一种三唑并嘧啶化合物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及化合物合成技术领域，具体涉及一种三唑并嘧啶化合物及其合成方法和应用。

背景技术

三唑并嘧啶类化合物由于分子结构中具有三唑和嘧啶这两类重要的活性单元，因而具有广泛的生物活性，受到人们的长期关注，三唑并嘧啶类化合物主要应用于农业领域，通常被作为除草剂，抗菌剂使用；此外，三唑并嘧啶类化合物还具有治疗心血管疾病的作用。然而，现有的三唑并嘧啶类化合物合成方法步骤繁琐，经济性不高，没有在抗肿瘤方面的应用，因此，迫切需要开发一种新的三唑并嘧啶类化合物合成方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种三唑并嘧啶化合物的合成方法，以解决现有三唑并嘧啶类化合物合成方法步骤繁琐，经济性不高的问题；并将其应用到抗前列腺癌药物制备中。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种三唑并嘧啶化合物的合成方法，包括以下步骤：

(1)将3-氨基-1,2,4-三氮唑和丙酰乙酸乙酯混合于冰乙酸中，于110-130℃条件下搅拌反应5-7h，然后冷却至室温，再析晶、减压抽滤、洗涤和真空干燥，制得白色固体，即5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮；

(2)将步骤(1)制得的白色固体溶于三氯氧磷中，于80-100℃条件下搅拌反应3-5h，然后冷却至室温，倒入冰水中搅拌，再进行萃取、洗涤、干燥和减压浓缩，制得红棕色固体粗品，即7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶；

(3)将步骤(2)制得的红棕色固体粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-硝基苯硫酚和碳酸钾，于50-70℃条件下搅拌反应1.5-2.5h，然后冷却至室温，加水稀释，再进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩和纯化，制得淡黄色固体，即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

(4)将步骤(3)制得的淡黄色固体溶于乙酸乙酯中，加入钯碳，于室温条件下反应，然后过滤和减压浓缩，制得淡黄色固体粗品，即4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺；

(5)将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA，于室温条件下搅拌反应8-12h，然后减压浓缩，加水稀释溶解，再进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩和纯化，制得三唑并嘧啶化合物，即2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。

本发明的有益效果为：本发明发现了一种化合物(2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺)(#46-4)的新的合成方法，该方法具有合成步骤少，经济高效的优点；本发明制得的化合物具有较好的抗肿瘤活性，在体外培养肿瘤细胞中，能抑制肿瘤细胞增殖，导致肿瘤细胞内活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)上升，进而导致细胞死亡，此外，该化合物对正常细胞毒性较小，具有开发成抗肿瘤药物的潜力。

进一步，三唑并嘧啶化合物的合成方法如下：

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，步骤(1)中，3-氨基-1,2,4-三氮唑、丙酰乙酸乙酯和冰乙酸的质量体积比为400-450mg：700-750mg：4-6mL。

进一步，步骤(1)中，搅拌条件下加入乙酸乙酯和石油醚的混合溶液进行析晶。

进一步，步骤(1)中，冰乙酸和混合溶液的体积比为1：2.8-3.2。

进一步，混合溶液中乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：1.8-2.2。

进一步，步骤(1)中，采用体积比为1：1.8-2.2乙酸乙酯和石油醚的混合溶液进行洗涤。

进一步，步骤(2)中，白色固体和三氯氧磷的质量体积比为500-550mg：8-12mL。

进一步，步骤(2)中，氮气保护下，于80-100℃条件下搅拌反应3-5h。

进一步，步骤(2)中，倒入冰水中搅拌5-15min。

进一步，步骤(2)中，冰水体积为反应液体积的9-11倍。

进一步，步骤(2)中，采用二氯甲烷萃取2-3次。

进一步，步骤(2)中，将萃取后的有机相合并，依次采用水和饱和食盐水进行洗涤。

进一步，步骤(2)中，采用无水硫酸钠干燥。

进一步，步骤(2)中，干燥后去除干燥剂，再减压浓缩。

进一步，步骤(3)中，红棕色固体粗品、4-硝基苯硫酚、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔体积比为0.8-1.2mmol：1-1.5mmol：1.8-2.2mmol：4-6mL。

进一步，步骤(3)中，加水稀释为原体积的5-6倍。

进一步，步骤(3)中，采用乙酸乙酯萃取2-3次。

进一步，步骤(3)中，将萃取后的有机相合并，依次采用氢氧化钠溶液、水和饱和食盐水进行洗涤。

进一步，氢氧化钠溶液的浓度为0.8-1.2mol/L。

进一步，步骤(3)中，采用无水硫酸钠干燥。

进一步，步骤(3)中，干燥后去除干燥剂再减压浓缩。

进一步，步骤(3)中，采用柱层析进行纯化。

进一步，步骤(4)中，淡黄色固体、钯碳和乙酸乙酯的质量体积比为150-200mg：40-60mg：5-10mL。

进一步，步骤(4)中，在氢气气氛中进行反应。

进一步，步骤(4)中，采用硅藻土过滤。

进一步，步骤(5)中，淡黄色固体粗品、对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA和N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为120-150mg：100-110mg：200-250mg：100-150mg：3-6mL。

进一步，步骤(5)中，采用二氯甲烷萃取2-3次。

进一步，步骤(5)中，将萃取后的有机相合并，采用饱和食盐水进行洗涤。

进一步，步骤(5)中，采用无水硫酸钠干燥。

进一步，步骤(5)中，干燥后去除干燥剂再减压浓缩。

进一步，步骤(5)中，采用柱层析进行纯化。

本发明还提供上述三唑并嘧啶化合物的合成方法合成的三唑并嘧啶化合物。

本发明还提供上述三唑并嘧啶化合物在抗前列腺癌药物制备方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的方法简单便捷，只需要五个步骤即可合成出目标产物，具有简单高效的特点，经济高效的合成(2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺)(#46-4)。

2、本发明中提及的化合物具有抗前列腺癌效果，可应用与相关的生物医学领域药物研发，用于前列腺癌的治疗，或作为前体分子开发抗前列腺癌药物。

附图说明

图1为实施例1制得的#46-4抑制前列腺癌细胞PC3增殖图；

图2为实施例1制得的#46-4对前列腺癌细胞PC3的半数抑制浓度；

图3为实施例1制得的#46-4抑制前列腺癌细胞PC3克隆形成图；

图4为实施例1制得的#46-4对正常前列腺细胞PNT1A细胞毒性实验图；

图5为实施例1制得的#46-4抑制前列腺癌细胞PC3增殖图；

图6为实施例1制得的#46-4抑制细胞增殖信号通路图；

图7为实施例1制得的#46-4诱导细胞产生活性氧图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种三唑并嘧啶化合物，其合成方法包括以下步骤：

(1)制备5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(3)

将商业购买的3-氨基-1,2,4-三氮唑(1，420mg，5mmol)和丙酰乙酸乙酯(2，720mg，5mmol)混合于5mL的冰乙酸中，于120℃条件下搅拌反应6h，反应完全后，将反应液冷却至室温，搅拌下缓慢加入乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1：2，15mL)，进行析晶，减压抽滤收集析出来的固体、并用少量乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1：2)洗涤滤饼，滤饼经真空干燥，制得白色固体，即5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(574mg，收率70％)；

(2)制备7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶(4)

将步骤(1)制得的白色固体(3，516mg，3.1mmol)溶于10mL三氯氧磷中，氮气保护下，于90℃条件下搅拌反应4h，反应完全后，将反应液冷却至室温，缓慢倒入10倍体积的冰水中并搅拌10min，然后用二氯甲烷萃取2次，合并萃取所得有机相，经水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经减压浓缩，制得红棕色固体粗品(179mg，收率32％)，即7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶；

(3)制备5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(6)

将步骤(2)制得的红棕色固体粗品(4，1mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-硝基苯硫酚(5，182mg，1.2mmol)和碳酸钾(270mg，2mmol)，于60℃条件下搅拌反应2h，反应完全后，将反应液冷却至室温，加水稀释为原体积的5倍，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取所得有机层，经1mol/L氢氧化钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩滤液，残余物经柱层析纯化，制得淡黄色固体(186mg，收率62％)，即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

(4)制备4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺(7)

将步骤(3)制得的淡黄色固体(6，180mg，0.6mmol)溶于8mL的乙酸乙酯中，加入钯碳(50mg)，于氢气气氛中，室温条件下反应反应完全后，垫硅藻土过滤，滤液经减压浓缩，制得淡黄色固体粗品(160mg，收率98％)，即4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺；

(5)制备2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺(#46-4)

将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品(140mg，0.5mmol)溶于4mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入对氯苯氧乙酸(107mg，0.6mmol)、HATU(237mg，0.6mmol)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，130mg，1mmol)，于室温条件下搅拌反应10h，反应完全后，减压浓缩除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺，加水稀释溶解残余物，用二氯甲烷萃取2次，合并萃取所得有机层，经饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩滤液，残余物经柱层析纯化，制得淡黄色固体(69mg，收率31％)，即三唑并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。

实施例2：

一种三唑并嘧啶化合物，其合成方法包括以下步骤：

(1)制备5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(3)

将商业购买的3-氨基-1,2,4-三氮唑(1，400mg)和丙酰乙酸乙酯(2，700mg)混合于4mL的冰乙酸中，于110℃条件下搅拌反应7h，反应完全后，将反应液冷却至室温，搅拌下缓慢加入乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1：1.8，11.2mL)，进行析晶，减压抽滤收集析出来的固体、并用少量乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1：1.8)洗涤滤饼，滤饼经真空干燥，制得白色固体，即5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮；

(2)制备7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶(4)

将步骤(1)制得的白色固体(3，500mg)溶于8mL三氯氧磷中，氮气保护下，于80℃条件下搅拌反应5h，反应完全后，将反应液冷却至室温，缓慢倒入9倍体积冰水中并搅拌5min，然后用二氯甲烷萃取2次，合并萃取所得有机相，经水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经减压浓缩，制得红棕色固体粗品，即7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶；

(3)制备5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(6)

将步骤(2)制得的红棕色固体粗品(4，0.8mmol)溶于4mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-硝基苯硫酚(5，1mmol)和碳酸钾(1.8mmol)，于50℃条件下搅拌反应2.5h，反应完全后，将反应液冷却至室温，加水稀释为原体积的6倍，用乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取所得有机层，经0.8mol/L氢氧化钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩滤液，残余物经柱层析纯化，制得淡黄色固体，即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

(4)制备4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺(7)

将步骤(3)制得的淡黄色固体(6，150mg)溶于5mL的乙酸乙酯中，加入钯碳(40mg)，于氢气气氛中，室温条件下反应反应完全后，垫硅藻土过滤，滤液经减压浓缩，制得淡黄色固体粗品，即4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺；

(5)制备2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺(#46-4)

将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品(120mg)溶于3mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入对氯苯氧乙酸(100mg)、HATU(200mg)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，100mg)，于室温条件下搅拌反应8h，反应完全后，减压浓缩除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺，加水稀释溶解残余物，用二氯甲烷萃取2次，合并萃取所得有机层，经饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩滤液，残余物经柱层析纯化，制得淡黄色固体，即三唑并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。

实施例3：

一种三唑并嘧啶化合物，其合成方法包括以下步骤：

(1)制备5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(3)

将商业购买的3-氨基-1,2,4-三氮唑(1，450mg)和丙酰乙酸乙酯(2，750mg)混合于6mL的冰乙酸中，于130℃条件下搅拌反应5h，反应完全后，将反应液冷却至室温，搅拌下缓慢加入乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比为1：2.2，19.2mL)，进行析晶，减压抽滤收集析出来的固体、并用少量乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比为1：2.2)洗涤滤饼，滤饼经真空干燥，制得白色固体，即5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮；

(2)制备7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶(4)

将步骤(1)制得的白色固体(3，550mg)溶于12mL三氯氧磷中，氮气保护下，于100℃条件下搅拌反应3h，反应完全后，将反应液冷却至室温，缓慢倒入11倍体积冰水中并搅拌10min，然后用二氯甲烷萃取3次，合并萃取所得有机相，经水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液经减压浓缩，制得红棕色固体粗品，即7-氯-5-乙基-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶；

(3)制备5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶(6)

将步骤(2)制得的红棕色固体粗品(4，1.2mmol)溶于6mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入4-硝基苯硫酚(5，1.5mmol)和碳酸钾(2.2mmol)，于70℃条件下搅拌反应1.5h，反应完全后，将反应液冷却至室温，加水稀释为原体积的6倍，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取所得有机层，经1.2mol/L氢氧化钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩滤液，残余物经柱层析纯化，制得淡黄色固体，即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；

(4)制备4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺(7)

将步骤(3)制得的淡黄色固体(6，200mg)溶于10mL的乙酸乙酯中，加入钯碳(60mg)，于氢气气氛中，室温条件下反应反应完全后，垫硅藻土过滤，滤液经减压浓缩，制得淡黄色固体粗品，即4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺；

(5)制备2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺(#46-4)

将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品(150mg)溶于6mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入对氯苯氧乙酸(110mg)、HATU(250mg)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，150mg)，于室温条件下搅拌反应12h，反应完全后，减压浓缩除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺，加水稀释溶解残余物，用二氯甲烷萃取3次，合并萃取所得有机层，经饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压浓缩滤液，残余物经柱层析纯化，制得淡黄色固体，即三唑并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。

试验例

将实施例1制得的三唑并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺，即#46-4，按照如下方法进行性能检测。

一、抑制前列腺癌细胞PC3增殖

将PC3细胞计数按3000个细胞/每孔，接种入96孔板中，接种24h后，分别加入1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L的小分子化合物#46-4和等体积的DMSO，采用高内涵分析系统，对各孔细胞进行拍照；然后将培养板置于37℃、5％CO

由图1可知，#46-4具有抑制前列腺癌细胞增殖的能力，且具有剂量依赖性。

将前列腺癌细胞PC3按3000个/孔接种于96孔板中，将细胞置于CO

由图2可知，#46-4对前列腺癌细胞PC3的IC

二、抑制前列腺癌细胞PC3克隆形成

将PC3细胞计数，按500个细胞/每孔接种入6孔板中，接种24h后，分别加入0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L的小分子化合物#46-4和等体积的DMSO，置于37℃、5％CO

由图3可知，#46-4具有抑制前列腺癌克隆形成的能力，且具有剂量依赖性。

三、对正常前列腺细胞PNT1A细胞毒性实验

将正常前列腺细胞PNT1A按3000个/孔接种于96孔板中，将细胞置于CO

由图4可知，各浓度#46-4处理的正常前列腺细胞PNT1A，其细胞存活率均不受影响，表明小分子化合物#46-4对正常前列腺细胞毒性较小，具有较高的安全性。

四、抑制前列腺癌细胞PC3增殖

将前列腺癌细胞PC3按10000个/每孔接种于96孔板中，置于细胞培养箱中(37℃，5％CO

由图5可知，#46-4抑制前列腺癌细胞PC3增殖。且呈现剂量依赖性。

五、抑制细胞增殖信号通路

将前列腺癌细胞PC3按500000个/每孔接种于6孔板中，将细胞置于细胞培养箱中(37℃，5％ CO

由图6可知，#46-4抑制细胞增殖信号通路相关蛋白质Ras、p-C-Raf、p-MEK和p-Erk1/2表达，且呈现剂量依赖性，表明#46-4在前列腺癌细胞中抑制细胞增殖信号通路。

六、诱导细胞产生活性氧(ROS)

将前列腺癌细胞PC3按10000个/每孔，接种于96孔板中，将细胞置于细胞培养箱中(37℃，5％CO

由图7可知，#46-4诱导细胞中产生ROS，且产生ROS的细胞数量与#46-4浓度成正比。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。