基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物的可视化检验方法

技术领域

本发明属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物的可视化检验方法。

背景技术

目前四氢大麻酚(THC)的检测方法主要是液相/气相色谱-质谱、表面增强拉曼光谱仪等实验室大型仪器，尽管这些方法对THC的检测具有较好的灵敏度及准确的检测结果，但它们往往需要较高的运行成本和复杂的样品前处理过程，并且难以用到THC的现场检测。酶联免疫比色法或是荧光试剂盒目前在THC的现场检测有应用，但它们在标准实验室生产合成的过程涉及到抗体修饰，成本相对较高。适配体是一种经体外筛选技术获得的寡核苷酸序列，具有高特异性、易于体外合成且稳定等优点，又称“化学抗体”。目前，只有北卡罗莱纳州立大学团队发表了基于适配体的荧光法对THC进行检测，该方法中适配体使用的荧光团与猝灭团的修饰，一定程度上削弱适配体对THC的结合能力，并且成本也增高，限制其在实际应用的适用性。

基于酶联免疫比色法或是荧光法是目前四氢大麻酚(THC)现场检测的主要技术，它们在标准实验室生产合成的过程涉及到抗体修饰，抗体在实际使用中不稳定且成本相对较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物的可视化检验方法，该方法中利用富含G碱基-THC适配体与硫黄素T、甲酚紫的特异性结合能力，通过目标物THC与硫黄素T或是甲酚紫两个染料的竞争，实现目标物THC的免标记比率荧光检测分析，而且分析结果灵敏度高。该技术无需化学修饰，只需低成本的适配体、硫黄素T和甲酚紫染料，且三者在实际应用中稳定易于保存，克服了现有技术中需要各种基团修饰，而且适用性还受限制、成本高、不稳定的技术问题。本技术通过简单的混合即可实现目标物THC及其代谢物的快速且可视化检测，后期有望结合便携式荧光检测器实现目标物THC的现场即时检测，为四氢大麻酚监管提供了一种有前景的现场检测策略。

本发明通过以下技术方案实现：

一种基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物的可视化检验方法，包括如下步骤：

将硫黄素T和甲酚紫混合加入THC适配体中混匀后，获得比率探针，然后加入四氢大麻酚及其代谢物的待检测液，采用分子荧光检测仪检测，获得荧光显色数据；

所述THC适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选地，所述硫黄素T和甲酚紫的混合比例为1:2-2:1。

作为优选地，所述硫黄素T和甲酚紫的混合比例为1:1.5-1.5:1。

作为优选地，所述硫黄素T和甲酚紫的混合比例为1:1。

作为优选地，所述硫黄素T与THC适配体的混合比例为1μM：1μM。

作为优选地，所述代谢物为四氢大麻酚酸。

作为优选地，所述分子荧光检测的硫黄素T的特征荧光波长为490nm。

作为优选地，所述分子荧光检测的甲酚紫的特征荧光波长为620nm。

作为优选地，所述四氢大麻酚及其代谢物待检测液的量为0.6-2μM。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

本发明提供一种基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物的可视化检验方法，该方法中利用富含G碱基-THC适配体与硫黄素T、甲酚紫的特异性结合能力，通过THC与硫黄素T或是甲酚紫两个染料的竞争，实现THC的免标记比率荧光检测分析，而且分析结果灵敏度高。该技术无需化学修饰，只需低成本的适配体、硫黄素T和甲酚紫染料，且三者在实际应用中稳定易于保存，克服了现有技术中需要各种基团修饰，而且适用性还受限制、成本高、不稳定的技术问题。本技术通过简单的混合即可实现THC及其代谢物的快速且可视化检测，后期有望结合便携式荧光检测仪实现THC的现场即时检测，为四氢大麻酚监管提供了一种有前景的现场检测策略。

该方法中选取的THC适配体是一种经体外筛选技术获得的寡核苷酸序列，具有高特异性、易于体外合成且稳定等优点。

使用该方法，目标物THC在1min内就可得到荧光响应，随着THC浓度加大，绿色逐渐变成红色。

附图说明

图1为试验例1中，目标物THC分别与SYBR Green I(A)、硫黄素T(B)、噻唑橙(C)、原卟啉IX(D)、结晶紫(E)、甲酚紫(F)有机染料分子作用的荧光强度变化示意图；

图2为试验例2中，为硫黄素T与甲酚紫分别与THC适配体结合后加入不同浓度目标物THC作用的荧光强度变化示意图；

图3为试验例3中，为比率探针分别与0.6μM、2μM目标物THC反应的荧光强度变化及荧光图；

图4为试验例4中，为硫黄素T与甲酚紫不同比例下的荧光及其强度图；

图5为试验例5中，为比率探针与目标物THC反应不同时间的荧光及其强度图；

图6为试验例6中，单个染料结合目标物THC以及比率探针结合目标物THC和THC-COOH的荧光图；

图7为试验例6中，为检测目标物THC标线图；

图8为试验例6中，为比率探针检测目标物THC-COOH标线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明的一种具体实施方式的技术方案为：

一种基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物分析方法，该方法由THC适配体(具体核苷酸序列为：

5′-CTTACGACCCAGGGGGGTGGACAGGCGGGGGTTAGGGG GGTCGTAAG-3′)、硫黄素T、甲酚紫三部分组成的传感器，具体传感步骤：终浓度分别为1μM的THC、硫黄素T和甲酚紫配于200μL溶液中，分别加入一定浓度的四氢大麻酚(THC)及其代谢物四氢大麻酚酸(THC-COOH)后，立即用分子荧光仪检测硫黄素T(Em＝490nm)和甲酚紫(Em＝620nm)处的荧光强度变化。

筛选并试验验证：

试验例1：验证并筛选出与THC适配体特异性作用的有机染料分子

G-四联体是由富含鸟嘌呤的核苷酸序列组成，其在特定的目标或微环境的变化做出反应，诱导其折叠成典型的二级结构。目前已有报道的可以诱导或结合G-四联体结构的有机染料分子有原卟啉IX，噻唑橙，硫黄素T、结晶紫以及甲酚紫等。这些染料分子与G-四联体一般通过π-π堆积与静电作用，伴随着荧光强度的变化。

THC适配体由于富含鸟嘌呤，形成的类G-四联体结构可以与上述染料结合并占据THC适配体活性位点，形成免标记的荧光探针。由于目标物THC与适配体之间具有更强的亲和力，与已经结合THC适配体的染料形成竞争，导致染料荧光强度的变化，以此可构建THC的免标记比率荧光探针。

实验前期先试验上述常与G-四联体结合的染料与THC适配体是否也具有结合能力，导致荧光变化。

如图1所示，为THC适配体分别与SYBR Green I(A)、硫黄素T(B)、噻唑橙(C)、原卟啉IX(D)、结晶紫(E)、甲酚紫(F)等有机染料分子作用的荧光强度变化。

结果显示：SYBR Green I、硫黄素T、噻唑橙三个染料在溶液中的荧光强度比较弱，随着THC适配体的加入都有明显的荧光增强；而原卟啉IX和结晶紫染料与THC适配体结合后的荧光增强不明显，表明以上染料与THC适配体都具有一定的结合位点，导致荧光增强。

和以上染料荧光增强现象相反，甲酚紫染料在溶液中荧光很强，与THC适配体结合后荧光有明显的猝灭，表明甲酚紫在与THC适配体结合后，一定程度上削弱了甲酚紫的荧光。

试验例2：验证并筛选出染料(硫黄素T与甲酚紫)与THC适配体组成比率探针。

如图2中，(a)为硫黄素T与THC适配体结合后加入不同浓度THC作用的荧光强度变化；(b)为甲酚紫与THC适配体结合后加入不同浓度THC作用的荧光强度变化。

结果显示：硫黄素T与THC适配体结合后在490nm处荧光明显。随着目标物THC的加入荧光随之减弱，且目标物THC浓度越大，猝灭程度越大，表明目标物THC的加入能与硫黄素T/THC适配体复合物的结合位点竞争，使硫黄素T重新溶入溶液中，导致荧光猝灭。

与其相反，甲酚紫与THC适配体结合后加入的目标物THC使得染料荧光增强，目标物THC的加入能与甲酚紫/THC适配体复合物的结合位点竞争，使甲酚紫重新溶入溶液中，由于甲酚紫在溶液中的荧光强度强于甲酚紫/THC适配体，导致荧光增强。

所以，随着目标物THC的加入，硫黄素T荧光减弱而甲酚紫增强，利用一弱一强信号构成比率荧光探针，实现目标物THC响应的从绿变红的荧光变化。

试验例3：验证比率探针(THC适配体+硫黄素T+甲酚紫)检测THC

如图3所示，为探针分别与0.6μM、2μM目标物THC反应的荧光强度变化及荧光图。

结果显示：目标物THC的加入可明显猝灭硫黄素T荧光且增强甲酚紫荧光，从实物图中也可观察到，该探针从绿到红的荧光变化，表明该比率荧光方法可实现目标物THC的传感分析。

试验例4：探究硫黄素T与甲酚紫比例

如图4中，(a)为硫黄素T与甲酚紫不同比例下的荧光示意图；

(b)为硫黄素T与甲酚紫不同比例下的强度示意图。

结果显示：选择探针从绿变红的结果且ΔI

试验例5：探究目标物THC与比率探针的反应时间

如图5所示，为比率探针与THC反应不同时间的荧光及其强度图。

结果显示：比率探针与目标物THC可立刻反应，荧光从绿色立即变为红色荧光，随着反应时间增长荧光变化不大。

试验例6：THC检测

如图6所示，为单个染料结合目标物THC以及比率探针结合目标物THC和THC-COOH的荧光图

如图7所示，为比率探针检测目标物THC标线图；

如图8所示，为比率探针检测目标物THC-COOH标线图。

结果显示：单个染料随着目标物THC浓度增加变化不明显，由两个染料组成的比率探针在目标物THC存在下随着浓度增加能明显看出荧光变化，通过甲酚紫与硫黄素T发射强度比值实现THC的检测。

实施例1：

一种基于比率荧光的四氢大麻酚及其代谢物分析方法，该方法的THC适配体具体核苷酸序列为：

5′-CTTACGACCCAGGGGGGTGGACAGGCGGGGGTTAGGGG GGTCGTAAG-3′

与硫黄素T、甲酚紫三部分组成的传感器，具体传感步骤：终浓度分别为1μM的THC适配体、硫黄素T和甲酚紫配于200μL溶液中，分别加入一定浓度的四氢大麻酚(THC)及其代谢物四氢大麻酚酸(THC-COOH)后，立即用分子荧光仪检测硫黄素T(Em＝490nm)和甲酚紫(Em＝620nm)处的荧光强度变化。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。