α-酮戊二酸盐在制备改善糖尿病心肌病药物中的应用

技术领域：

本发明属于生物医药及心脑血管疾病治疗技术领域，具体涉及α-酮戊二酸盐在制备改善糖尿病心肌病的药物中的应用。

背景技术：

糖尿病心肌病(DCM)是指一种独立于高血压和冠状动脉疾病的原发型心肌损伤，主要以左心室肥大和舒张功能受损为早期表现，晚期以心脏纤维化和收缩功能障碍为特征，最后可诱发心力衰竭、心率失常及心源性休克，重症患者甚至猝死。DCM的发病过程涉及氧化应激、内质网应激、线粒体功能障碍、炎症反应、自噬、细胞凋亡、微血管功能障碍等病理生理过程。高血糖、胰岛素抵抗和代谢紊乱等可以通过各种机制最终导致心脏功能受损。根据美国心脏病学会基金会(ACCF)和美国心脏协会(AHA)联合制订的最新版心力衰竭治疗指南中指出，糖尿病心肌病患者的预后较差且目前尚无较好的治疗药物。

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)是三羧酸循环中的一个重要环节，其不仅是三羧酸循环中重要的代谢中间产物，还是生物体内L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸等多种氨基酸、维生素和有机酸的生物合成前体，动物实验也显示出了其口服的安全性。此前有研究报道，外源添加α-KG可显著提高正常小鼠的运动能力，激活蛋白质合成相关信号通路，增加肌肉蛋白质合成增加。α-KG可以降低系统性炎症细胞因子水平，改善雌性小鼠的毛色和毛发状况、步态和脊柱后凸，并且有助于保持雄性小鼠的肌肉质量，步态和握力，雌雄小鼠寿命均有所延长。因此α-KG被认为是一种重要的活性代谢中间产物，在干细胞发育、抗衰老、抗癌和调节能量代谢等方面均具有重要作用，围绕α-KG的研究和药物开发是目前国内外研究的前沿领域，一系列研究表明了α-KG作为药物靶点在临床药物开发方面的广泛前景，然而其在改善和治疗糖尿病心肌病方面的应用鲜有研究报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供α-酮戊二酸盐在制备改善糖尿病心肌病药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供α-酮戊二酸盐在制备改善糖尿病心肌病的药物中的应用，α-酮戊二酸盐能降低高血糖、高血脂，改善胰岛素抵抗以及高血糖和胰岛素抵抗导致的心脏功能障碍，例如空腹血糖胰岛素、血脂的明显降低、糖耐受和胰岛素抵抗的明显改善；同时，能有效改善糖尿病心肌病引起的心脏收缩功能障碍，减轻心肌组织病理损伤及纤维化程度。

进一步的，所述的α-酮戊二酸盐为α-酮戊二酸钠盐、α-酮戊二酸钙盐或α-酮戊二酸镁盐。

进一步的，所述药物剂型为：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液或乳剂。

所述药物为含α-酮戊二酸盐的药物或药物组合物，所述药物或药物组合物的给药途径为口服给药。

本发明与现有技术相比，首次将α-酮戊二酸盐用于糖尿病心肌病的治疗，α-酮戊二酸盐能够改善糖尿病心肌病小鼠的心肌肥大、心肌纤维化及心脏收缩功能，并降低小鼠的血糖，改善血脂，降低胰岛素抵抗，为临床上使用α-酮戊二酸盐治疗糖尿病心肌病提供了重要依据。

附图说明：

图1为本发明涉及的DCM造模组小鼠第8周体重及OGTT、ITT结果示意图，其中A为OGTT，B为OGTT曲线下面积；C为ITT，D为ITT曲线下面积。

图2为本发明涉及的α-KG钙盐对DCM小鼠心脏功能的影响实验结果示意图，其中A为第24周心脏M-Mode超声结果，B为第24周的LVIDs，C为第24周的LVIDd，D为第24周的LVEF，E为第24周的LVFS。

图3为本发明涉及的α-KG钙盐对DCM小鼠体重、心脏脏器系数的影响实验结果示意图，其中A为体重，B为心脏重量/体重的比值。

图4为本发明涉及的α-KG钙盐对DCM小鼠血生化、血糖、胰岛素等指标的影响实验结果示意图，其中A为口服葡萄糖耐量实验(OGTT)、B为空腹胰岛素水平(FINS)、C为胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、D为总胆固醇(TC)、E为甘油三酯(TG)。

图5为本发明涉及的α-KG钙盐对DCM小鼠心脏组织病理的影响实验结果示意图，其中A为HE染色、B为Masson染色。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

本实施例涉及α-酮戊二酸盐对高脂饮食诱导的糖尿病心肌病小鼠的影响实验，为验证α-酮戊二酸盐对于糖尿病心肌病的改善作用，采用高脂饮食构建糖尿病心肌病小鼠模型，观察给予α-酮戊二酸盐干预后小鼠心脏功能和组织结构的变化情况，具体实验步骤如下：

1、糖尿病心肌病动物模型的建立及分组

本实施例采用购自北京维通利华的SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠(20±2g)50只用于测试。所有动物实验均按照《青岛大学动物实验伦理审查委员会指南》(审批号：2022-472)进行，并尽最大努力减少动物的痛苦。小鼠在温度(24±2)℃、湿度(50±5)％下自由进食和饮水一周。随机选取10只小鼠作为正常对照组(NC组)，给予10％脂肪供能比的普通饲料(D12450J)喂养；剩余40只小鼠为造模组，给予60％脂肪供能比的高脂饲料(D12492)喂养，8周后对两组小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)、胰岛素耐量试验(ITT)，实验步骤及结果如下：

(1)在第8周时，对正常对照组和造模组小鼠进行OGTT试验。小鼠过夜禁食12h后，每只小鼠进行50％葡萄糖溶液(1g/kg体重)灌胃，分别在0min、30min、60min、90min、120min后，使用罗氏血糖仪测定小鼠尾静脉血糖浓度，并按照下述公式计算OGTT曲线下面积。曲线下面积(AUC)(mmol·h

(2)对正常对照组和造模组小鼠进行ITT试验。小鼠过夜禁食8h后，以初次测量的血糖为0min的初始血糖，立即腹腔注射胰岛素(0.5U/kg)，分别于注射后30min、60min、90min、120min时用罗氏血糖仪测量尾静脉的血糖值，并按照下述公式计算ITT曲线下面积。曲线下面积(AUC)(mmol·h

进一步于造模组小鼠中随机选取30只，按照随机数字表法分为：糖尿病心肌病小鼠组(DCM模型组)、α-酮戊二酸组(α-KG组)和阳性对照二甲双胍组(MET组)，每组10只；DCM模型组和MET组继续喂养高脂饮食(D12492)，α-KG组给予加入2％w/wα-酮戊二酸钙盐(α-KG钙盐)的60％脂肪供能比的高脂饲料进行喂养；每组小鼠饲料喂养量5g/d。同时，MET组小鼠每日给予二甲双胍(150mg/kg·bw)灌胃，NC组、DCM模型组和α-KG组小鼠每日灌胃同体积0.5％羟甲基纤维素钠缓冲液，治疗24周结束后，通过超声心动图评估小鼠心功能，随后处死动物，取血液、心脏组织进行进一步研究。

2、检测α-KG钙盐对DCM小鼠心脏功能的影响

第24周时，称量每组小鼠体重，禁食不禁水12h，腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠麻醉，进行小鼠心脏彩色多普勒超声检查。麻醉后仰卧位固定小鼠，暴露胸腹部并剃毛，清洁后涂抹适量超声耦合剂，启动彩色多普勒程序，主要测量左室舒张末期前壁厚度(LVAWd)、左室收缩末期前壁厚度(LVAWs)，左室舒张末期后壁厚度(LVPWd)、左室收缩末期后壁厚度(LVPWs)，左室收缩期内径(LVIDs)、左室舒张期内径(LVIDd)，计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)，结果如图2所示。

图2A-2C显示出了第24周各组小鼠心脏M-Mode超声结果。从图2A-2C图可以看出，DCM模型组小鼠LVIDs和LVIDd显著高于NC组(P<0.01)，说明DCM模型组小鼠的左心室腔增大且室壁变薄，并伴有心脏收缩功能受损；α-KG组小鼠的LVIDs和LVIDd显著低于DCM模型组小鼠(P<0.05)。

左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短分数(LVFS)的测定结果如图2D-2E图所示，与NC组相比，DCM模型组小鼠的LVEF、LVFS均显著降低；而α-KG组以及阳性对照MET组小鼠的LVEF和LVFS均显著高于DCM模型组，说明α-KG钙盐、MET均能有效提高左心室射血分数和左室短轴缩短分数。

以上这些结果表明，α-KG钙盐能显著改善DCM小鼠的左心室收缩功能。

3、检测α-KG钙盐对DCM小鼠血生化、血糖、胰岛素水平等指标的影响

在第24周处死小鼠前，各组小鼠过夜禁食12h后，使用罗氏血糖仪对小鼠尾静脉采血，进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，并通过公式计算曲线下面积。3天后，小鼠禁食并眼球采血，将新鲜标本置于4℃低温离心机中，在3000rmp下离心10min，取上清，于80℃冰箱保存后检测血液中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)等，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，结果如图4所示。

图4A显示了各组小鼠第24周OGTT实验结果。从图4A可以看出，DCM模型组OGTT曲线下面积与NC组相比显著升高(P<0.01)，说明整个实验周期内DCM模型组小鼠糖耐量异常；α-KG组小鼠OGTT曲线下面积与DCM模型组相比显著降低(P<0.01)，说明α-KG钙盐能够增加胰岛素的敏感性，改善糖耐量异常现象。

图4B-4C显示了各组小鼠空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)实验结果。从图4B-4C可以看出，与DCM组相比，α-KG组小鼠的空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著降低，说明α-KG钙盐能够显著降低DCM小鼠的胰岛素抵抗指数，而胰岛素抵抗指数的增加与DCM的发生发展密切相关，因此α-KG钙盐能够用于治疗DCM。

图4D-4E显示了各组小鼠总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平实验结果。从图4D-4E可以看出，与NC组相比，DCM模型组小鼠TC、TG水平均显著升高(P<0.01)；α-KG组小鼠TC、TG水平均明显低于DCM模型组(P<0.01)。说明α-KG钙盐能够降低DCM小鼠的TC、TG水平。

4、检测α-KG钙盐对DCM模型小鼠体重、心脏脏器系数的影响

第8周造模成功后，每周对各组小鼠进行体重测量，结果如图3A所示。治疗24周结束后，各组小鼠眼球取血后，解剖取出心脏并称量，计算每只小鼠的心脏重量/体重比值，结果如图3B所示。

从图3A可以看出，第8周时，DCM模型组、α-KG组、MET组小鼠之间的基线体重没有显著差异，但与NC组相比，三组小鼠体重均显著升高(P<0.01)；第8周后，α-KG组、MET组小鼠的体重均显著低于DCM模型组(P<0.01)，说明α-KG钙盐有效降低了糖尿病心肌病小鼠的体重，即α-KG钙盐能够用于改善DCM。

从图3B可以看出，DCM模型组的心脏重量/体重比值与NC组相比显著升高(P<0.05)；而α-KG组、MET组小鼠心脏脏器系数均显著低于DCM模型组(P<0.01)，说明采用α-KG钙盐治疗能够降低糖尿病心肌病小鼠的心脏重量/体重比值，而心脏重量/体重比值与DCM的病理性心肌肥厚相关，因此α-KG钙盐能够用于改善DCM小鼠的病理性心肌肥厚。

5、检测α-KG钙盐对DCM小鼠心脏组织病理的影响

第24周时，处死各组小鼠，解剖心脏，分别取心尖部同一部位组织，快速分离出心室肌后放置于10％的中性福尔马林缓冲液中固定24h，常规处理后包埋、切片，厚度2μm，然后进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色，常规制片，采用数字扫描仪扫描切片。采用Image-Pro plus 6.0图像分析软件进行半定量分析，结果如图5所示。

图5A-5B显示了NC组、DCM模型组、α-KG组、MET组小鼠的心脏组织病理结果[图A：HE染色(×400)；图B：Masson染色(×400)]。正常对照组小鼠的心肌纤维排列整齐，细胞结构清晰，细胞核大小均一，心肌间胶原纤维少；DCM模型组小鼠的心肌纤维排列紊乱，心肌细胞肥大变性，血管周围胶原纤维明显增多；与DCM模型组相比，α-KG组、MET组小鼠的心肌细胞肥大及胶原排列紊乱均得到改善，心肌间胶原纤维明显减少。由此说明，α-KG钙盐能够明显改善DCM小鼠的心肌细胞肥大及心肌纤维化。