一种包含低聚共轭亚油酸囊泡的载药脂质体水凝胶

技术领域

本发明涉及一种包含低聚共轭亚油酸囊泡的载药脂质体水凝胶，及其组成和制备方法，属于缓释体系制备技术领域。

背景技术

多糖水凝胶，如壳聚糖(CS)水凝胶是非常有效的绿色药物传递系统，然而该系统却存在突释效应(burst effect)，即释药量陡增的现象。这种现象对应于给药后会快速释放大量胶囊药物。但是，在许多场合，短期高浓度的药物不如持续低浓度的药物有效。因此，需要通过设计更有效的药物传递系统来减少这种突发效应。例如将药物整合到脂质体胶体中，脂质体胶体本身嵌入CS水凝胶，形成水凝胶/脂质体药物制剂。初始水凝胶/脂质体药物制剂以液体形式直接注射到靶向部位，在体温下迅速转化为固体凝胶。随后，药物从形成的固体凝胶持续释放到治疗部位。同时，药物在水凝胶/脂质体系统中，脂质膜充当二级屏障，脂质体和CS水凝胶都具有控制药物缓释的能力，从而提高药物在该系统中的缓释效果，提高药物稳定性。

然而，目前以磷脂酰胆碱和胆固醇为原料制备的脂质体具有生物相容性低、所用的卵磷脂和胆固醇等原料价格较高、制备方法复杂等原因限制其应用。另一方面，缺乏绿色友好的、既能包埋疏水性药物(如姜黄素，Cur)又能包埋亲水性药物并且能够改善多糖水凝胶突释效应的绿色运载体系。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有载药脂质体生物相容性低、原料昂贵，多糖水凝胶载药体系有突释效应，不能兼顾疏水性药物、亲水性药物。

[技术方案]

本发明提供一种包含低聚共轭亚油酸囊泡的载药脂质体水凝胶，先将共轭亚油酸(CLA)聚合制备成低聚共轭亚油酸(OCLA)，然后将OCLA自组装成低聚共轭亚油酸囊泡(OCLAVs)，并将OCLAVs载入药物(以Cur为例)以制备载药低聚共轭亚油酸囊泡(例如Cur-OCLAVs)；再将此载药低聚共轭亚油酸囊泡(Cur-OCLAVs)包合到壳聚糖(CS)水凝胶体系中，制备成载药脂质体水凝胶(例如Cur-OCLAVs-CS)。由此，以OCLAVs和CS水凝胶为双层释药屏障，提高药物的包封和缓释效果。

本发明提供了制备所述包含低聚共轭亚油酸囊泡的载药脂质体水凝胶的方法，主要包括以下步骤：

(1)制备低聚共轭亚油酸(OCLA)，所述低聚是指聚合度低于6；

(2)制备低聚共轭亚油酸囊泡(OCLAVs)悬浮液并包封药物得到载药低聚共轭亚油酸囊泡

针对疏水性药物，将OCLA与溶于乙醇溶液(或丙酮、乙醚)的药物充分混合，再减压旋转蒸发去除溶剂，接着，添加溶于碱溶液的SDS并搅拌分散，然后将pH值调节到7.4左右，震荡混合物，得到包封疏水性药物的OCLAVs；

针对亲水性药物，将OCLA与溶于水的药物充分混合，再减压旋转蒸发去除水，接着，添加溶于碱溶液的SDS并搅拌分散，然后将pH值调节到7.4左右，震荡混合物，得到包封亲水性药物的OCLAVs；

(3)制备壳聚糖(CS)水凝胶并将载药低聚共轭亚油酸囊泡包合到壳聚糖(CS)水凝胶中

将脱乙酰度90％、Mw＝300kDa的CS和磷酸甘油二钠(β-GP)分别溶于0.15M的醋酸水溶液和去离子水中，分别得到壳聚糖溶液和β-GP溶液，将两种溶液在4℃冷却30min；接着，将壳聚糖溶液在冰水浴中搅拌，将β-GP溶液缓慢滴入壳聚糖溶液中，调节溶液pH至6.5，搅拌10min，得到CS/β-GP水凝胶，其中，壳聚糖和β-GP(w/w)的终浓度分别为2.5％和10.7％；

室温下，以1:5的体积比将步骤(2)得到的载药低聚共轭亚油酸囊泡加入到CS/β-GP水凝胶中，之后，将样品搅拌10min，并在37℃形成载药脂质体水凝胶。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)制备低聚共轭亚油酸：将8.0g CLA放置在25mL三口烧瓶中，在搅拌下缓慢滴加NaOH水溶液(8.6％w/w)，形成的共轭亚油酸钠(SCL)溶液约为16.6％(w/w)；将共轭亚油酸钠溶液在均质机中均质2min(10000r/min)，获得白色乳液；接着，向该白色乳液中添加0.24g引发剂APS，室温下通氮30min，将烧瓶封口并在80℃水浴中震荡20h后停止反应；用HCl(10％w/w)将上述反应液酸化至pH 2.0-3.0，并转移到分离漏斗中，用少量无水乙醚萃取；最后用饱和盐水洗涤乙醚萃取液至中性，并在醚层中加入无水Na

其中，A

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中：

针对疏水性药物，以姜黄素为例，将0.42g OCLA与50mL姜黄素(Cur)乙醇溶液充分混合，并在50℃下通过减压旋转蒸发去除乙醇；接着，将溶解在50mL(0.1M)NaOH水溶液中的0.042g SDS添加到OCLA-Cur混合物中并搅拌分散；然后用HCl(1M)将体系的pH值调节到7.4左右；在30℃和120rpm下震荡混合物4h即可，得到包封姜黄素的OCLAVS悬浮液(Cur-OCLAVs)；

针对疏水性药物，以罗丹明6G为例，Rh6G-OCLAVs的制备方法除了将罗丹明6G(Rh6G)溶解在水相中，其余步骤与Cur-OCLAVs的制备方法相同。

[有益效果]

由不饱和脂肪酸形成的囊泡具有良好的生物相容性和生物降解性、无毒性和低免疫原性，是医药和食品领域的优秀载体。同时，作为细胞膜成分的不饱和脂肪酸不仅为身体提供能量，而且具有良好的抗癌和抗炎作用。其中，共轭亚油酸(CLA)分子结构中的羧基对pH刺激反应灵敏，赋予共轭亚油酸自组装活性；其次，共轭亚油酸分子结构中的共轭双键可以提供可聚合位点，从而赋予共轭亚油酸自交联活性。若利用CLA自组装形成囊泡，并对CLA部分聚合，可得到生物降解性高以及生物相容性好的聚合CLA囊泡体系，并用于CS水凝胶体系中，实现在食品、药品等领域的应用。同时，CLA具有有益的生理活性、自组装活性和自交联活性，有望在分子自组装和有序自组装结构固定领域发挥更大的潜力。

本发明所用原材料是绿色友好的脂肪酸和壳聚糖，所得脂质体水凝胶既能包埋疏水性药物又能包埋亲水性药物，并且可以缓解壳聚糖类水凝胶的突释效应。

附图说明

图1：CLAVs及OCLAVs包封姜黄素聚合前后外观(A-D)、紫外吸收光谱(E)、包封姜黄素前后粒径变化(F、G)及OCLA分子量(H)。

图2：温敏性壳聚糖水凝胶。(A/A’)空白壳聚糖水凝胶(4℃)；(B)空白壳聚糖水凝胶(37℃)；(C)罗丹明6G/壳聚糖水凝胶(37℃)；(D)姜黄素/壳聚糖水凝胶(37℃)。

图3：(A)OCLAVs、(B)OCLAVs-CS水凝胶和(C)Cur-OCLAVs-CS水凝胶的TEM图像。3mMOCLA(pH 7.4)，2.5wt％CS，50μM Cur。

图4：OCLAVs、CS及OCLAVs-CS水凝胶对不同浓度的姜黄素体外释放。

图5：包封不同浓度姜黄素的OCLAVs-CS的抗氧化活性。A：DPPH自由基清除率，B：ABTS自由基清除率；C：铁离子还原能力。CLA 30mM，CS 2.5wt％。

图6：Rh6G在CS水凝胶和OCLAVs-CS水凝胶中的体外释放及释放120h后水凝胶的外观(A:Rh6G-CS pH 6.3,B:Rh6G-CS pH 7.4，C:Rh6G-OCLAVs-CS pH 6.3，D:Rh6G-OCLAVs-CSpH 7.4)。

图7：OCLAVs、CS及OCLAVs-CS水凝胶对不同浓度的Rh6G体外释放。

图8：缓释结束后缓释液与凝胶溶液紫外吸收光谱。

具体实施方式

壳聚糖水凝胶红外、XRD及热稳定性分析

0.1g样品加入FTIR Nicolet 6700样品槽中，进行红外光谱扫描。扫描范围：4000-550。扫描次数：16次；分辨率：4。

通过X射线衍射评估不同水凝胶的XRD图谱，以4℃/min的速度在5°-60°的2θ范围内扫描样品。分别用热重分析(TGA)和差示扫描量热仪(DSC)表征了不同水凝胶的热稳定性。在氮气气氛下，以10℃/min的升温速率从25℃至600℃进行TGA测量。DSC分析在-30-240℃的温度范围内进行，氮气气氛下以10℃/min的升温速率扫描。

壳聚糖水凝胶溶胀率的测定

将精确称重(W)的冻干样品浸入PBS缓冲液(pH 7.4)中，并按预定间隔取出凝胶，用滤纸擦去水凝胶表面的PBS缓冲溶液，并在室温下记录不同时间的样品质量W

扫描电子显微镜(SEM)透射电子显微镜(TEM)表征

通过扫描电子显微镜观察冻干水凝胶的形态，并稍作修改。简单地说，将水凝胶冷冻在液氮中脆断，取一片凝胶样品，用导电胶带将其附着在样品台上，样品断面部分涂上金。然后，用S-4800扫描电子显微镜观察样品的断面形貌和结构。

OCLAVs的TEM表征：首先，将10μL OCLAVs悬浮液滴到铜栅极上，并在室温下干燥过夜。然后，使用透射电子显微镜在120kV下观察样品的形貌和结构。

OCLAVs-CS水凝胶的TEM表征：首先，稀释OCLAVs-CS悬浮液，然后用镊子拾取铜网，放置在溶液中2s，并在液氮中冷冻。然后将样品在冷冻干燥机中冷冻24h。最后，使用JEM-2100透射电子显微镜在120kV下观察样品的形貌和结构。

姜黄素及罗丹明6G的累积释放率测定

分别用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M)，和70mL 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)-30mL乙醇混合作为释放介质，分别测定罗丹明6G和姜黄素从OCLAVs、CS水凝胶以及OCLAVs-CS水凝胶中的体外释放。首先，将Cur-OCLAVs加入CS水凝胶(2g)溶液中并添加到样品管中，将其放置在37℃水浴中1h以形成水凝胶。然后分别向每个样品管中添加5mL释放介质。以不含OCLAVs的药物-壳聚糖水凝胶和不含壳聚糖的药物-OCLAVs作对照。样品储存在37℃、100rpm的水浴搅拌器中。在时间间隔后，取出3mL释放介质并测量其在427nm波长下的吸光度，同时将3mL新鲜释放介质添加到样品管中。

在pH 6.3和pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M)中测定了温敏性壳聚糖水凝胶对CLA-罗丹明6G的体外释放。将1mL包封罗丹明6G的CLA囊泡-壳聚糖水凝胶溶液加入试管中，并将其置于37℃培养箱中2h以形成水凝胶，然后分别将10.0mL pH 6.3和pH 7.4(0.1M)的缓冲液添加到每个试管中。以不含CLA囊泡的罗丹明6G-壳聚糖水凝胶为对照组，将试管保持在37℃的水浴摇床中，以100rpm的振动速率。在预定时间，收集3mL缓冲液测定其在罗丹明6G最大吸收波长527nm处的吸光度，同时向试管中补充3mL新鲜缓冲盐溶液。

药物(罗丹明6G或姜黄素)的累积释放率计算如下式：

式中，c

抗氧化性的测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率测定

将4mL DPPH甲醇溶液(0.03mmol/L)与1.5mL样品乙醇溶液混合，然后将混合物在室温下黑暗中储存30min。使用分光光度计测量样品在517nm处的吸光度。1.5mL乙醇用作空白对照。所有实验均一式三份。DPPH自由基清除百分比通过下式计算：

其中，A

2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除率测定

将ABTS水溶液(7mmol/L)与等体积的过硫酸钾水溶液(2.45mmol/L)混合，然后在室温下黑暗中培养12h。用甲醇稀释混合物，以在734nm处获得0.700±0.02的吸光度。将4mLABTS溶液与0.15mL样品混合，10min后测量其在734nm处样品吸光度。去离子水用作空白对照，1mg/mL浓度的抗坏血酸(VC)用作阳性对照。所有实验均一式三份。ABTS自由基清除百分比通过以下等式计算：

其中，A

铁离子还原能力测定

向1mL样品溶液中加入2mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6，0.2mol/L)和2mL铁氰化钾溶液(1％)。在50℃下培养20min后，添加2mL三氯乙酸(10％)，然后在5000rpm下离心混合物10min。然后，将2mL上清液与2mL蒸馏水和0.4mL氯化铁(0.1％)混合。然后将样品在黑暗中保持10min，并在700nm处测量样品的吸光度。去离子水作为对照，浓度为0.1mg/mL的抗坏血酸(VC)作为阳性对照。

实施例1：低聚共轭亚油酸(OCLA)的制备

将8.0g CLA放置在25mL三口烧瓶中，在搅拌下缓慢滴加NaOH水溶液(8.6％w/w)，形成的共轭亚油酸钠(SCL)约为16.6％(w/w)。将溶液在均质机中均质2min(10000r/min)，获得白色乳液。接着，向该乳液中添加0.24g引发剂APS，室温下通氮30min，将烧瓶封口并在80℃水浴中震荡20h后停止反应。用HCl(10％w/w)将上述反应液酸化至pH 2.0-3.0，并转移到分离漏斗中，用少量无水乙醚萃取。最后用饱和盐水洗涤乙醚萃取液至中性，并在醚层中加入无水Na

其中，A

以本实施例所得低聚共轭亚油酸(OCLA)的紫外光谱如图1E所示，吸光度变化计算共轭双键的自交联率为28.6％；OCLA的重均分子量Mw为1673，数均分子量(Mn)为1698，即聚合度为6。

实施例2：包封姜黄素的OCLA囊泡(OCLAVs)体系(Cur-OCLAVs)的制备

低聚共轭亚油酸囊泡(OCLAVs)的制备：首先，将1.5g的实施例1制备的OCLA装入放置在冰浴中的50mL烧瓶中，然后将NaOH溶液(3.3M，50％乙醇溶液)在机械搅拌下滴加60min到OCLA溶液中至恒定pH。然后，60℃下旋转蒸发所得混合物以去除乙醇，并在60℃真空干燥至恒重。在磁力搅拌下，将恒重干燥物、0.042g SDS和0.42g SOCL溶解在50mL去离子水中，用1mol/L HCl将所得溶液调节至pH 7.4，然后在25℃下以120rpm震荡24h，得到OCLAVs悬浮液。样品在室温下黑暗中储存备用。

共轭亚油酸囊泡(CLAVs)的制备：方法与OCLAVs的相同，仅用共轭亚油酸(CLA)替换OCLA，其余相同。

OCLAVs包封姜黄素：首先，将0.42g OCLA与50mL姜黄素(Cur)乙醇溶液充分混合，并在50℃下通过真空旋转蒸发去除乙醇。接着，将溶解在50mL(0.1M)NaOH水溶液中的0.042g SDS添加到OCLA-Cur混合物中并搅拌分散；然后用HCl(1M)将体系的pH值调节到7.4左右。在30℃和120rpm下震荡混合物4h即可，得到Cur-OCLAVs。

CLAVs包封姜黄素：与OCLAVs包封姜黄素方法相同，区别在于用共轭亚油酸替换OCLA。

对照样：分别以没有包封姜黄素的OCLA囊泡(OCLAVs)和共轭亚油酸囊泡(CLAVs)作为。

图1为CLAVs(共轭亚油酸囊泡，对照样图1A，B)及OCLAVs(图1C，D)在包封姜黄素前后的样品外观。可以看出OCLAVs外观为淡蓝色(图1C)，包封姜黄素后样品外观为淡黄色且均一稳定(图1D)，表明了姜黄素可以稳定包封在OCLAVs中；而且图1表明OCLAVs对姜黄素的包封率(图1D)要优于CLAVs对姜黄素(图1B)的包封率。

OCLA囊泡(OCLAVs)和包封姜黄素的OCLA囊泡体系(Cur-OCLAVs)的形貌见图2。OCLAVs及OCLAVs包封姜黄素的紫外光谱如图1E所示。包封姜黄素前后OCLAVs的粒径分别为124.5nm和172.2nm。

实施例3：包封姜黄素的OCLAVs-壳聚糖水凝胶(Cur-OCLAVs-CS)制备

空白壳聚糖水凝胶的制备：将CS(脱乙酰度90％，Mw＝300kDa)和磷酸甘油二钠(β-GP)分别溶于0.15M的醋酸水溶液和去离子水中。两种溶液在4℃冰箱中冷却30min，接着将壳聚糖溶液在冰水浴中搅拌，将β-GP溶液缓慢滴入壳聚糖溶液中，然后搅拌10min，调节溶液pH在6.5左右，得到CS/β-GP溶液，即壳聚糖水凝胶。壳聚糖/β-GP溶液由2.5％的壳聚糖(w/w)和10.7％的β-GP(w/w)组成。

Cur-OCLAVs的制备：参照实施例2制备OCLAVs(30mM)包封疏水性药物姜黄素的分散液Cur-OCLAVs。

OCLAVs-CS水凝胶的制备：室温下，以1:5的体积比将OCLAVs悬浮液加入到CS/β-GP溶液中，之后，将样品搅拌10min，并在37℃水浴1h形成OCLAVs-CS水凝胶。

包封姜黄素的OCLAVs-壳聚糖水凝胶(Cur-OCLAVs-CS)的制备：室温下，以1:5的体积比将Cur-OCLAVs加入到CS/β-GP溶液中。之后，将样品搅拌10min，并在37℃水浴1h形成包封姜黄素的OCLAVs-壳聚糖水凝胶。

包封罗丹明的OCLAVs-壳聚糖水凝胶的制备：参照包封姜黄素的OCLAVs-壳聚糖水凝胶的制备的方法。

各种水凝胶的外观见图2。将样品在4℃下放置24h后，空白壳聚糖水凝胶(图2A)外观较白色浑浊且具有一定流动性。将样品进行倒置时，无法保持“站立”状态。而将空白壳聚糖水凝胶在37℃放置10min后，样品形成水凝胶(图2B)。同样，OCLAVs包封亲水性染料罗丹明6G和OCLAVs包封疏水性药物姜黄素的凝胶在37℃放置20min后，所形成凝胶均具有很好的稳定性。

图3为OCLAVs、CS-OCLAVs及其包封姜黄素的Cur-OCLAVs-CS样品TEM图。图中可以看出OCLAVs和Cur-OCLAVs仍然保持其在纳米囊泡中的形式，这意味着OCLAVs-CS中的框架是刚性或弹性的。图3A显示OCLAVs的粒径约为30nm左右。加入壳聚糖溶液并稀释后，囊泡的粒径减小(图3B-C)。图3B中的插图表明OCLAVs-CS的粒径约为20nm，包封姜黄素的Cur-OCLAVs-CS水凝胶体系中样品粒径有所增加，但依然明显小于OCLAVs体系中样品的粒径；表明OCLAVs和Cur-OCLAVs在CS水凝胶体系中都能够稳定存在。

实施例4：比较OCLAVs、壳聚糖水凝胶和OCLAVs-CS脂质体水凝胶负载姜黄素后的缓释

使用70mL 0.1M PBS缓冲液(pH 7.4)和30mL乙醇混合作为释放介质，测定姜黄素(Cur)从OCLAVs、CS水凝胶以及OCLAVs-CS水凝胶中的体外释放。以不含OCLAVs的姜黄素-壳聚糖水凝胶(参见实施例3)和不含壳聚糖的Cur-OCLAVs用作对照。

Cur-OCLAVs的制备：参见实施例3。

Cur-CS水凝胶的制备：将姜黄素分散在SDS水溶液(0.042g SDS溶于50mL水)中，然后用0.1MNaOH调节体系的pH到pH 7.4，在30℃下以120rpm震荡混合物4h。室温下，以1:5的体积比将姜黄素-SDS悬浮液加入到CS/β-GP溶液中。之后，将样品搅拌10min，并在37℃水浴1h形成包封姜黄素的壳聚糖水凝胶，即Cur-CS水凝胶。

Cur-OCLAVs-CS水凝胶的制备：参见实施例3。

然后分别向上述每个样品管中添加5mL释放介质，在37℃、100rpm的水浴搅拌器中搅拌。间歇取出3mL释放介质并测量其在427nm波长下的吸光度，同时将3mL新鲜释放介质添加到样品管中。

OCLAVs-CS水凝胶对不同浓度的姜黄素体外释放如图4所示。从图中可以看出，单独的壳聚糖凝胶或者单独的OCLAVs(Cur-CS400和Cur-OCLAVs400)负载姜黄素后的缓释曲线上都存在突释效应，而复合凝胶负载姜黄素后的缓释曲线都呈现平稳的释放过程；而且96h后，复合凝胶负载的姜黄素的累积释放率为单独的壳聚糖凝胶或者单独的OCLAVs的一半，表明复合凝胶很好地减少了突释效应，延缓了姜黄素的释放。

实施例5：OCLAVs-CS凝胶、载药Cur-OCLAVs-CS凝胶和载药囊泡Cur-OCLAVs的抗氧化活性比较

OCLAVs-CS凝胶(实施例3中将Cur-OCLAVs-CS凝胶制备中的Cur-OCLAVs换成OCLAVs悬浮液)、载药Cur-OCLAVs-CS凝胶(实施例3)和载药囊泡Cur-OCLAVs(实施例3)，它们对不同浓度的姜黄素抗氧化性研究如图5所示。从图中可以看出，Cur-OCLAVs-CS的抗氧化活性(DPPH和对铁离子还原能明显高于Cur-OCLAVs体系的，所测试的抗氧化能力均显著高于姜黄素直接使用时的抗氧化能力。

实施例6：包封罗丹明6G的OCLAVs(Rh6G–OCLAVs)的制备

首先，将0.42g OCLA与50mL罗丹明6G(Rh6G)水溶液充分混合，并在50℃下通过真空旋转蒸发去除水。接着，将溶解在50mL(0.1M)NaOH水溶液中的0.042g SDS添加到OCLA-Cur混合物中并搅拌分散；然后用HCl(1M)将体系的pH值调节到7.4左右。在30℃和120rpm下震荡混合物4h即可。

实施例7：包封罗丹明6G的OCLAVs-壳聚糖水凝胶(Rh6G–OCLAVs-CS)的制备

将CS(脱乙酰度90％，Mw＝300kDa)和磷酸甘油二钠(β-GP)分别溶于0.15M的醋酸水溶液和去离子水中。两种溶液在4℃冰箱中冷却30min，接着将壳聚糖溶液在冰水浴中搅拌，将β-GP溶液缓慢滴入壳聚糖溶液中，然后搅拌10min，调节溶液pH在6.5左右。壳聚糖/β-GP溶液由2.5％的壳聚糖(w/w)和10.7％的β-GP(w/w)组成。

室温下，以1:5的体积比将实施例6制备的Rh6G–OCLAVs加入到CS/β-GP溶液中。之后，将样品搅拌10min，并在37℃形成Rh6G–OCLAVs-CS水凝胶。

实施例8：分别在pH 6.3和pH 7.4下比较CS水凝胶和OCLAVs-CS复合水凝胶负载罗丹明6G后的缓释

以不含OCLAVs的壳聚糖水凝胶Rh6G-CS作为对照组，Rh6G-OCLAVs-CS复合水凝胶的累积释放率如图7所示。

Rh6G-CS水凝胶的制备：将Rh6G分散在SDS水溶液(0.042g SDS溶于50mL水)中，然后用0.1MNaOH调节体系的pH到pH 7.4,在30℃下以120rpm震荡混合物4h。室温下，以1:5的体积比将Rh6G-SDS悬浮液加入到CS/β-GP溶液中。之后，将样品搅拌10min，并在37℃水浴1h形成包封姜黄素的壳聚糖水凝胶，即Rh6G-CS水凝胶。

如图7所示，24h后，包封Rh6G-OCLAVs的壳聚糖水凝胶在pH 6.3和pH 7.4体系中的体外释放率分别为22.9％和15.7％；120h后二者的体外释放率分别为45.7％和35.8％。而在不含OCLAVs的Rh6G-CS水凝胶体系中，在pH 6.3和pH 7.4条件下二者在24h接近释放完全。结果表明OCLAVs的存在消除了壳聚糖的突释效应。同时，结果还表明在pH 7.4左右，由于pH值高于壳聚糖的pKa值，壳聚糖去质子化，导致凝胶结构堆积更紧密，所以Rh6G释放更加缓慢。释放120h后水凝胶外观也能表明在pH 7.4时壳聚糖水凝胶变为乳白色。

通过对缓释液及凝胶中CLA含量进行分析，从而对体外释放过程中的释放行为进行研究。壳聚糖水凝胶包封Rh6G-OCLAVs透析结束后的紫外吸收光谱如图8所示。

从图8中可以看出罗丹明溶液的最大吸收波长在527nm左右。透析外液在234nm(CLA最大吸收波长)处有一个很小的吸收峰(相比于罗丹明溶液)，表明了可能有部分OCLAVs在体外释放过程中随着罗丹明6G一起释放到缓释液中。将体外释放后的凝胶在NaOH溶液中分散并离心，取上层清液并扫描其紫外吸收光谱，可以看出OCLAVs-CS凝胶-NaOH溶液在234nm处有很强的吸收峰，结果表明了体外释放过程中罗丹明6G以游离方式释放到缓释液中，而OCLAVs基本保留在水凝胶内。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。