一种检测余甘子间座壳菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种检测余甘子间座壳菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

间座壳属Diaporthe属子囊菌门、粪壳纲、间座壳目、间座壳科，含有1000多个种。该属菌株具有广泛的寄主范围，可侵染多种植物的枝、叶和果实等组织，已成为许多农作物的重要致病菌之一。间座壳菌Diaporthe phoenicicola是一种新近发现的引起余甘子(又称油甘)果实斑点病的病原菌，导致果实品质和商品性下降，严重时可引起果实干枯、脱落。因此，非常有必要加强余甘子间座壳菌Diaporthephoenicicola的病情监测，建立快速检测方法，为该病害的风险预判和科学防治提供依据，从而有助于降低余甘子间座壳菌引起的经济损失。

对于间座壳属菌株，传统的检测方法主要是采用平板分离法，需要在室内无菌条件下分离、培养，并根据该属菌株的形态学进行鉴定，导致分离检测的时间长(一般需3天以上)，而且容易受菌株生长形态变化影响，难以保证准确性。近几十年来，越来越多的分子生物学技术被应用到间座壳属菌株的检测中，其中包括荧光定量PCR(Real-time PCR)技术。虽然荧光定量PCR技术具有良好的特异性和灵敏度，但是其检测时间较长，同时依赖精密的仪器设备来控制温度进行扩增，操作过程复杂，并且不能可视化，难以满足快速检测的需求。

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种新的等温核酸扩增技术，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、成本低等优点。该技术针对靶标基因的6个区域设计4种特异的引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60℃～65℃温度范围内进行恒温扩增，可在短时间内大量合成目标DNA的同时伴随产生副产物白色焦磷酸镁沉淀。由于LAMP扩增是使用4种不同的引物，专门设计用于识别目标基因的6个独立区域，包括3’端和5’端的各3个不同区域，所以反应特异性很强，并可在恒温条件下进行，因此操作条件要求不高，检测成本可大大降低。该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原菌的检测研究，但在用于余甘子间座壳菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测余甘子间座壳菌的LAMP引物组，可对余甘子体内的间座壳菌进行快速、准确的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测余甘子间座壳菌的LAMP引物组，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP；所述外引物F3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种包含所述引物组的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括LAMP反应液、反应酶和荧光染料。

优选地，所述引物组中内外引物浓度比为6:1～12:1。

优选地，所述反应液包括1～2μM dNTPs、15～25mM Tris-Hcl、8～12mM KCl、8～12mM(NH

本发明还提供了一种余甘子间座壳菌的LAMP检测方法，包括如下步骤：以待测样品的基因组DNA为模板，用所述LAMP引物组，或所述的试剂盒进行LAMP扩增，待LAMP扩增反应结束后，加入荧光染料，观察扩增产物的颜色变化，实现对余甘子间座壳菌进行鉴定。

优选地，所述扩增条件为62～66℃恒温反应30～70min。

优选地，观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为黄绿色，表示待检样品中存在余甘子间座壳菌，如果颜色没有变化仍为紫色，表示待检样品中不存在余甘子间座壳菌。

本发明还提供了一种所述的引物组或所述试剂盒在检测余甘子病原菌中的应用。

相比现有技术，本发明具有如下技术效果：

(1)操作方便：克服了现有技术中间座壳属菌的检测方法所需时间周期长、特异性差、灵敏度低和对仪器设备要求高等问题以及无法快速、可视化检测间座壳属菌的问题。本发明检测方法在62～66℃等温条件下，只需30～70min就可准确、快速、高效地检测出座壳属菌，对实验仪器和场所要求简单，能较好满足对座壳属菌的田间检测。

(2)准确性高：克服传统检测方法根据形态特性进行分离鉴定，容易受菌株生长形态变化影响，同时受到近似种的影响，难以准确鉴定。本发明根据余甘子间座壳菌Diaporthephoenicicola的EF1-α基因序列，利用BLAST软件将Diaporthephoenicicola的EF1-α基因序列与其他同属不同种间座壳菌的EF1-α序列进行比对，选取了余甘子间座壳菌EF1-α的特有的区域设计特性性的LAMP引物。该LAMP引物包括4条引物(F3、B3、FIP和BIP)，通过特异性识别靶标序列上的6个独立区域，其特异性较高。

(3)灵敏度高：本发明建立的余甘子间座壳菌的LAMP检测方法，灵敏度非常高，达到了10pg DNA，比普通PCR(1000pg)高100倍，表明该检测方法足以在病原菌DNA浓度较低情况下准确快速地检测出余甘子间座壳菌。

(4)可视化：本发明建立的余甘子间座壳菌的LAMP检测方法，可视化程度高，可通过肉眼观察获得检测结果，通过扩增反应溶液中加入SYBR Green I，可在正常日光观察到反应溶液的颜色变化，发生阳性扩增的反应溶液为黄绿色，未发生扩增(阴性)的反应溶液为橙黄色。

附图说明

图1为本发明引物组的扩增结果图(A为正常日光；B为蓝光；C为凝胶电泳扩增)；

图2为本发明引物组设计方案；

图3为本发明LAMP体系的优化；

图4为本发明LAMP检测的灵敏度测试结果(A为正常日光；B为蓝光；C为凝胶电泳扩增)；

图5为本发明LAMP的特异性测试结果(A为正常日光；B为蓝光)；

图6为本发明的LAMP检测体系在余甘子上的实际应用。

具体实施方式

本发明提供了一种检测余甘子间座壳菌的LAMP引物组，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP；所述外引物F3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，内引物BIP核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种包含所述引物组的试剂盒。

在本发明中，所述试剂盒还包括LAMP反应液、反应酶和荧光染料。

在本发明中，所述引物组中内外引物浓度优选比为6:1～12:1；更优选为8:1～10:1。在本发明的具体实施例中，通过设置FIP/BIP引物对和F3/B3引物对浓度比例依次为1:1、2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1进行扩增优化试验。结果表明，当内外侧引物浓度比处于6:1～12:1范围内均可出现目的基因的大量扩增，而内外侧引物浓度比值低于6:1时并未出现黄绿色的颜色反应。在本发明的具体实施例中，所述内引物FIP浓度优选为1～2μM、内引物BIP浓度为1～2μM、外引物F3浓度优选为0.1～0.5μM、外引物B3浓度优选为0.1～0.5μM；所述内引物FIP的浓度更优选为1.6μM、内引物BIP的浓度更优选为1.6μM、外引物F3的浓度更优选为0.2μM、外引物B3的浓度更优选为0.2μM。

在本发明中，所述反应液优选地包括1～2μM dNTPs、15～25mM Tris-Hcl、8～12mMKCl、8～12mM(NH

本发明还提供了一种余甘子间座壳菌的LAMP检测方法，包括如下步骤：以待测样品的基因组DNA为模板，用所述LAMP引物组，或所述的试剂盒进行LAMP扩增，待LAMP扩增反应结束后，加入荧光染料，观察扩增产物的颜色变化，实现对余甘子间座壳菌进行鉴定。

在本发明中，所述扩增条件优选为62～66℃恒温反应30～70min；更优选为温度为62～66℃恒温反应30～70min。在本发明的具体实施例中，通过设置60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃和66℃共7个梯度进行扩增反应优化。结果表明，反应温度在62℃～66℃时LAMP体系呈现明显的黄绿色颜色变化，但温度低于62℃时却为橙黄色。通过设置时间分别为20min、30min、40min、50min、60min、70min进行扩增反应优化。结果表明，当反应时间在30～70min内均可确保LAMP反应的正常进行，但反应时间低于30min时，LAMP体系无黄绿色颜色变化。

在本发明中，观察扩增产物的颜色变化，如果颜色由紫色变为黄绿色，表示待检样品中存在余甘子间座壳菌，如果颜色没有变化仍为紫色，表示待检样品中不存在余甘子间座壳菌。

本发明还提供了一种所述的引物组或所述试剂盒在检测余甘子病原菌中的应用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1LAMP引物组设计

以余甘子间座壳菌DNA为模板，利用引物EF1-728F和EF1-986R扩增其EF1-α基因，PCR产物纯化后并送北京擎科生物科技股份有限公司测序，根据测序结果从NCBI数据库下载同属不同种序列，在线网站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行对比寻找最大差异位点，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)对余甘子(油甘果实)间座壳菌EF1-α保守区域设计引物。其中，引物组包括4条引物，分别为外侧引物F3和B3，内侧引物FIP和BIP，引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。序列如表1所示：

表1引物序列

以Bst聚合酶试剂盒中的常规LAMP反应体系为基础，加入LAMP引物组，2.5μL 10×ThermoPol Buffer，1μL MgSO

根据图1所示，与对照CK相比，添加本发明引物组PCR管中反应液体由无色变为黄绿色，在蓝色荧光下颜色反应更加明显，经2％琼脂糖凝胶电泳后可见清晰的梯形条带(图1C中泳道4)。本发明引物组的设计方法如图2所示。

实施例2LAMP反应体系优化

通过调整LAMP的试剂浓度、温度和时间对反应体系进行优化，分别设置Mg

根据图3所示，当Mg

实施例3LAMP检测的灵敏度测试

将余甘子间座壳菌DNA浓度分别稀释为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 7个浓度梯度，以优化后的LAMP体系进行检测，LAMP体系如下：1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.4μM dNTPs、20mM Tris-Hcl、10mM KCl、10mM(NH

同时，以不同浓度DNA为模板，基于特异性外侧引物对F3/B3进行PCR鉴定，PCR体系为2×Master Mix 15μL、DNA模板2μL、10μmol/L上下游引物各1.5μL、ddH

根据图4所示，当DNA浓度为0.01～100ng/μL范围时LAMP体系经染色后均由无色变为黄绿色，且在蓝色荧光下黄绿色颜色反应更加明显，由图4A、图4B可知，LAMP反应的最低检测浓度为10pg/μL，而PCR后琼脂糖凝胶结果显示当DNA浓度为1～100ng/μL时有明显条带出现，DNA浓度低于1ng/μL后并未扩增出任何条带。说明本发明检测中LAMP反应的灵敏度是普通PCR技术的100倍。

实施例4LAMP检测的特异性测试

将供试菌株为余甘子间座壳菌Diaporthephoenicicola、余甘子青霉菌Penicillium choerospondiatis、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum、草莓黑斑病Alternaria alternata、草莓炭疽病Colletotrichumfragariae、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea、可可球二孢菌Lasiodiplodia theobromae不同真菌的DNA浓度均调整为100ng/μL，分别加入到优化后的LAMP体系中进行水浴，用无菌水作为阴性对照，反应结束后加入SYBR Green I观察显色变化。

根据图5所示，经SYBR Green I染色后显示仅含有余甘子间座壳菌(Diaporthephoenicicola)DNA的LAMP反应由无色变为黄绿色，其他6种植物病原菌的DNA及清水对照均无颜色变化，说明本发明的引物组对余甘子间座壳菌的鉴定具有特异性。

实施例5余甘子实际病原菌的检测

余甘子果实于广东省汕尾市陆河县余甘子产业园种植基地采集，并及时带回广东省农业科学院果树研究所农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室进行相关试验。

利用一次性注射器在余甘子果实赤道部位打孔(深度3mm×宽度3mm)，将在PDA上培养4天的余甘子间座壳菌接种于伤口处，25℃培养5天。取0.3g的腐烂组织于1.5mL离心管中提取粗DNA作为LAMP模板。分别取1.0μL粗DNA进行LAMP反应和PCR扩增，通过比较两者阳性结果对LAMP反应在实际应用中的准确率进行评估。

经LAMP反应后染色发现8个反应体系中1、2、4、7、8号均有无色变为黄绿色，呈现阳性反应，而3、5、6号为阴性反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示，1、2、4、7、8号均有大约190bp的特异性条带出现，而3、5、6号泳道仅有引物二聚体。根据图6可知，LAMP反应与PCR扩增的阳性结果完全一致，证明LAMP技术的准确率为100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。