一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置及方法

技术领域

本发明涉及水中大肠杆菌检测领域，更具体地涉及一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置及方法。

背景技术

水环境的健康是人们日常生活的基本保障，而微生物指标是水质检测中的重要内容。采用平板培养法检测微生物的数量，耗时48h，检测时间长；即便对近年来临床感染病例数排名第一的致病性大肠杆菌，采用检测特定微生物的产气法，也至少需要24h才能出结果。耗时长，还会给检测人员带来潜在的感染风险。

国内微生物检测目前依据平板培养法作为“金标准”，检测时间长、操作略微复杂；国外微生物检测主要依据免疫分析法、分子生物学法以及近些年来发展起来的质谱法。免疫分析法主要利用抗体与微生物表面具有免疫原性的区域发生特异性识别来实现检测，包括酶联免疫分析法、免疫层析法等，但是该方法存在抗体制备批次间差异大、稳定性差，精密度低等缺陷；分子生物学法主要通过聚合酶链式反应来进行菌种鉴定，虽然特异性较高，但PCR反应易受气溶胶污染，且需在特定环境中进行操作；质谱法主要采用基质辅助-时间飞行质谱技术，依据微生物体内蛋白质表达谱的特征谱峰进行菌种的鉴定，但质谱仪价格较高，限制了其推广应用，且此法并不能满足微生物的定量检测需求。

综上所述，迫切需要一种检测时间短、灵敏度高、操作简单的水中大肠杆菌定量检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置及方法，从而解决现有水中大肠杆菌定量检测方法存在的检测时间长、灵敏度低、操作繁琐的问题。

根据本发明的第一方面，提供一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置，包括：用于容纳检测液的水样池，所述检测液通过在待测水样中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(4-MUG)配制而成；用于容纳油相的油相池；恒压泵；通过管道分别与所述水样池、所述油相池连接的液滴微流控芯片，其包括：检测液流道、油相流道、液滴观察区，所述检测液流道和所述油相流道在所述液滴观察区前交汇，使检测液在油相的剪切力作用下生成油包水微液滴并平铺于所述液滴观察区中；用于对所述液滴微流控芯片进行拍照的荧光显微镜；电磁阀；以及连接于所述液滴微流控芯片下游用于接收过量液体的废液池。

还包括设置于所述液滴微流控芯片下方的热板，用于对微液滴进行加热使其完成酶促反应。

所述电磁阀设置于所述液滴微流控芯片与所述废液池之间。

恒压泵、水样池、油相池、液滴微流控芯片、电磁阀、废液池中的相邻部件之间通过PVC管道连通。

根据本发明的第二方面，提供一种基于高通量液滴进行水中大肠杆菌灵敏检测的方法，包括以下步骤：S1：提供一种如上面所述的基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置；S2：向待测水样中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸，配制得到检测液；S3：打开恒压泵，将检测液和油相同时泵入液滴微流控芯片，通过调节所述恒压泵的压力，检测液可被分散成直径为100～200μm的均一的油包水微液滴；S4：微液滴生成后平铺在液滴观察区中，将该液滴微流控芯片置于42℃热板上，经过30min的孵育，含有目标大肠杆菌的微液滴内会反应生成大量荧光物质；S5：在荧光显微镜下对所述液滴微流控芯片进行拍摄统计，经过计算即可得出待测水样中的大肠杆菌浓度。

针对大肠杆菌内的葡萄糖醛酸苷酶(GUS)可以催化荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(4-MUG)反应产生荧光，本发明提供了一种基于液滴微流控芯片的水中大肠杆菌检测装置，能够将大肠杆菌单包裹在液滴内进行酶促反应反应，大大提高检测效率和灵敏度。本装置将大肠杆菌包裹在微液滴内进行酶促反应；微液滴生成后平铺在芯片内部，经过大约30分钟的孵育，含有目标大肠杆菌的液滴内会反应生成大量荧光物质，在荧光显微镜下对其进行拍照统计，计算即可得出大肠杆菌浓度。应当理解的是，现有技术虽然可以实现大肠杆菌的检测，但是检测时间较长，而本发明通过采用液滴单菌包裹技术，大大提高了菌与反应底物的反应速度，缩短了检测时长。总之，本发明实现了水中大肠杆菌的快速，高灵敏、高准确率检测。

与现有的水中大肠杆菌检测装置相比，根据本发明提供的一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置具有以下几个优势：1)100μL菌液可以生成数万个大小均一的液滴，每个液滴包裹一个大肠杆菌，实现菌体的单个检测，大大提高了检测的灵敏度；2)在不更换整体装置的前提下，改变反应底物，实现各种细菌的检测；3)所有单元均可长期重复使用，系统更换和维护成本低。

附图说明

图1为根据本发明的一个优选实施例提供的一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置结构示意图；

图2为液滴生成图；

图3为液滴内酶促反应图；

其中，附图标记的含义如下：

100：水样池；101：恒压泵；102：油相池；103：液滴微流控芯片；104：荧光显微镜；105：电磁阀；106：废液池。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

如图1所示，是根据本发明的一个优选实施例提供的一种基于高通量液滴的水中大肠杆菌灵敏检测的装置，包括：水样池100、恒压泵101、油相池102、液滴微流控芯片103、荧光显微镜104、电磁阀105、以及废液池106。液滴微流控芯片103的下方还设有加热板(图未示出)，各相邻部件之间使用PVC管道连接。

液滴微流控芯片103包括：检测液流道、油相流道、液滴观察区，检测液流道和油相流道在液滴观察区前的一个十字形结构处交汇，使检测液在油相的剪切力作用下生成油包水微液滴并平铺于所述液滴观察区中。

根据本发明提供的这样一种装置，恒压泵101将添加了反应底物的检测液和油相分别从水样池100和油相池102以恒定速度泵入液滴微流控芯片103，检测液和油相在交汇处生成油包水液滴，大肠杆菌被包裹在液滴内，随后在热板上42℃加热30min完成酶促反应，并在荧光成像显微镜上拍摄，统计产生荧光的液滴数量，通过计算可以得到检测液中的大肠杆菌浓度。

为了避免检测液量过多超过芯片腔室所能容纳的液体体积，该装置还设置了用于接收过量菌液的废液池106。当菌液全部生成液滴后，恒压泵101停止产生正压，此时关闭电磁阀105，以防腔室内的液滴倒流。

根据本发明的一个优选实施例，采用该装置进行水中大肠杆菌灵敏检测的方法包括以下步骤：

1.液滴包裹大肠杆菌：

打开恒压泵101，检测液和油相同时被泵入液滴微流控芯片103，通过调节泵入的压力，检测液可被分散成直径100～200μm尺寸均一的油包水微液滴，如图2所示。

2.酶促反应及检测：

微液滴生成后平铺在液滴微流控芯片103的液滴观察区，置于42℃热板子上经过30分钟的孵育，含有目标大肠杆菌的液滴内会反应生成大量荧光物质，如图3所示。液滴微流控芯片103置于荧光显微镜104下进行拍摄统计，经过计算即可得出大肠杆菌浓度。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。