一种倍他米松磷酸钠注射液中杂质的分离检测方法

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种倍他米松磷酸钠注射液中杂质的分离检测方法。

背景技术

倍他米松磷酸钠，化学名称：16β-甲基-11β，17α，21-三羟基-9α-氟孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮-21-磷酸二钠盐，是一种肾上腺皮质激素药，其结构式如下式所示：

倍他米松磷酸钠在临床上主要用于抗炎、抗毒、抗休克、自身免疫性疾病、严重急性感染或炎症、神经疾病脑肿胀、细菌性脑膜脑水肿、急性皮肤病、风湿性疾病等。在针对早期症状严重的疾病治疗中，需要选择快速起效的激素类药物以快速缓解症状。作为一种肾上腺皮质激素药，其具有更强的亲脂性，能迅速穿透细胞膜，快速到达作用靶位，减少水钠潴留；能防止或抑制细胞中介的免疫反应，延迟性过敏反应，并减轻原发免疫反应的扩展；能对抗细菌内毒素对机体的刺激反应，减轻细胞损伤，发挥保护机体。具有相对于一般肾上腺皮质激素药更快的起效速度、作用持久、疗效显著、安全性好，是目前甾体激素类药物的主要产品之一，具有可观的发展前景。倍他米松磷酸钠常见的剂型为注射剂、滴剂。

在多篇公开文献的报道中，倍他米松磷酸钠注射液中含有多种杂质，包括如下式所示的杂质A。各杂质含量过多会影响注射液的药效，有的甚至会引发副反应。申请人在倍他米松磷酸钠注射液的研发过程中，采用中国药典标准中的方法发现杂质A在放置过程有明显增长，在3个月内含量增加6-13倍；在高温条件下增长尤为明显，30天内杂质含量增加9-17倍，严重影响倍他米松磷酸钠注射液的质量。杂质A不会在稳定性放置过程中有明显的增长趋势，推测有未知杂质在杂质A处降解产生，经过研究与谱图的比对，发现了杂质B。

在2020版《中国药典》标准中，公开了倍他米松磷酸钠注射液杂质的限度：如有与对照溶液中倍他米松峰保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算，不得过倍他米松标示量的2.6％，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中倍他米松磷酸纳峰面积的1.5倍(3.0％)，其他杂质峰面积的和不得大于对照溶液中倍他米松磷酸钠峰面积的2.5倍(5.0％)。故需将杂质A与B和倍他米松磷酸钠分离，检测，加以严格控制，以保证产品的质量。

《中国药典》标准中同时公布了1929号倍他米松磷酸钠注射液的标准含量及其鉴别、检查。有关物质参照高效液相色谱法(通则0512)测定，标准中HPLC的色谱条件为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(1:1)为流动相，检测波长为241nm，进样体积20微升。但是，中国药典标准中的方法专属性较差。故为了明确倍他米松磷酸钠注射液有效成分和杂质及其含量，本领域技术人员需要对倍他米松磷酸钠注射液杂质检测方法进行更进一步的研究，实现倍他米松磷酸钠注射液中各杂质的检出和分离。

中国发明专利CN114137091A公开了一种分离检测倍他米松磷酸钠和/或相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八硅烷键合硅胶为填充剂，采用磷酸二氢钾和三氟乙酸的混合溶液、四氢呋喃和有机溶液进行梯度洗脱，使用10mol/L氢氧化钾溶液调节流动相pH为6.3±0.1，流动相流速为1.2mL/min，色谱柱柱温为30℃，该方法将倍他米松磷酸钠及其相关杂质在一套HPLC方法中有效分离，专属性好，不受空白和其他未知杂质干扰。

而杂质B是本申请研究人员新发现的一种杂质，目前还没有关于同时分离检测杂质A、杂质B与倍他米松磷酸钠的方法。因此，本发明的目的在于，针对现有技术的现状，提供一种HPLC法分离测定倍他米松磷酸钠注射液中杂质的方法，该方法能有效分离测定倍他米松磷酸钠注射液中的杂质B，方法灵敏度高、专属性好，检测结果准确可靠。该检测方法有利于对倍他米松磷酸钠注射液进行质量控制，从而解决产品的安全性问题。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种倍他米松磷酸钠注射液中杂质的分离检测方法，该检测方法专属性强、灵敏度高、操作方便，可有效控制药品品质。

为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种倍他米松磷酸钠注射液中杂质的分离检测方法，该方法为HPLC法。

所述HPLC法的色谱条件为：

色谱柱：以十六烷基键合硅胶为填料；

流动相：流动相A为醋酸盐缓冲溶液，流动相B为含三氟乙酸的四氢呋喃；

洗脱：梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：

；

流速：0.5-1.5mL/min；

柱温：20-40℃；

进样体积：15-25μL；

检测波长：224-254nm；

所述分离检测方法，包括步骤：

(1)样品配制：取对照品、供试品溶于稀释剂，分别制得对照品溶液和供试品溶液；

(2)采用上述HPLC法的色谱条件，对对照品溶液和供试品溶液进行高效液相分析。

优选地，所述流动相A为醋酸盐缓冲溶液，醋酸盐缓冲溶液的浓度为10-30mmol/L，醋酸盐缓冲溶液的pH为3.5-6.0；流动相B为含三氟乙酸的四氢呋喃。

进一步优选地，所述流动相A选自醋酸钾缓冲溶液、醋酸钠缓冲溶液、醋酸铵缓冲溶液中的至少一种；流动相B为含0.05-0.2％三氟乙酸的四氢呋喃，v/v。

更进一步优选地，所述流动相A为醋酸钠缓冲液，醋酸钠缓冲液的浓度为10-30mmol/L，醋酸钠缓冲液的pH为3.5-6.0；所述流动相B为含0.1％三氟乙酸的四氢呋喃，v/v。

最优选地，所述流动相A为20mmol/L的醋酸钠缓冲液，醋酸钠缓冲液的pH为4.5；所述流动相B为含0.1％三氟乙酸的四氢呋喃，v/v。

优选地，所述洗脱为梯度洗脱，洗脱程序如下表所示：

。

优选地，所述流速为1.0mL/min。

优选地，所述柱温为30℃。

优选地，所述进样体积为20μL。

优选地，所述检测波长为241nm。

优选地，所述杂质包括杂质A、杂质B；所述杂质A、杂质B的结构式具体如下：

优选地，所述稀释剂选自水、甲醇中的至少一种。

另一方面，本发明提供上述分离检测方法在倍他米松磷酸钠注射液质量检测中的应用。

与现有技术比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的HPLC法能有效分离测定倍他米松磷酸钠注射液中杂质B以及杂质的含量；该方法灵敏度高、专属性强，检查结果可靠准确，有利于对倍他米松磷酸钠注射液中杂质的检出提供技术手段，从而对其进行质量控制。

(2)本发明的HPLC法可以有效检测出杂质B的含量，同时，杂质B作为新的杂质，该杂质的含量检出可以为倍他米松磷酸钠注射液的质量控制和临床安全用药的安全性检测提供参考标准，从而保证临床用药的安全性和可靠性。

附图说明

图1a为杂质B的LC-MS正离子图；

图1b为杂质B的LC-MS正离子放大量程图；

图1c为杂质B的LC-MS负离子图；

图2为杂质B的

图3为专属性试验中空白溶液色谱图；

图4为专属性试验中空白辅料溶液色谱图；

图5为专属性试验中专属性溶液色谱图；

图6为专属性试验中供试品溶液色谱图；

图7为杂质B的线性标准曲线图；

图8为倍他米松磷酸钠的线性标准曲线图；

图9为杂质A的线性标准曲线图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。优选实例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。本发明中的具体实施过程中使用的试剂信息如下：

倍他米松磷酸钠注射液的来源为浙江和沐康医药科技有限公司；批号：Z-BTM2204035；规格1mL:5mg；

空白辅料：含与倍他米松磷酸钠注射液除倍他米松磷酸钠外比例一致的依地酸二钠、磷酸氢二钠和磷酸的混合水溶液；来源为浙江和沐康医药科技有限公司；批号：Z-BTM2204030；

倍他米松磷酸钠对照品：天津天药药业股份有限公司；批号：NBENa211101；含量：92.94％；

杂质A对照品：中国食品药品检定研究院；批号：100118-201204；含量：99.3％；

杂质B对照品：浙江和泽医药科技股份有限公司；批号：D-C16-22060201；含量：98.73％。

实施例1杂质B分离、表征检测

对倍他米松磷酸钠注射液中新的杂质B进行分离富集：采用HPLC法，用十六烷基键合硅胶为填料；以20mmol/L醋酸钠缓冲溶液(用醋酸调pH值至4.5)为流动相A，0.1％三氟乙酸的四氢呋喃为流动相B，按下述所述洗脱程序进行梯度洗脱，流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样体积：1000μL；检测波长：241nm；收集相对保留时间RRT0.71的组分。

利用LC-MS和

LC-MS的检测方法为：

正离子：MS模式：Resolution mode，Polarity：Positive，Capillary：3.0KV，Sampling Cone：40，Source Temperature：120℃，Desolvation Temperature：500℃，ConeGas：50L/h，Desolvation Gas：800L/h，Source offset：30.0，Scan range：100-2000。

负离子：MS模式：Resolution mode，Polarity：Negative，Capillary：-3.0KV，Sampling Cone：40，Source Temperature：120℃，Desolvation Temperature：500℃，ConeGas：50L/h，Desolvation Gas：800L/h，Source offset：30.0，Scan range：100-2000。

1

实施例2杂质检测

(1)HPLC色谱条件：

仪器：Thermo U3000；

色谱柱：十六烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Spherisorb C6，4.6mm×150mm，5μm)；

流动相A：20mmol/L的醋酸钠缓冲液，用20mmol/L的冰醋酸调节pH值至4.5；

流动相B：0.1％三氟乙酸的四氢呋喃。

洗脱：梯度洗脱，洗脱程序如下所述：

；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样体积：20μL；

检测器：VWD；

检测波长：241nm；

数据采集时间：40min。

(2)方法学验证-专属性

空白溶液：蒸馏水。

空白辅料溶液：精密称取空白辅料(总混)1mL，置5mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

倍他米松磷酸钠贮备液：精密称取倍他米松磷酸钠对照品20.05mg，置100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密移取倍他米松磷酸钠贮备液1mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：供试品为倍他米松磷酸钠注射液在105℃下高温存储30天的样品；精密量取上述供试品1mL，置5mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质A定位溶液：精密称取杂质A对照品2.689mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质B定位溶液：精密称取杂质B对照品1.116mg，置50mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质贮备液：精密称取杂质A对照品1.896mg、杂质B对照品2.465mg，置同一20mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

专属性溶液：精密量取倍他米松磷酸钠注射液2mL，置10mL量瓶中，加入杂质贮备液1mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

专属性检测：按上述HPLC色谱条件，精密量取空白溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液、杂质A定位溶液、杂质B定位溶液及专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，专属性溶液结果见表1，色谱图见图3-图6。

表1

专属性结果表明：专属性溶液中各杂质与前后杂质分离度均大于1.5，分离度良好，本发明提供的分离检测方法专属性好。

(3)方法学验证-定量限

杂质贮备液：配制同上述“专属性”项下。

倍他米松磷酸钠贮备液：精密称取倍他米松磷酸钠对照品2.632mg，置100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

定量限贮备液：精密量取杂质贮备液1mL，倍他米松磷酸钠贮备液1mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

定量限溶液：精密量取定量限贮备液1mL，置10mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制6份)。

定量限检测：按上述HPLC色谱条件，精密量取定量限溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算6份倍他米松磷酸钠和杂质峰面积的RSD％。杂质B的定量限结果见表2，倍他米松磷酸钠的定量限结果见表3，杂质A的定量限结果见表4。

表2

表3

表4

定量限结果表明：6份定量限溶液各峰信噪比均大于10，各杂质峰峰面积相对标准偏差(RSD)均小于10％。当样品浓度为1mg/mL时，杂质A、杂质B分别在超出供试品浓度的0.02％时，可被准确定量。

(4)方法学验证-检测限

检测限溶液：精密移取3mL定量限溶液，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。检测限检测：取上述溶液，按上述HPLC色谱条件，精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，检测限结果见表5。

表5

检测限结果表明：杂质B、倍他米松磷酸钠、杂质A的信噪比分别为9.9、9.8、4.3，均大于3。当样品浓度为1mg/mL时，杂质B、倍他米松磷酸钠、杂质A、其他单杂分别超出供试品浓度的0.008％、0.008％、0.006％时，杂质可被检出，方法检测灵敏度高。

(5)方法学验证-线性与范围

倍他米松磷酸钠贮备液：同“(3)定量限”项下。

杂质贮备液：同“(2)专属性”项下。

线性(定量限)溶液：分别精密移取倍他米松磷酸钠贮备液1mL、杂质贮备液溶液1mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性(50％)溶液：分别精密移取倍他米松磷酸钠贮备液1mL、杂质贮备液溶液1mL，置20mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性(100％)溶液：分别精密移取倍他米松磷酸钠贮备液1mL、杂质贮备液溶液1mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性(150％)溶液：分别精密移取倍他米松磷酸钠贮备液1.5mL、杂质贮备液溶液1.5mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

线性(200％)溶液：分别精密移取倍他米松磷酸钠贮备液2mL、杂质贮备液溶液2mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

检测：精密量取上述线性溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回归方程。计算杂质的校正因子。结果见表6-表8，图7-图9。其中杂质B的线性结果见表6，倍他米松磷酸钠的线性结果见表7，杂质A的线性结果见表8。杂质的校正因子＝主成分线性回归方程斜率/杂质线性回归方程斜率。

表6

表7

表8

线性结果表明：杂质B、倍他米松磷酸钠、杂质A在各自的浓度范围内，线性回归方程的相关系数(r)均大于0.995，Y轴截距均在100％响应值的10％以内，响应因子的RSD％均在10％以内，均符合要求，本方法线性关系良好。

(6)方法学验证-耐用性

取专属性溶液，分别防止0h、5h、15h、24h、48h后，开始进样检测，进行耐用性考察。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，考察结果如表9所示。

表9

耐用性结果表明：48h内各杂质及总杂均无明显变化，溶液稳定性良好，本方法耐用性良好。

实施例3

与实施例2不同的是，HPLC的色谱条件中流动相不同，其中，流动相A为浓度为30mmol/L的醋酸钾缓冲溶液，pH为6.0；流动相B为0.2％三氟乙酸的四氢呋喃。

其余条件和参数均相同。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，专属性溶液结果见表10。

表10

结果表明：使用本申请的检测方法和HPLC的色谱检测条件，可以将专属性溶液中的杂质分离开，分离度为均大于1.5，各成分峰分离效果良好，无重叠。

实施例4

与实施例2不同的是，HPLC的色谱条件中洗脱程序不同，本实施例的洗脱程序为：

其余条件和参数均相同。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，专属性溶液结果见表11。

表11

结果表明：使用本申请的检测方法和HPLC的色谱检测条件，可以将专属性溶液中的杂质分离开，分离度均大于1.5，各成分峰分离效果良好，无重叠。

实施例5

与实施例2不同的是，HPLC的色谱条件中柱温和检测波长不同，其中，柱温为40℃，检测波长为254nm。

其余条件和参数均相同。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，专属性溶液结果见表12。

表12

结果表明：使用本申请的检测方法和HPLC的色谱检测条件，可以将专属性溶液中的杂质分离开，分离度均大于1.5，各成分峰分离效果良好，无重叠。

对比例1

使用2020版《中国药典》标准中的HPLC法进行杂质的检测。检测结果见表13。

表13

结果表明：标准法检测倍他米松磷酸钠注射液，杂质B与倍他米松磷酸钠峰未实现基线分离，分离度为0.43，小于1.5，杂质B与倍他米松磷酸钠分离度不符合要求，分离度较差。

对比例2

与实施例2不同的是，HPLC的色谱条件中流动相不同，其中，流动相A为磷酸二氢钾溶液：取1.36g磷酸二氢钾，加水溶解稀释至1000mL，加入3mL三氟乙酸，混匀，用10mol/L氢氧化钾溶液调节pH6.3±0.1。

其余条件和参数均相同。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，专属性溶液结果见表14。

表14

结果表明：该检测方法下，杂质B与倍他米松磷酸钠峰基本重合，分离度小于1.5，杂质B与倍他米松磷酸钠分离度不符合要求，分离度较差。

对比例3

与实施例2不同的是，HPLC的色谱条件中色谱柱不同，本对比例使用的色谱柱为十八烷基键合硅胶(Discovery，C18 250×4.6mm，5μm)。

其余条件和参数均相同。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，专属性溶液结果见表15。

表15

结果表明：该检测方法下，杂质B与倍他米松磷酸钠峰完全重合，杂质B与倍他米松磷酸钠分离度不符合要求，该方法不能实现倍他米松磷酸钠和杂质B的分离效果。

对比例4

与实施例2不同的是，HPLC的色谱条件中洗脱程序不同，本对比例的洗脱程序为：

其余条件和参数均相同。

按上述HPLC色谱条件，精密量取专属性溶液20μL，注入液相色谱仪，专属性溶液结果见表16。

表16

表16结果表明：该检测方法下，杂质A、杂质B、倍他米松磷酸钠出峰过早，杂质B与倍他米松磷酸钠峰完全重合，杂质A与倍他米松磷酸钠分离度小于1.5，分离度不符合要求。最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。