷药物增殖效果

1、培养基的配制：在α-MEM培养液中加入10％胎牛血清和1％的青霉素-链霉素溶液。

2、毛蕊花糖苷的配制：由上海源叶生物科技有限公司购得毛蕊花糖苷(纯度98％)，称取1g后用DMSO溶解，制成终浓度100μM的毛蕊花糖苷母液，再用培养基稀释至不同浓度的工作液。

3、毛蕊花糖苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响：将总共2×10

如图1所示，结果显示，本发明浓度为40-50μM的毛蕊花糖苷对骨髓间充质干细胞具有显著性增殖效果。

实施例2、不同浓度的毛蕊花糖苷对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

1、通过Western blot实验证明毛蕊花糖苷可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化：将骨髓间充质干细胞接种在细胞培养皿上，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为0μM、10μM、20μM、40μM的毛蕊花糖苷作用24h，用PBS洗涤细胞一次，用胰酶消化细胞，收集细胞悬液，3000rpm离心5min后去除上清，每个样品加入50μl的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解30分钟，然后在12,000rpm和4℃下离心10分钟。每个样品用经典的BCA定量方法确定为40μg，然后用10％的SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。PVDF膜用5％的脱脂牛奶在25℃下阻断2小时，7随后用第一抗体孵育过夜。第二天，用TBST清洗膜3次，然后用二抗在25℃下孵育1.5小时。应用Chemi DOCTM XRS+系统测量结合的免疫复合物。

如图2所示，20μM和40μM的毛蕊花糖苷作用后可以使骨髓间充质干细胞的Runx2蛋白和OPN蛋白表达量明显增加。

2、茜素红染色和碱性磷酸酶实验验证毛蕊花糖苷促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

茜素红染色：将骨髓间充质干细胞接种在24孔板中，细胞密度为2×10

碱性磷酸酶实验：将骨髓间充质干细胞接种在24孔板中，细胞密度为2×10

如图3所示，茜素红染色和碱性磷酸酶实验验证毛蕊花糖苷10-40μM的浓度作用下使骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强，其中A图为成骨诱导21天后茜素红染色检测成骨的照片，染色越深，说明骨髓间充质干细胞成骨分化能力越强。B图为成骨诱导14天后碱性磷酸酶实验检测成骨的照片，染色越深，说明骨髓间充质干细胞成骨分化能力越强。

通过本发明实施例1-2，本发明首次证明了毛蕊花糖苷可以促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化。可用于治疗骨折、骨缺损和骨质疏松等疾病，并为干细胞治疗提供充足的细胞，从而成为一种新的药物。

虽然，上文中已用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上可以进行一些修改和改进，对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。