一种抗糖化的槐米粉及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及可食植物性原料高值化利用技术领域，特别涉及一种抗糖化的槐米粉及其制备方法和应用。

背景技术

糖基化终末产物(AGEs)是还原糖和蛋白质中的氨基酸基团发生非酶促褐变反应产生的终产物。随着年龄的增长，AGEs在人体组织中的生成和积聚也越来越多，从而引起皮肤的生理性衰老。衰老皮肤组织分子间的糖化交联会促使皮肤老化加速而逐渐丧失弹性，皮肤变得僵硬和暗哑。真皮层内的胶原蛋白被糖化后，胶原蛋白纤维的弹性下降，使得肌肤的张度缺失，便产生了皮肤松弛，进而形成皱纹。作为AGEs的重要前体，二羰基化合物，如乙二醛(GO)、丙酮醛(MGO)等是造成糖化的主力军。近年来抗糖化食品、保健品陆续出现，但都存在抗糖化效果不理想，抗糖化活性成分难以发挥其作用等缺陷。因此，急需研究出一种安全性高、无刺激、抗糖化效果明显的食品。

现有研究发现槐米中含有多种生物活性物质，主要包括芸香苷——芦丁、三萜皂苷、白桦脂醇、槐花二醇、葡萄糖、葡萄糖酸醛等，这些功能活性成分在医疗保健品、美妆护肤、副食产品及生活日用品等领域有着广泛的应用潜能。芦丁和槲皮素是槐米及其制品具有抗糖、抗自由基等功效的主要活性成分。因此，探索合适的处理工艺，最大限度地提高槐米中有效成分的代谢、吸收及生物利用度，发挥槐米的生物活性成为槐米深度加工研究的关键。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题在于，提供一种抗糖化的槐米粉的制备方法，有效提高了槐米中的功效成分，制备工艺简单且抗糖化效果好，可抑制MGO和GO活性。

本发明所要解决的第二个技术问题在于，提供一种抗糖化的槐米粉及其应用，口感好、易吸收、安全性高、抗糖化效果好。

为达到上述技术效果，本发明提供了一种抗糖化的槐米粉的制备方法，包括：

(1)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋0.5～4wt％的发酵液进行发酵，干燥粉碎后得到发酵槐米粉，其中，所述发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌组成；

(2)向所述发酵槐米粉中添加复合酶进行酶解反应；

(3)将酶解反应后的发酵槐米粉进行灭酶处理，得到灭酶混合物；

(4)将所述灭酶混合物与氨基酸进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

作为上述方案的改进，所述黑曲霉菌的制备方法为：从柚子果园枯叶中筛选黑曲霉菌菌种，接种到液态培养基培养，得到黑曲霉菌菌液；

所述液态培养基包括以下组分：玉米淀粉、麸皮、豆饼粉、豆渣、硫酸铵、磷酸二氢钾和氯化钙。

作为上述方案的改进，步骤(1)所述黑曲霉菌和双歧杆菌的质量比为(5～7)：(3～5)；

步骤(1)所述发酵过程在温度为35～45℃、湿度为60～75％的条件下发酵5～10天，发酵的同时每天喷淋发酵液。

作为上述方案的改进，步骤(2)中，所述发酵槐米粉与所述复合酶的添加比例为(80～90)：(10～20)；

所述复合酶包括淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶、果胶酶中的一种或多种。

作为上述方案的改进，所述复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物，所述纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为(0.8～1.8)：(0.5～1)：(0.3～1.5)。

作为上述方案的改进，步骤(2)中，所述酶解反应的温度为30～50℃、pH为6～7，反应时间为1～3h。

作为上述方案的改进，所述氨基酸为精氨酸。

作为上述方案的改进，所述灭酶混合物与所述氨基酸的添加比例为(90～100)：(9～15)。

相应的，本发明还提供了通过上述的制备方法制得的抗糖化的槐米粉及其在制备抗糖化食品或保健品中的应用。所述槐米粉成品在抗糖化食品或保健品中的浓度为3～5μg/ml，可以对MGO和GO起到较好的抑制效果；所述槐米粉成品在抗糖化食品或保健品中的浓度为500～1000μg/ml，可以对葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖等多种糖类体系中AGEs的形成都起到良好的抑制效果。

实施本发明具有如下有益效果：

本发明抗糖化的槐米粉，可以更好的提高槐米中的功效成分，制得产品的纯度高、抗糖化能力强，更有利于人体吸收。而且，能减轻槲皮素的苦味，提高槐米粉的口感，在保证感官品质不受影响的同时进一步增加吸收能力。

本发明抗糖化的槐米粉可以在较低剂量下实现较好的抗糖化效果，通过抑制糖基化前体二羰基化合物的活性，从而抑制糖基化终末产物的形成，3～5μg/ml的槐米粉对MGO的抑制率在10min内就可达75％以上，在牛血清蛋白糖基化模型中，终浓度为500～1000μg/ml的槐米粉对糖基化终末产物的抑制率可达60％以上。

本发明抗糖化的槐米粉的应用范围广，当其用于抗糖化食品或保健品时，成分简单、制备方便、抗糖化效果好。

附图说明

图1是本发明实施例4中抗糖化槐米粉浓度对乙二醛(GO)活性的影响；

图2为本发明实施例4中抗糖化槐米粉浓度对丙酮醛(MGO)活性的影响；

图3为本发明对比例5中抗糖化槐米粉浓度对糖基化终末产物(AGEs)形成的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

本发明提供了一种抗糖化的槐米粉的制备方法，包括：

(1)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋0.5～4wt％的发酵液进行发酵，干燥粉碎后得到发酵槐米粉，其中，所述发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌组成。

本发明发酵液选用黑曲霉菌和双歧杆菌的复配，其中，黑曲霉菌能够通过发酵将大分子糖类分解成单糖和寡糖，并生成有机酸、维生素、生物酶和生长因子等，提高发酵后槐米粉的营养水平和消化吸收率；双歧杆菌有利于人体的健康，能够增强胃肠道内的免疫功能，增加营养物质的吸收和消化，平衡体内的菌群失调。

其中，发酵液中黑曲霉菌和双歧杆菌的质量比优选为(5～7)：(3～5)；更优为(5～6)：(3～4)。

槐米粉在酶解前先利用黑曲霉菌和双歧杆菌进行发酵，通过发酵提高槐米中可转化成分的含量，促进人体对槐米中有效成分的更好吸收。

优选的，发酵过程在温度为35～45℃、湿度为60～75％的条件下发酵5～10天，发酵的同时每天喷淋发酵液，以更好地改善发酵效果。

进一步，黑曲霉菌的制备方法为：从柚子果园枯叶中筛选黑曲霉菌菌种，接种到液态培养基培养，得到黑曲霉菌菌液；液态培养基包括以下组分：玉米淀粉、麸皮、豆饼粉、豆渣、硫酸铵、磷酸二氢钾和氯化钙。

通过上述方法获得的黑曲霉菌，原料来源丰富，且能实现生物质资源的充分利用，可以用于大规模生产，并协同双歧杆菌进行发酵，以提高槐米粉中具有抗糖化效果的有效成分的含量。

具体的，本发明使用的黑曲霉菌的制备过程包括：从柚子果园枯叶中筛选的黑曲霉菌中挑取一个单菌落，接种到液态培养基中，在25～35℃，150～200rpm条件下震荡培养3～6天，得到黑曲霉菌菌液；

其中，液态培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉2～6％、麸皮3～8％、豆饼粉2～6％、豆渣6～15％、硫酸铵0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.1～0.5％、氯化钙0.2～0.7％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。

(2)向步骤(1)得到的发酵槐米粉中添加复合酶，进行酶解反应；

其中，发酵槐米粉与复合酶的添加比例为(80～90)：(10～20)；复合酶包括淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶、果胶酶中的一种或多种。

优选的，复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物。

纤维素酶主要由内切、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，可将纤维素分解成为多糖或者单糖的蛋白质或RNA。果胶酶能使果胶分解，通常包括原果胶酶、果胶酸酶、果胶甲酯水解酶等，多酶复合物联合作用使果胶质分解完全。β-葡萄糖苷酶可以参与纤维素的代谢以及多种生理生化途径。

利用复合酶破坏槐米的组织结构，尤其能够避免因纤维素、果胶等成分的包裹导致槐米的成分不能充分发挥，使槐米中的有效成分充分暴露，将槐米粉中的有效成分酶解成更容易吸收的糖类物质，有利于协同发酵工序和后续的操作步骤进而提高槐米粉中有效成分的吸收能力。

其中，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为(0.8～1.8)：(0.5～1)：(0.3～1.5)。

最优的，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为1：0.5：1。

当纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为(0.8～1.8)：(0.5～1)：(0.3～1.5)时，能够很好的实现复合酶的协同作用，在复合酶的协同作用下，酶解处理后的发酵槐米粉的功效成分纯度高、抗糖化能力强，更有利于人体吸收。

优选的，酶解反应的温度为30～50℃，pH为6～7，反应时间为1～3h。

更优的，酶解反应的温度为40℃，pH为6.5，反应时间为2h。

酶解条件选择适合复合酶反应的温度、pH和时间，使得复合酶的活性最佳，能够更好的发挥复合酶的酶解作用，得到的酶解槐米粉的有效成分更多。

(3)将步骤(2)得到的混合物进行灭酶处理，得到灭酶混合物；

为了保证槐米粉的保存质量，在酶解后对其进行灭酶处理，灭酶处理可以采用常规的焙炒、常压蒸煮、高压蒸煮、远红外处理或微波处理等，热处理的灭酶方法还可以增加槐米粉的香味。

(4)将步骤(3)得到的灭酶混合物与氨基酸进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

氨基酸优选为精氨酸；灭酶混合物与氨基酸的添加比例为(90～100)：(9～15)。

精氨酸的加入有利于提升槐米粉的口感，由于槐米粉发酵酶解后，带有苦味的槲皮素含量升高，提高起作用成分含量的同时对槐米粉整体风味造成不利影响，因此通过将灭酶混合物与精氨酸混合，提升槐米粉整体的口感，减轻苦味，同时增加营养成分，同时由于黄酮类成分的水溶性和脂溶性都很小，人体难以吸收，从而导致其生物利用度很低，将酶解处理后的槐米粉与精氨酸结合制备成混合粉末，能增加槲皮素在水中的溶解度，提高营养物质的吸收率。

相应的，本发明还提供了通过上述的制备方法制得的抗糖化的槐米粉，以及上述抗糖化的槐米粉在制备抗糖化食品或保健品中的应用。

下面以具体实施例进一步阐述本发明。

实施例1

(1)从筛选得到的黑曲霉菌中挑取一个单菌落，接种到液态培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养4天，得到黑曲霉菌菌液；其中，液态培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉4％、麸皮5％、豆饼粉4％、豆渣10％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钙0.5％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。

(2)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋3wt％的发酵液在温度40℃、湿度65％的条件下发酵6天，发酵的同时每天喷淋发酵液，发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌以质量比3：2组成，发酵完成后将槐米干燥粉碎得到发酵槐米粉；

(3)向9kg发酵槐米粉中添加1kg复合酶，其中，复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为1：0.5：1，在40℃、pH＝6.5的液体体系中进行酶解反应，2h后得到混合物。

(4)将步骤(3)得到的混合物进行灭酶处理，得到灭酶混合物。

(5)将步骤(4)得到的灭酶混合物与精氨酸10：1进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

实施例2

(1)从筛选得到的黑曲霉菌中挑取一个单菌落，接种到液态培养基中，在35℃，190rpm条件下震荡培养3天，得到黑曲霉菌菌液；其中，液态培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉4.5％、麸皮4％、豆饼粉3.5％、豆渣11％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钙0.5％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。

(2)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋3.5wt％的发酵液在温度35℃、湿度65％的条件下发酵7天，发酵的同时每天喷淋发酵液，发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌以质量比7：5组成，发酵完成后将槐米干燥粉碎得到发酵槐米粉；

(3)向9kg发酵槐米粉中添加1kg复合酶，其中，复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为1.5：0.8：1，在40℃、pH＝6.5的液体体系中进行酶解反应，2h后得到混合物。

(4)将步骤(3)得到的混合物进行灭酶处理，得到灭酶混合物。

(5)将步骤(4)得到的灭酶混合物与精氨酸9：1进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

实施例3

(1)从筛选得到的黑曲霉菌中挑取一个单菌落，接种到液态培养基中，在25℃，160rpm条件下震荡培养5天，得到黑曲霉菌菌液；其中，液态培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉5％、麸皮5％、豆饼粉4％、豆渣9％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钙0.5％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。

(2)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋3wt％的发酵液在温度35℃、湿度65％的条件下发酵5天，发酵的同时每天喷淋发酵液，发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌以质量比1：1组成，发酵完成后将槐米干燥粉碎得到发酵槐米粉；

(3)向8kg发酵槐米粉中添加1kg复合酶，其中，复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为1：0.5：0.8，在40℃、pH＝6.5的液体体系中进行酶解反应，2h后得到混合物。

(4)将步骤(3)得到的混合物进行灭酶处理，得到灭酶混合物。

(5)将步骤(4)得到的灭酶混合物与精氨酸10：1进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

对比例1

(1)从筛选得到的黑曲霉菌中挑取一个单菌落，接种到液态培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养4天，得到黑曲霉菌菌液；其中，液态培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉4％、麸皮5％、豆饼粉4％、豆渣10％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钙0.5％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。

(2)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋3wt％的发酵液在温度40℃、湿度65％的条件下发酵6天，发酵的同时每天喷淋发酵液，发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌以质量比3：2组成，发酵完成后将槐米干燥粉碎得到发酵槐米粉；

(3)将步骤(2)得到的发酵槐米粉与精氨酸10：1进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

对比例2

(1)将干燥后的槐米进行粉碎，得到槐米粉；

(2)向9kg槐米粉中添加1kg复合酶，其中，复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为1：0.5：1，在40℃、pH＝6.5的液体体系中进行酶解反应，2h后得到混合物。

(3)将步骤(2)得到的混合物进行灭酶处理，得到灭酶混合物。

(4)将步骤(3)得到的灭酶混合物与精氨酸10：1进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

对比例3

(1)从筛选得到的黑曲霉菌中挑取一个单菌落，接种到液态培养基中，在30℃，180rpm条件下震荡培养4天，得到黑曲霉菌菌液；其中，液态培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉4％、麸皮5％、豆饼粉4％、豆渣10％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钙0.5％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。

(2)获得槐米原料，并进行清洗，将清洗后的槐米原料置于发酵箱中，通过喷淋3wt％的发酵液在温度40℃、湿度65％的条件下发酵6天，发酵的同时每天喷淋发酵液，发酵液由黑曲霉菌和双歧杆菌以质量比6：1组成，发酵完成后将槐米干燥粉碎得到发酵槐米粉；

(3)向9kg发酵槐米粉中添加1kg复合酶，其中，复合酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的混合物，纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶的质量比为1：1：2，在40℃、pH＝6.5的液体体系中进行酶解反应，2h后得到混合物。

(4)将步骤(3)得到的混合物进行灭酶处理，得到灭酶混合物。

(5)将步骤(4)得到的灭酶混合物与精氨酸10：1进行混合，干燥后得到槐米粉成品。

将实施例1～3和对比例1～3制得的槐米粉进行测试，测试槐米粉对丙酮醛(MGO)和乙二醛(GO)活性的影响。

测试方法：在15ml离心管中，加入1mM MGO与GO样品标准液5ml，再向其中加入5ml5μg/ml的槐米粉的甲醇配制液，混匀后在37℃、50转/min的摇床中震荡反应，在60min取出1ml的样液，加入10ul的乙酸终止反应，并在-80℃条件下冻存，每个样本做三个平行。测定不同样品的MGO与GO的含量，计算槐米粉对MGO与GO的抑制率。

测试结果如表1所示：

表1槐米粉对丙酮醛(MGO)和乙二醛(GO)活性的影响

从表1中可以看出，实施例1～3的槐米粉可以显著提高对MGO和GO活性的抑制，有研究表明，与GO相比，MGO和牛血清蛋白糖基化的反应活性高、速度快，MGO产生的AGEs远高于GO产生的AGEs，实施例1～3的槐米粉对MGO的抑制率可达80％，显著高于对比例1～3，对GO的抑制率也高于对比例1～3。综上所述，本发明提供的槐米粉可显著提高对糖基化前体二羰基化合物的抑制率，从而达到抑制AGEs生成的功效。

实施例4

槐米粉浓度对丙酮醛(MGO)和乙二醛(GO)活性的影响

在15ml离心管中，加入1mM MGO与GO样品标准液5ml，再向其中加入5ml不同浓度的槐米粉甲醇配制液，其中槐米粉由实施例1制得，槐米粉的浓度分别为1μg/ml、3μg/ml和5μg/ml，样品标准液与槐米粉甲醇配置液混匀后在37℃、50转/min的摇床中震荡反应，分别在0、10、30、60、120和240min取出1ml的样液，加入10ul的乙酸终止反应，并在-80℃条件下冻存，每个样本做三个平行实验。测定不同样品的MGO与GO的含量，计算槐米粉对MGO与GO的抑制率，结果如图1和图2所示。

实施例5

槐米粉浓度对糖基化终末产物(AGEs)形成的影响

用浓度为0.2mM，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液溶解牛血清白蛋白(BSA)，在10ml的样品管中加入青霉素和链霉素的混合溶液0.2ml以及4.5mg/ml BSA稀释液2ml，再加入稀释后的葡萄糖，果糖，半乳糖和核糖溶液至糖类浓度均为10mM，在上述四种糖类溶液体系中加入不同浓度的槐米粉溶液，其中槐米粉由实施例1制得，并加入磷酸盐平衡生理盐水(PBS)至6ml，使槐米粉的最终浓度分别为5μg/ml、50μg/ml、250μg/ml和1000μg/ml，37℃水浴加热，720h后-20℃冷冻贮藏。测定相对荧光值，并计算抑制率，结果如图3所示。

通过图1和图2可以看出，本发明制得的槐米粉对MGO和GO的抑制效果好。反应从0min进行到10min过程中，槐米粉对MGO和GO的抑制率迅速升高，随着反应时间的继续推移，槐米粉对MGO的抑制率缓慢升高并逐渐趋于平缓，当反应进行到10min时，1μg/ml的槐米粉对MGO的抑制率接近60％，低浓度的槐米粉已经能够在短时间内对MGO达到很好的抑制效果，当反应进行到60min时，5μg/ml对GO的抑制率也能达到50％以上。由于MGO产生的AGEs远高于GO产生的AGEs，因此对MGO的高抑制率可以达到很好的抑制AGEs生成的效果。因此，本发明提供的槐米粉在较低浓度(浓度为3～5μg/ml)、较短时间内(60min)就可以对MGO和GO起到较好的抑制效果。

通过图3可以看出，本发明制得的槐米粉对不同的糖类与BSA产生的AGEs都具有抑制作用，尤其是葡萄糖，随着添加槐米粉的浓度增加，对AGEs的抑制率显著增加。当槐米粉的浓度为500μg/ml时，槐米粉对葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖与BSA产生的AGEs的抑制率都大于50％，尤其对葡萄糖产生的AGEs的抑制率可以达60％以上；当槐米粉的浓度为1000μg/ml时，槐米粉对葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖与BSA产生的AGEs的抑制率都大于70％，尤其对葡萄糖产生的AGEs的抑制率可以达80％以上。因此，本发明提供的槐米粉在终浓度为500～1000μg/ml的条件下，可以对葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖等多种糖类与BSA产生的AGEs都能起到良好的抑制效果。

由上可知，本发明抗糖化的槐米粉在较低剂量下、较短时间内就可以较好的实现对MGO和GO活性的抑制，并能有效抑制各类糖与蛋白质反应体系中AGEs的形成，抗糖化效果好。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。