PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and perspiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Porcine reproductive andperspiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病，俗称猪蓝耳病。猪蓝耳严重危害养殖业的发展。

猪蓝耳病病毒(PRRSV)属于套病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为不分节段、有囊膜的单股正链RNA病毒。PRRSV非结构蛋白NSP4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性，是参与病毒多聚蛋白前体加工的主要蛋白酶，与病毒的复制、毒力以及动物机体对PRRSV的固有免疫有关，是深入研究PRRSV致病机理以及开发抗病毒药物的重要靶蛋白。

大多数传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在BSL-2+或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺。目前，PRRSV-NSP4蛋白酶抑制剂的活性评价方法主要为荧光共振能量转移法或者利用活病毒进行检测。荧光共振能量转移法是目前应用较为广泛的高通量筛选方法，具有快捷、灵敏、可定量和重复性好等优点，但荧光剂易受小分子化合物影响而导致假阳性问题，同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，在细胞内没有活性或活性很弱。因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂筛选及活性检测平台十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：

（1）构建共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列而成；

（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。

本发明在绿色荧光蛋白（GFP）中插入PRRSV的NSP4蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达PRRSV NSP4蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成PRRSV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能够避免使用PRRSV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于PRRSV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。

PRRSV NSP4蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点A、位点C和位点D；

位点A为野生型GFP氨基酸序列第158~159位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

位点D为野生型GFP氨基酸序列第170~171位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；

所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。

本发明中，位点A为野生型GFP氨基酸序列第158~159位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；对应的氨基酸区域指的是与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上与野生型GFP氨基酸序列的第158~159位氨基酸相对应的位置。其它类似表述的地方参考本处释义。

发明人研究发现，在上述三个特定位点（位点A、位点C、位点D）插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列后，改造的GFP荧光蛋白仍然可以检测到激发荧光。

PRRSV NSP4蛋白酶切割序列包括cut1、cut2、cut3，cut1氨基酸序列为SLLEGAFR，cut2氨基酸序列为FQLEGRYF，cut3氨基酸序列为KDKTAYFQLEGRHFTW。PRRSV NSP4蛋白酶切割序列能准确地被PRRSV NSP4蛋白酶识别和切割，切割后则会破坏荧光蛋白发光功能，导致荧光淬灭。

位点A上插入的PRRSV NSP4蛋白酶切割序列为cut1；位点C上插入的PRRSV NSP4蛋白酶切割序列为 cut1；位点D上插入的PRRSV NSP4蛋白酶切割序列为 cut3。

一种表达改造的GFP质粒，改造的GFP表达后，仍然可以检测到激发荧光。

改造的GFP质粒的制备方法为：

将野生型GFP的基因序列通过同源重组方式克隆到表达质粒载体的多克隆位点之间构建表达野生型GFP的质粒；

通过同源重组方式，在表达野生型GFP的质粒上的GFP基因序列中插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列对应的核苷酸序列，构建表达改造的GFP质粒。

一种共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒，所述质粒包括表达PRRSVNSP4蛋白酶的编码基因序列以及表达改造的GFP的编码基因序列；所述改造的GFP为在野生型GFP上插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列而成。改造的GFP荧光蛋白和PRRSV NSP4蛋白酶共表达后，PRRSV NSP4蛋白酶可以切割改造的GFP荧光蛋白，导致荧光淬灭。若存在有效的蛋白酶抑制剂的情况下，则蛋白酶功能被抑制，无法发挥作用切割PRRSV NSP4蛋白酶切割序列，使得荧光蛋白的发光功能得以保留，这便是本发明筛选蛋白酶抑制剂的原理。

一种PRRSV蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，包括以下步骤：

（1）构建共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列而成；

（2）评价：将待转染细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的GFP和PRRSVNSP4蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。

本发明的有益效果是：无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。

附图说明

图1是PRRSV NSP4蛋白酶切割序列插入野生型GFP三个位点后的荧光图以及共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的荧光图， GFP15-NSP4cut1代表在GFP的site15位置插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列cut1: SLLEGAFR所形成的改造的GFP，依此类推；pGFP15-NSP4cut1为表达GFP15-NSP4cut1的质粒，依此类推；pGFP15-NSP4cut1-P2A-NSP4为共表达GFP15-NSP4cut1和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒，依此类推。

图2是本发明共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒示意图。

图3是高通量检测荧光表达情况；01表示pGFP15/45-NSP4cut1/ cut3转染细胞后的三个重复的平均荧光值，02表示pGFP15/45-NSP4cut1/cut3-P2A-NSP4转染细胞后三个重复的平均荧光值，03表示pGFP15/45-NSP4cut1/cut3-P2A-5Xstop-NSP4转染细胞后的三个重复的平均荧光值。

实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

病毒名称

猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Porcine reproductive and perspiratorysyndrome virus，PRRSV)；蛋白酶名称：Protease NSP4；蛋白酶大小204 aa；切割序列大小：8aa,16aa。cut1氨基酸序列为SLLEGAFR，cut2氨基酸序列为FQLEGRYF，cut3氨基酸序列为KDKTAYFQLEGRHFTW。

实施例1：

质粒的构建

（1）构建表达改造的GFP质粒， 改造的GFP为PRRSV NSP4蛋白酶切割序列插入野生型GFP氨基酸序列所形成，改造的GFP荧光蛋白仍然具有激发发光功能；

首先按照Primer Star酶（Takara）说明书对野生型GFP的编码基因和pcDNA3.1(+)载体（市售）进行PCR扩增。将野生型GFP基因序列（SEQ ID No.8）通过同源重组方式（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）克隆到pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点（MCS）之间构建pGFP质粒，作为后续的模板。

通过同源重组技术（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）在野生型GFP氨基酸序列的不同位置（位点A：site15 158~159aa，位点C：site 24 159~160aa, 位点D：site 45 170~171aa）中插入PRRSV NSP4蛋白酶切割序列cut1: SLLEGAFR（SEQ IDNo.2）、cut2: FQLEGRYF（SEQ ID No.3）、cut3: KDKTAYFQLEGRHFTW（SEQ ID No.4），cut1-cut3对应的核苷酸序列为tctcttcttgagggtgctttcaga（SEQ ID No.5）、ttccaacttgaaggtcgctatttc（SEQ ID No.6）、aaagacaagacggcctatttccaacttgaaggccgccattttacctgg（SEQ ID No.7），构建质粒pGFP15/24/45-NSP4cut1/2/3（备注：GFP15/24/45以及cut1/2/3中的“/”代表“或”的意思，下同）。

其中，GFP15- NSP4cut1为PRRSV蛋白酶切割序列NSP4cut1插入在野生型GFP氨基酸序列158~159aa之间（即氨基酸ADKQ和KNG之间）所形成的改造后的荧光蛋白，pGFP15-NSP4cut1为表达改造后的荧光蛋白GFP15- NSP4cut1的质粒，其它依次类推。

准备生长良好的293T细胞，向293T细胞中加入10%FBS DMEM培养基，置于37℃，5％ CO

荧光强度检测时，将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜；每孔转染0.5ug质粒，做三个重复孔，4-6h后换液；37℃ 5%CO2培养箱中培养48h后，于多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）读取荧光值。

（2）构建共表达改造的GFP和PRRSV NSP4蛋白酶的质粒（图2）；

在质粒pGFP15/24/45-NSP4cut1/2/3基础上，通过同源重组方式，将PRRSV NSP4蛋白酶的编码基因序列（SEQ ID No.9）与GFP15/24/45-NSP4cut1/2/3编码基因序列（改造的GFP）通过2A肽编码基因连接，构建pGFP15/24/45-NSP4cut1/2/3-P2A-NSP4质粒并转染293T细胞。转染后每隔24 h观察细胞状态及荧光拍照（图1），并检测荧光强度。

由图1可知，质粒pGFP15-NSP4-cut1，pGFP24-NSP4-cut1，pGFP45-NSP4cut3，在转染细胞后，均可以观测到不同强度的激发绿色荧光。其他质粒pGFP15-NSP4 cut2/3 、pGFP24-NSP4 cut2/3、pGFP45-NSP4 cut1/2转染细胞后，荧光均极微弱或者不能观测到激发荧光（图片未展示）。表明特定的PRRSV NSP4蛋白酶切割序列在野生型GFP以上特定位点插入后所形成的改造的GFP仍然具有激发光功能。同时，在转染pGFP15-NSP4cut1-P2A-NSP4，pGFP24-NSP4cut1-P2A-NSP4，pGF45-NSP4cut3-P2A-NSP4质粒后，随着NSP4蛋白酶的表达，共表达改造的GFP和NSP4蛋白酶的细胞均表现出荧光的消失。这表明， NSP4蛋白酶的表达可以切割改造后的GFP，导致荧光淬灭。后续以效果更优的pGFP15-NSP4-cut1，pGFP45-NSP4cut3为基础进行荧光定量试验。

实施例2：

一种PRRSV蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：

（1）构建共表达改造后GFP和NSP4蛋白酶的质粒，即pGFP15-NSP4cut1-P2A-NSP4、pGFP45-NSP4 cut3-P2A-NSP4（具体构建方法参考实施例1）。

（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板（96孔板）中，然后加入pGFP15-NSP4cut1-P2A-NSP4、pGFP45-NSP4 cut3-P2A-NSP4质粒转染细胞，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。

PRRSV NSP4蛋白酶的编码基因序列：

ggcgctttcagaactcaaaagccctcactgaacaccgtcaatgtggtcgggtcctccatgggctctggcggagtgttcactattgacgggaaaatcaagtgcgtgactgccgcacatgtccttacgggtaactcagctagggtttccggggtcggcttcaatcaaatgcttgactttgatgtaaaaggggacttcgccatagctgattgcccgaattggcaaggggttgctcccaaggcccagttctgcgaggatgggtggactggtcgcgcctattggctgacatcctctggcgttgaacccggtgttattgggaatgggttcgccttctgcttcaccgcgtgtggcgattctggatccccagtgattaccgaagccggtgagcttgtcggcgttcacacaggatcaaacaaacaaggaggaggcattgtcacgcgcccctcaggccagttttgtaatgtgaagcccatcaagctgagtgagttgagtgaattcttcgctggacctaaggtcccgctcggtgatgtgaaaattggcagtcacataattaaagacacatgcgaggtgccttcagatctttgtgccctgcttgctgccaaacccgaactggaa（SEQ ID No.9）。

GFP的氨基酸序列：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*（SEQ ID No.1）。

GFP基因序列：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA（SEQ ID NO.8）。

实施例3：

模拟PRRSV NSP4蛋白酶失活，验证改造后的GFP荧光恢复（定量）在pGFP15-NSP4cut1-P2A-NSP4、pGFP45-NSP4 cut3-P2A-NSP4质粒基础上将NSP4进行破坏构建质粒：

具体操作为利用PCR扩增（Primer Star）及同源重组技术（Uniclone One StepSeamless Cloning Kit试剂盒）在P2A后加入5个连续的终止密码子TGA；对构建好的pGFP15-NSP4cut1-P2A-5×STOP -NSP4、pGFP45-NSP4cut3 -P2A-5×STOP -NSP4 质粒进行转染。转染后每隔24 h观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度（图3）。荧光强度检测时，将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO

由图3可知，在细胞中转染共表达NSP4蛋白酶和GFP15-NSP4cut1或GFP45-NSP4cut3的质粒后（02处理组），荧光强度相比单表达改造的GFP（01处理组）的质粒显著降低，当破坏NSP4蛋白酶的功能表达后，激发荧光显著恢复（03处理组）。

可见，本发明评价蛋白酶抑制剂抗病毒药物的活性灵敏度高，可用于高通量的筛选PRRSV蛋白酶抑制剂以及高通量的检测PRRSV蛋白酶抑制剂抗病毒活性，具有开发优秀的抗病毒药物筛选平台及相应蛋白酶抑制剂活性检测产品的广泛前景。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。