测定Taq DNA聚合酶绝对活性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种测定Taq DNA聚合酶绝对活性的方法。

背景技术

Taq DNA聚合酶是从水生嗜热杆菌Thermus aquaticus中克隆出的耐热DNA聚合酶，具有5'-3'聚合活性与5'-3'外切活性。温度为55℃~110℃时催化DNA的复制，70℃~75℃为最适温度范围。由于Taq DNA聚合酶的耐热性，被广泛应用于分子克隆，使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的独特用酶。

Taq DNA聚合酶是一种重要的分子生物学工具酶，广泛用于各种PCR技术、TA克隆、Sanger测序、二代测序等，在基因工程、高通量测序、分子诊断、医学检测等领域有着重要的作用。

由于上述多种重要的用途，准确测定Taq DNA聚合酶的活性，保证批次间活性的稳定性，具有至关重要的意义。传统的聚合酶测定方法要么依赖于放射性元素

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种测定TaqDNA聚合酶绝对活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种测定Taq DNA聚合酶绝对活性的方法，该方法为：以环状单链DNA为模板，在含有扩增引物和dATP的反应体系中，以待测Taq DNA聚合酶引发延伸复制反应，消耗反应体系中的dNTPs；然后测定dATP的消耗量，再根据预先构建的表征Taq DNA聚合酶的绝对活性与dATP消耗量之间关系的标准曲线

优选的是，dATP的消耗量是通过将反应体系中dATP的初始含量减去反应结束后反应体系中dATP的剩余量得到，其中，dATP的剩余量是通过检测萤火虫萤光素酶利用dATP提供的能量催化萤光素产生的萤光值得到。

优选的是，dATP的剩余量通过以下方法检测得到：

在延伸复制反应结束后，取反应产物加入ATP检测试剂，检测萤火虫萤光素酶利用dATP提供的能量催化萤光素产生的萤光值，然后根据预先构建的表征dATP的浓度与萤光值之间关系的标准曲线

优选的是，标准曲线

采用标准Taq DNA聚合酶，配制一系列具有不同Taq DNA聚合酶浓度的反应体系，在每个反应体系中加入扩增引物和dATP，在加热条件下反应10 min~60min，进行延伸反应；其中，每个反应体系中，除Taq DNA聚合酶浓度不同外，其余条件均相同；

完成延伸反应后，测定反应过程中dATP的消耗量，以标准Taq DNA聚合酶的浓度为横轴、dATP的消耗量为纵轴，拟合得到所述标准曲线

优选的是，标准曲线

配制一系列具有不同dNTPs浓度且不含Taq DNA聚合酶的标准反应体系，先在与标准曲线

优选的是，所述环状单链DNA为M13噬菌体单链DNA。

优选的是，所述扩增引物的核酸序列为5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'。

优选的是，所述Taq DNA聚合酶的绝对活性定义为：在72℃条件下，30 min能使15nmol的dNTP掺入酸不溶物所需的酶量，以U/μL为单位表示。

优选的是，待测Taq DNA聚合酶进行延伸复制反应的温度、反应时间与标准曲线

优选的是，Taq DNA聚合酶延伸复制反应的反应时间为10 min~60min，加热温度为72℃。

优选的是，在一定的浓度范围内，本发明的方法的重复精密度与中间精密度测试结果中均能达到RSD＜10%。

本发明的有益效果是：

本发明利用Taq DNA聚合酶的聚合活性，通过检测萤火虫萤光素酶利用延伸复制后产物中剩余dATP提供的能量催化萤光素产生的萤光值来定量延伸复制过程中消耗dATP的量，继而能快速测定Taq DNA聚合酶的绝对聚合活性，该方法无放射性污染，具有绝对定活、操作简便、快速灵敏、成本低廉等优点，可用于高通量、自动化的聚合酶活性筛选。

附图说明

图1为本发明中的延伸复制反应过程示意图；

图2为本发明的实施例1中萤光值处理结果；

图3为本发明的实施例2中各组分对萤光值影响结果；

图4为本发明的实施例3中延伸时间曲线图；

图5为本发明的实施例4中检测时间曲线图；

图6为本发明的实施例5中延伸反应终止条件萤光值处理结果；

图7为本发明的实施例6构建得到的标准曲线

图8为本发明的实施例7中构建得到的标准曲线

图9为本发明的实施例9中精密度测试中dATP的消耗量图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种测定Taq DNA聚合酶绝对活性的方法，该方法为：以环状单链DNA为模板，在含有扩增引物和dATP的反应体系中，以待测Taq DNA聚合酶引发延伸复制反应，消耗反应体系中的dNTPs；然后测定dATP的消耗量，再根据预先构建的表征Taq DNA聚合酶的绝对活性与dATP消耗量之间关系的标准曲线

参照图1，在本发明的一个优选实施方案中，以M13噬菌体单链DNA（M13 ssDNA单链环）作为延伸复制的模板，设计扩增引物（M13通用引物），在Taq DNA聚合酶作用下引发延伸复制，消耗反应体系中的大量dNTPs；再加入ATP检测试剂后，可测得剩余dATP的萤光信号，并计算得到dATP的消耗量，进而可根据标准曲线

在本发明的一个优选实施方案中，使用碧云天ATP检测试剂盒检测dATP的消耗量，但需要说明的是，理论上，任何能够检测dATP、dGTP、dCTP或dTTP消耗量的试剂盒均可用于本发明中。因此，基于本发明的精神，本发明中的ATP检测试剂可以是检测dATP的试剂盒也可以是检测dGTP、dCTP或dTTP消耗量的试剂盒。以下提供详细的实施例，以对本发明做进一步说明。

实施例1

萤光素酶对dATP的响应测试

1、dATP及其他组分溶液配制

分别配制700 μM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dNTPs置于冰上待测；

2、配制ATP检测工作液，具体体系如表1（可根据实际情况进行调整），将配制的ATP检测工作液100 μL加入96孔酶标板，室温静置3-5 min后将待测样品加入96孔酶标板中，每孔加入1 μL，轻轻混匀后置入化学发光仪，选择化学发光模式检测发光值。

表1 ATP反应工作液参考体系

3、发光值处理

由图2可知，相同浓度的dATP与dNTPs的荧光值较高且数值基本一致，dGTP、dCTP、dTTP几乎没有荧光值，说明萤光素酶主要响应dATP，对dGTP、dCTP、dTTP无响应。

实施例2

延伸反应体系中其他组分对发光值的干扰测试

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物M13-R：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）。

2、延伸反应操作步骤

①配制引物模板延伸反应混合液，反应体系如表2（可根据实际情况同理调整）。将配置好的反应混合液置于PCR仪72℃进行延伸反应20 min后置于冰上终止反应。反应时间可根据实际情况调整10 min~1 h。随后使用ATP检测试剂盒测定反应液中dATP的消耗，具体步骤同步骤1所示。

表2 延伸反应混合液参考体系

3、dATP标准曲线的绘制

由图3可知，四组不同成分体系在不同浓度的dATP时，发光值基本一致，各组dNTPs标准曲线的线性相关系数较好，R

实施例3

延伸反应时间的确定

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物M13-R：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）。

2、延伸反应体系配制

①配制引物模板延伸反应混合液7份，反应体系如表3（可根据实际情况同理调整）。

表3 延伸反应混合液参考体系

3、延伸反应

设置基因扩增仪反应程序为72℃，分别测试延伸时间为1 min、5 min、10 min、15min、20 min、30 min、60 min。随后使用ATP检测试剂盒测定反应液中dATP的消耗，具体步骤同步骤1所示。

4、标准曲线绘制

由图4可知，当延伸时间为0~20 min内时，Taq DNA聚合酶对dATP的消耗量存在良好的线性关系，相关系数R

实施例4

化学发光仪检测时间的确定

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物M13-R：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）。

2、延伸反应体系配制

①配制引物模板延伸反应混合液，反应体系如表4（可根据实际情况同理调整）。

表4 延伸反应混合液参考体系

②向上述反应液每管加入不同体积的dNTPs，并用水补齐5.6 μL，dNTPs浓度梯度设置参考表5（可根据实际情况同理调整）。

表5 参考dNTPs用量梯度

3、化学发光仪检测发光值

设置化学发光仪检测时间为60 min，检测不同时间段的发光值。通过不同时间段发光值是否稳定来确定最佳的化学发光仪检测时间。

4、发光值处理

由图5可知，发光值随时间增加而逐渐升高，15分钟后数值达到稳定且在60 min内保持稳定，后续实验化学发光仪检测时间确定为25 min。

实施例5

Taq DNA聚合酶延伸反应终止条件优化

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物M13-R：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）。

2、延伸反应体系配制

配制引物模板延伸反应混合液2组，反应体系参照表3（可根据实际情况同理调整）。

3、延伸反应

设置基因扩增仪反应程序为72℃，延伸时间为20 min。反应结束后，一组置于冰上待测，一组置于室温待测。

4、化学发光仪检测发光值

在反应结束0、10、20、30 min四个时间点分别检测置于冰上与置于室温两组的化学发光值，化学发光仪检测时长为25 min。通过不同时间段发光值是否稳定来确定最佳的延伸终止条件。

5、发光值处理

由图6可知，置于冰上的样品30 min内发光数值稳定，而置于室温的样品随着时间的增长发光值逐渐变大，30 min后RSD＞10%，因此后续实验采用将延伸结束的样品置于冰上以终止反应。

实施例6

构建表征dATP的浓度与萤光值之间关系的标准曲线

1、延伸反应混合液所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）。

2、延伸反应操作步骤

① 配制延伸反应混合液，具体配方如下表6（可根据实际情况同理调整）。

表6 延伸反应混合液

② 向每管延伸反应混合液中加入不同体积的dNTPs，并用水补齐5.6 μL，dNTPs浓度梯度设置参考下表7（可根据实际情况同理调整）。

表7 dNTPs浓度梯度

3、延伸反应

将上述各浓度梯度的反应混合液置于PCR仪中，在72℃进行延伸反应20 min后置于冰上终止反应。

4、dATP剩余量测定

使用ATP检测试剂盒测定反应液中dATP的剩余量，然后通过dATP的初始量减去剩余量得到dATP消耗量，具体检测体系如下表8（可根据实际情况同理调整）。

表8 dATP消耗量检测体系

将上述检测体系加入96孔微量板，置入酶标仪，选择化学发光模式检测发光值。

5、标准曲线绘制

以dATP浓度（即剩余量，μM）为横轴、发光值（RLU）为纵轴，绘制标准曲线

实施例7

构建表征Taq DNA聚合酶的绝对活性与dATP消耗量之间关系的标准曲线

1、延伸反应混合液所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）；

聚合酶：Taq DNA聚合酶（New England BioLabs公司）。

2、延伸反应操作步骤：

① 配制延伸反应混合液，如下表9（可根据实际情况同理调整）。

表9 延伸反应混合液

② 将Taq DNA聚合酶稀释至不同的酶浓度梯度，再加入上述反应液，酶浓度梯度设置参考下表10（可根据实际情况同理调整）。

表10 Taq DNA聚合酶浓度梯度

3、延伸反应

将上述各浓度梯度的反应混合液置于PCR仪中，在72℃进行延伸反应20 min后置于冰上终止反应。

4、dATP剩余量测定

使用ATP检测试剂盒测定反应液中dATP的剩余量，具体检测混合液如实施例6中的表8（可根据实际情况同理调整）。

将上述检测混合液加入96孔微量板，置入酶标仪，选择化学发光模式检测发光值。

5、标准曲线绘制

先根据实施例1构建的标准曲线

实施例8

待测Taq DNA聚合酶绝对活性的测定

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）；

聚合酶：Taq DNA聚合酶（GenEasy公司），不同于实施例7中绘制标准曲线

2、延伸反应操作步骤：

本实验实际与标准曲线实验同时进行，反应体系和操作流程与绘制标准曲线

3、dATP剩余量测定

使用ATP检测试剂盒测定反应液中dATP的剩余量，具体反应体系与实施例6的表8相同。

将上述检测混合液加入96孔微量板，置入酶标仪，选择化学发光模式检测发光值，测得发光值为8711.88。

4、计算待测Taq DNA聚合酶的绝对活性

将测得的待测Taq DNA聚合酶的发光值带入标准曲线

若以NEB Taq DNA聚合酶活力为标准时（5 U/μL），将此值带入到标准曲线

实施例9

精密度检测

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）；

聚合酶：Taq DNA聚合酶（New England BioLabs公司）。

2、延伸反应操作步骤：

① 本实验反应体系和操作流程与绘制标准曲线

② 将Taq DNA聚合酶稀释至不同的酶浓度梯度，再加入上述反应液，酶浓度梯度设置参考表11（可根据实际情况同理调整）。

表11 参考Taq DNA聚合酶浓度梯度

③重复精密度：在相同实验条件下，由相同实验人员独立进行3次实验，通过检测3个浓度Taq DNA聚合酶的活力，计算样品检测值的RSD，RSD应＜10%。

中间精密度：在相同实验条件下，由不同实验人员独立进行3次实验，通过检测TaqDNA聚合酶的活力，计算样品检测值的相对偏差的RSD，RSD应＜10%。

3、精密度测试RSD值计算

由图9可知，重复精密度测试中样品检测值的相对偏差分别为2.2%、2.0%、3.9%，RSD<10%；中间精密度测试中样品检测值的相对偏差分别为3.8%、1.9%、9.2%，RSD<10%，表明该方法具有较好的重复精密度与中间精密度。

实施例10

本方法检测下限测试

1、延伸反应体系所需材料如下：

模板：M13单链DNA（ssDNA）；

扩增引物：5'-TTTGCGGGAGAAGCCTTTATTTCAACGCA-3'（SEQ ID NO :1）；

聚合酶：Taq DNA聚合酶（New England BioLabs公司）。

2、延伸反应操作步骤：

① 本实验反应体系和操作流程与绘制标准曲线

② 将Taq DNA聚合酶稀释至不同的酶浓度梯度，再加入上述反应液，酶浓度梯度设置参考表12（可根据实际情况同理调整）。

表12 参考Taq DNA聚合酶浓度梯度

③延伸反应

将上述各浓度梯度的反应混合液置于PCR仪72℃进行延伸反应20 min后置于冰上终止反应。

3、dATP消耗量测定

使用ATP检测试剂盒测定反应液中dATP的消耗，具体反应体系如表10（可根据实际情况同理调整）。将上述检测混合液加入96孔微量板，置入化学发光仪，选择化学发光模式检测发光值。

4、dATP消耗量RSD值计算

由表13可知，当Taq DNA聚合酶稀释到0.005 U/μL与0.0025 U/μL时，RSD均小于10%，而稀释到0.001 U/μL时，RSD＞10%，因此认为本方法可以定量的稀释液酶活下限为0.0025 U/μL。

表13 下限检测

以上为本发明的总体构思，以下在其基础上提供详细的实施例和对比例，以对本发明做进一步说明。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。