用于增强的免疫疗法的系统和组合物及其方法

交叉引用

本申请要求于2021年2月24日提交的国际申请号PCT/CN2021/077693的权益，将该国际申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及一种用于免疫疗法的系统和方法。与对照细胞(例如，非工程化免疫细胞)相比，免疫细胞可以被工程化以表现出延长的半衰期。与对照细胞相比，免疫细胞可以被工程化以表现出增强的增殖。免疫细胞可以被工程化以有效和特异性地靶向对照细胞不足以或无法靶向的病变细胞(例如癌细胞)。本文公开的工程化免疫细胞可以在离体、体外和在一些情况下在体内进行工程化。可以将离体或体外制备的工程化免疫细胞施用于有需要的对象以治疗疾病(例如，骨髓瘤或实体瘤)。工程化免疫细胞对于所述对象可以是自体的。可替代地，工程化免疫细胞对于所述对象可以是同种异体的。

背景技术

癌症(例如，赘生物、肿瘤)是全球主要的死亡原因，每年造成约1000万人死亡。癌症持续地给个人、家庭、小区和国家带来越来越大的健康、经济和情感负担。增加对癌症生物学(例如，特别是癌症免疫生物学)和基因工程的了解促进了过继细胞疗法(例如，细胞免疫疗法)的发展，其目标是治疗或控制许多不同的癌症。

发明内容

本公开内容提供了用于治疗癌症的方法和系统。本公开内容的一些方面提供了工程化免疫细胞(例如工程化自然杀伤(NK)细胞)及其用于治疗癌症(例如血液恶性肿瘤或实体瘤)的方法。

在一个方面，本公开内容提供了一种工程化细胞，其包含：以下一者或两者(i)异源CD16变体，该异源CD16变体用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导，和(ii)IL-15的异源变体或其受体；和嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含能够结合CD19的抗原结合部分。

在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.39的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.40的多肽序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.41的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.42的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.16的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.17的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.43的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.44的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞是工程化NK细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞是工程化T细胞。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞是工程化B细胞。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞是分离的干细胞或诱导的干细胞的工程化变体。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞包含(ii)IL-15的异源变体或其受体。

在一些实施方案中，异源变体包含分泌型IL-15或膜结合多肽。在一些实施方案中，IL-15的异源变体是分泌型IL-15，其包含与SEQ ID NO.24的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15的异源变体是膜结合多肽，其中膜结合多肽包含IL-15的至少一部分和IL-15受体的至少一部分。在一些实施方案中，IL-15的至少一部分和IL-15受体的至少一部分通过接头连接。在一些实施方案中，接头选自(GGGGS)n、(EGKSSGSGSESKST)n和(EGKSSGSGSESKST)n(GGGGS)n。在一些实施方案中，n是选自1-10的任何整数。在一些实施方案中，接头包含与选自SEQ IDNo.18-20和55-60的任何一个序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，膜结合多肽进一步包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO.21的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，膜结合多肽进一步包含细胞外信号肽。在一些实施方案中，细胞外信号肽包含与SEQ ID NO.22或31的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，膜结合多肽包含与选自SEQID NO.13-15和52-54的任何一个序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞包含(i)异源CD16变体。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，异源CD16变体包含F158V(F176V)。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，异源CD16变体包含S197P。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，异源CD16变体包含与SEQ IDNO.23的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域包含衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含衍生自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，嵌合抗原受体进一步包含信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域包含衍生自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或其任何组合的氨基酸序列。

在一个方面，本公开内容提供了一种工程化NK细胞，所述工程化NK细胞包含嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含表现出与CD19特异性结合的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分的特征在于选自下组的成员：(1)包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.39的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.40的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，(2)包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.16的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.17的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，或(3)包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.43的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQID NO.44的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分的特征在于(1)。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.41的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.42的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分的特征在于(2)。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.35的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.34的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分的特征在于(3)。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.45或47的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.46、48或61的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞进一步包含用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的异源CD16变体。

在一些实施方案中，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何工程化细胞的一些实施方案中，工程化细胞进一步包含IL-15的异源变体或其受体。在一些实施方案中，IL-15的异源变体或其受体是分泌型IL-15。在一些实施方案中，分泌型IL-15包含与SEQ ID NO.24的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15的异源变体或其受体是膜结合多肽。在一些实施方案中，膜结合多肽包含与选自SEQ ID NO.13-15和52-54的任何一个序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本公开内容提供了一种或更多种编码嵌合抗原受体的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含表现出与CD19特异性结合的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分的特征在于选自下组的成员：(1)包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQID NO.39的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.40的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；(2)包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.16的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.17的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；或(3)包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.43的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.44的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分的特征在于(1)。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.41的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.42的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分的特征在于(2)。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.35的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.34的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分的特征在于(3)。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与SEQ ID NO.45或47的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO.46、48或61的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，所述一种或更多种多核苷酸进一步编码用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的异源CD16变体。在一些实施方案中，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，所述一种或更多种多核苷酸进一步编码IL-15的异源变体或其受体。在一些实施方案中，IL-15的异源变体或其受体是分泌型IL-15。在一些实施方案中，分泌型IL-15包含与SEQ ID NO.24的多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15的异源变体或其受体是膜结合多肽。在一些实施方案中，膜结合多肽包含与选自SEQ ID NO.13-15和52-54的任何一个序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，单个多核苷酸编码：(i)嵌合抗原受体；和(ii)异源CD16变体和/或IL-15的异源变体或其受体。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，(A)第一多核苷酸分子编码(i)嵌合抗原受体但不编码(ii)异源CD16变体和/或IL-15的异源变体或其受体；以及(B)第二多核苷酸分子编码(i)异源CD16变体和/或IL-15的异源变体或其受体，但不编码(ii)嵌合抗原受体。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，所述一种或更多种多核苷酸是人密码子优化的。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，所述一种或更多种多核苷酸是至少一种病毒载体的部分。在一些实施方案中，所述至少一种病毒载体包含AAV载体。

在本公开内容的任何一种或更多种多核苷酸中的一些实施方案中，所述一种或更多种多核苷酸不是病毒载体的部分。

在一个方面，本公开内容提供了组合物，其包含前述实施方案中任一项所述的一种或更多种多核苷酸。

在一个方面，本公开内容提供了组合物，其包含前述实施方案中任一项所述的工程化细胞或工程化NK细胞。

在一些实施方案中，组合物还包含单独的治疗剂。在一些实施方案中，单独的治疗剂是化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是抗体。

在一个方面，本公开内容提供了一种用于治疗对象的病症的方法，所述方法包括向所述对象施用前述实施方案中任一项所述的组合物。

在一些实施方案中，对象的病症是癌症或肿瘤。

在一个方面，本公开内容提供前述实施方案中任一项所述的方法，其中在(ii)向对象施用工程化细胞或工程化NK细胞之前、同时或之后(i)向对象施用组合物的单独的治疗剂。

在一方面，提供了一种工程化细胞，其包含：(i)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体；(ii)异源IL-15、异源IL-15受体或其片段以及(iii)嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含能够结合CD19的抗原结合部分。

在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.16具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO.17具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，工程化细胞包含干细胞、祖细胞和特异性细胞。在一些实施方案中，干细胞包含分离的干细胞和诱导的干细胞。在一些实施方案中，干细胞包含胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，祖细胞包含分离的祖细胞和诱导的祖细胞。在一些实施方案中，祖细胞包含造血干细胞、髓系祖细胞、巨核系祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。在一些实施方案中，特异性细胞包含分离的特异性细胞和诱导的特异性细胞。在一些实施方案中，特异性细胞包含T细胞、B细胞和NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，NK细胞衍生自分离的祖细胞或诱导的祖细胞。在一些实施方案中，本文公开的特定细胞可以是分化的细胞。

在一些实施方案中，异源IL-15包含分泌型IL-15和膜结合型IL-15。

在一些实施方案中，异源IL-15是包含与SEQ ID NO.24具有至少80％同一性的氨基酸序列的分泌型IL-15。在一些实施方案中，膜结合型IL-15包含IL-15的至少一部分和IL-15受体的至少一部分。

在一些实施方案中，IL-15的至少一部分和所述IL-15受体的至少一部分通过接头连接。在一些实施方案中，接头选自(GGGGS)n、(EGKSSGSGSESKST)n和(EGKSSGSGSESKST)n(GGGGS)n。在一些实施方案中，n是选自1-10的任何整数。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由SEQ ID NO.18-20组成的组中的任一个具有至少80％同一性。在一些实施方案中，膜结合型IL-15还包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO.21具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，膜结合型IL-15还包含细胞外信号肽。在一些实施方案中，细胞外信号肽包含与SEQ ID NO.22具有至少80％同一性的氨基酸。在一些实施方案中，膜结合型IL-15包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO.13-15和52-54的任何一个序列具有至少80％同一性。

在一些实施方案中，CD16变体是与细胞异源的。在一些实施方案中，CD16变体包含F158V(F176V)。如本文全文公开的，F158V可以是由于从成熟蛋白的N末端氨基酸开始计数，不包含信号肽，并且F158V和F176V可以指相同的氨基酸取代。在一些实施方案中，CD16变体还包含S197P。在一些实施方案中，CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或其任何组合。

在另一方面，提供了一种多核苷酸，其包含：(i)编码用于增强的CD16信号传导的CD16变体的第一序列，(ii)编码异源IL-15的第二序列，和(iii)编码嵌合抗原受体的第三序列，所述嵌合抗原受体包含能够结合CD19的抗原结合部分。在一些实施方案中，编码CD16变体的第一序列包含与SEQ ID NO.27具有至少80％同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，编码异源IL-15的第二序列包含编码分泌型IL-15的核酸序列或编码膜结合型IL-15的核酸序列。在一些实施方案中，编码分泌型IL-15的核酸序列包含与SEQ ID NO.30具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码膜结合型IL-15的核酸序列包含与SEQ ID NO.28或29具有至少80％同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，第三序列包含：(a)编码抗原结合部分的重链可变区的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO 25具有至少80％同一性；和(b)编码抗原结合部分的轻链可变区的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO 26具有至少80％的同一性。

在另一方面，提供了一种工程化细胞，包含：(i)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体；(ii)异源IL-15，其中所述异源IL-15是膜结合型IL-15，包含与选自SEQ ID No.13-15和52-54中的任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；和(iii)包含能够结合CD19的抗原结合部分的嵌合抗原受体。

在一些实施方案中，工程化细胞包含干细胞、祖细胞和特异性细胞。在一些实施方案中，干细胞包含分离的干细胞和诱导的干细胞。在一些实施方案中，干细胞包含胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，祖细胞包含分离的祖细胞和诱导的祖细胞。在一些实施方案中，祖细胞包含造血干细胞、髓系祖细胞、巨核系祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。在一些实施方案中，特异性细胞包含分离的特异性细胞和诱导的特异性细胞。在一些实施方案中，特异性细胞包含T细胞、B细胞和NK细胞。在一些实施方案中，NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，NK细胞衍生自分离的祖细胞或诱导的祖细胞。

在一些实施方案中，CD16变体是与细胞异源的。在一些实施方案中，CD16变体包含F158V(F176V)。在一些实施方案中，CD16变体还包含S197P。在一些实施方案中，CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合部分是选自Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和sdAb的抗体。在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.16具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.17具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或其任何组合。

在另一方面，提供了一种多核苷酸，其包含：(i)编码用于增强的CD16信号传导的CD16变体的第一序列；(ii)编码膜结合型IL-15的第二序列，其中所述第二序列包含与SEQID NO.28或29具有至少95％同一性的核酸序列；和(iii)编码嵌合抗原受体的第三序列，所述嵌合抗原受体包含能够结合CD19的抗原结合部分。

在另一方面，提供了一种工程化细胞，包含异源IL-15，其中所述异源IL-15是膜结合型IL-15，所述膜结合型IL-15包含与选自SEQ ID No.13-15和52-54中的任一种具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含：(1)与工程化NK细胞异源的分泌型IL-15；和(2)以下一种或更多种：(i)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体，其中该CD16变体是与该细胞异源的，或(ii)包含能够结合抗原的抗原结合部分的嵌合多肽受体，其中该抗原不是CD19，其中工程化细胞缺少异源IL-15R。在一些实施方案中，工程化NK细胞还包含编码分泌型IL-15的异源多核苷酸。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含CD16变体。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含嵌合多肽受体。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)CD16变体和(ii)嵌合多肽受体二者。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞还包含编码分泌型IL-15的异源多核苷酸。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，抗原包含选自由以下组成的组中的一个或更多个成员：BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、K、路易斯Y、NKG2D配体、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和gp100。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，抗原包含NKG2D配体，所述NKG2D配体选自由MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6组成的组。

在一方面，本公开提供了一种衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞的工程化NK细胞，其包含与工程化NK细胞异源的分泌型IL-15，其中工程化细胞缺乏异源IL-15R。在一些实施方案中，工程化NK细胞还包含编码分泌型IL-15的异源多核苷酸。

在一方面，本公开提供了工程化NK细胞，其包含与工程化NK细胞异源的膜结合型IL-15，其中工程化NK细胞还包含以下一种或更多种：(a)不是IL-15的异源细胞因子，(b)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性，其中内源免疫调节多肽不是B2M，或(c)安全开关(或诱导型细胞死亡部分)。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含不是IL-15的异源细胞因子。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源免疫调节多肽的降低的表达或活性，其中内源免疫调节多肽不是B2M。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，其中工程化NK细胞包含安全开关。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，其中工程化NK细胞包含(a)至(c)中的两个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，其中工程化NK细胞包含(a)至(c)。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，膜结合型IL-15是包含IL-15和IL-15R的至少一部分的嵌合膜受体的一部分。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合膜受体包含选自由以下组成的组中的序列：(i)SEQ ID NO.9的四个或更多个相邻重复、(ii)SEQ ID NO.10、(iii)SEQ ID NO.11、(iv)SEQ ID NO.9和SEQID NO.11的组合、(v)SEQ ID NO.12、(vi)SEQ ID NO.13和(vii)SEQ ID NO.14)。

在一个方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含用于在工程化NK细胞中增强的CD16信号传导的CD16变体，所述CD16变体包含CD16的至少一部分和CD64的至少一部分，其中所述工程化NK细胞表现出内源免疫调节多肽的降低表达或活性。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源IL-15或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞包含受体，所述受体包含异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含内源性IL-17信号传导的降低的活性，其中所述工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性IL-17或内源性IL-17R的减少的表达。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性IL-17和内源性IL-17R的减少的表达。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，内源性IL-17包含IL-17A。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，内源性IL-17包含IL-17F。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，内源性IL-17R包含IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD或IL-17RE。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，内源性IL-17R包含IL-17RA。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，与对照细胞相比，该工程化NK细胞表现出增强的NK细胞标志物的表达谱，而没有降低内源性IL-17的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，NK细胞标志物包含人CD57或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，与对照细胞相比，该工程化NK细胞在存在肿瘤细胞的情况下表现出增强的存活，而没有降低内源性IL-17信号传导的活性。

在一方面，本公开提供了包含异源STAT的工程化NK细胞，其中所述工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞还包含异源IL-15或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞还包含异源IL-15R或其片段。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，与没有异源STAT的对照细胞相比，该工程化NK细胞在存在肿瘤细胞的情况下表现出增强的存活。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源STAT包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B或STAT6。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源STAT包含STAT3。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源STAT包含STAT5B。

在一方面，本公开提供了工程化NK细胞，其包含(1)内源性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的降低的表达或活性和(2)以下中的一种或更多种：(a)包含能够与抗原结合的抗原结合部分的嵌合多肽受体，(b)异源细胞因子，(c)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体，其中CD16变体是与工程化NK细胞异源的，(d)异源免疫调节多肽，或(e)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含嵌合多肽受体。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源细胞因子。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含CD16变体。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源免疫调节多肽。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(a)至(e)中的两个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(a)至(e)中的三个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(a)至(e)中的四个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(a)至(e)全部。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，KIR包含KIR2D。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，KIR2D包含KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4或KIR2DS5。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，KIR包含KIR3D。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，KIR3D包含KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3或KIR3DS1。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含以下一种或更多种的降低的表达或活性：(i)内源性CD94、(ii)内源性CD96、(iii)内源性TGFβ受体、或(iv)内源性SHIP2，其中工程化细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性CD94的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性CD96的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性TGFβ受体的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性SHIP2的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(iv)中的两个或更多个的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(iv)中的三个或更多个的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(iv)的全部的降低的表达或活性。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含以下一种或更多种的降低的表达或活性：(i)内源性CD80、(ii)内源性CD86、(iii)内源性ICOSL、(iv)内源性CD40L、(v)内源性MICA或MICB、或(vi)内源性NKG2DL，其中工程化细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性CD80的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性CD86的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性ICOSL的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性CD40L的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性MICA或MICB的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含内源性NKG2D的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(vi)中的两个或更多个的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(vi)中的三个或更多个的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(vi)中的四个或更多个的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(vi)中的五个或更多个的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(vi)的降低的表达或活性。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含(1)内源性ICAM1的降低的表达或活性和(2)以下的一种或更多种：(a)包含能够与抗原结合的抗原结合部分的嵌合多肽受体，(b)异源细胞因子，或(c)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体，其中CD16变体是与工程化NK细胞异源的。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含嵌合多肽受体。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源细胞因子。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含CD16变体。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(a)至(c)中的两个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(a)至(c)的全部。

在一个方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含内源性ICAM1的降低的表达或活性，其中所述工程化细胞衍生自诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含以下一种或更多种：(i)异源PD-L2，或(ii)异源TGF-β。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源PD-L2。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源TGF-β。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)异源PD-L2和(ii)异源TGF-β。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含以下一种或更多种：(i)异源CCL21、(ii)异源IL-10、(iii)异源CD46、(iv)异源CD55、或(v)异源CD59，其中工程化细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源CCL21。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源IL-10。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源CD46。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源CD55。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源CD59。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(v)中的两个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(v)中的三个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(v)中的四个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含(i)至(v)的全部。

在一方面，本公开提供了一种衍生自诱导的干细胞的工程化NK细胞，其包含不是IL-15的异源细胞因子。在一些实施方案中，不是IL-15的异源细胞因子包含IL-21。

在一方面，本公开提供了一种衍生自诱导的干细胞的工程化NK细胞，其包含异源IL-21。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。

在一方面，本公开提供了一种工程化NK细胞，其包含嵌合多肽受体，所述嵌合多肽受体包含能够特异性结合CD38的抗原结合部分，其中工程化NK细胞衍生自分离的胚胎干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。

在一方面，本公开提供了工程化NK细胞，其包含嵌合多肽受体，所述嵌合多肽受体包含CD8跨膜结构域和以下中的一个或更多个：(i)2B4信号传导结构域和(ii)DAP10信号传导结构域。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含2B4信号传导结构域。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含DAP10信号传导结构域。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，所述嵌合多肽受体包含(i)2B4信号传导结构域和(ii)DAP10信号传导结构域。

在一方面，本公开提供了一种衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞的工程化NK细胞，其包含嵌合多肽受体，所述嵌合多肽受体包含以下一个或更多个：(i)CD8跨膜结构域、(ii)2B4信号传导结构域或(iii)DAP10信号传导结构域。在一些实施方案中，工程化NK细胞进一步包含(i)异源IL-15或其片段和/或(ii)异源IL-15R或其片段。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含CD8跨膜结构域。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含2B4信号传导结构域。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含DAP10信号传导结构域。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含(i)至(iii)中的两个或更多个。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体包含(i)至(iii)的全部。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞表现出内源性CD38的降低的表达或活性。或者，在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞的内源性CD38的表达或活性未被修改。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源IL-15或其片段由工程化NK细胞分泌。或者，在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源IL-15或其片段是膜结合的。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含嵌合多肽受体，所述嵌合多肽受体包含能够结合抗原的抗原结合部分。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含附加的嵌合多肽受体，所述附加的嵌合多肽受体包含能够与不同的抗原结合的抗原结合部分。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，嵌合多肽受体的抗原结合部分是能够与两种或更多种不同的抗原特异性结合的多特异性结合部分。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，抗原包含选自由以下组成的组中的一个或更多个成员：BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、K、路易斯Y、NKG2D配体、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和gp100。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，抗原包含选自由MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6组成的组中的NKG2D配体。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含能够引起工程化NK细胞死亡的安全开关。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，安全开关包含选自由胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶3、7或9)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、修饰的EGFR和B细胞CD20组成的组中的一个或更多个成员。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源细胞因子。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源细胞因子包含选自由IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21组成的组中的一个或更多个成员。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源细胞因子不是IL15。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含异源免疫调节多肽。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，异源免疫调节多肽包含选自由HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59组成的组中的一个或更多个成员。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，内源免疫调节多肽包含免疫检查点抑制剂或低免疫性调节剂。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含选自由PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、NKG2D、IT、CD96、LAG3、TIGIT、TGFβ受体和2B4组成的组中的一个或更多个成员。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含SHIP2。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，低免疫性调节剂包含选自由B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59组成的组中的一个或更多个成员。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，工程化NK细胞包含用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体，其中CD16变体是与工程化NK细胞异源的。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，CD16变体包含选自由SEQ IDNO.1-8组成的组中的序列。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化NK细胞对靶细胞表现出增强的细胞毒性。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化NK细胞在宿主细胞中诱导降低的免疫应答。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，分离的干细胞包含胚胎干细胞。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，诱导的干细胞包含诱导的多能干细胞。

在一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括：(1)从对象获得细胞；和(2)从细胞中产生本文公开的任何一种工程化NK细胞的对象工程化NK细胞。

在一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括向有需要的对象施用NK细胞群体，所述NK细胞群体包含本文公开的任何一种工程化NK细胞的对象工程化NK细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括向对象施用单独的治疗剂。在一些实施方案中，单独的治疗剂是化学治疗剂。

在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文公开的任何一种工程化NK细胞的对象工程化NK细胞。

在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含：(1)工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含一个或更多个成员，所述成员包含(i)异源IL-15或其片段、(ii)与对照细胞相比用于增强的CD16信号传导的CD16变体，其中CD16变体是与工程化免疫细胞异源的，或(iii)包含能够结合抗原的抗原结合部分的嵌合多肽受体；和(2)能够与CD20结合的单独的治疗剂。在一些实施方案中，工程化NK细胞衍生自分离的干细胞或诱导的干细胞。在一些实施方案中，分离的干细胞包含胚胎干细胞。在一些实施方案中，诱导的干细胞包含诱导的多能干细胞。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含异源IL-15。在一些实施方案中，异源IL-15或其片段由工程化NK细胞分泌。在一些实施方案中，异源IL-15或其片段是膜结合的。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含CD16变体。在一些实施方案中，CD16变体包含选自由SEQ ID NO.1-8组成的组中的序列。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含嵌合多肽受体。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含(i)至(iii)中的两个或更多个。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含(i)至(iii)。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含工程化NK细胞。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化免疫细胞包含工程化T细胞。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞表现出内源性CD38的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞的内源性CD38的表达或活性未被修改。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，嵌合多肽受体的抗原结合部分是能够与两种或更多种不同的抗原特异性结合的多特异性结合部分。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，抗原包含选自由以下组成的组中的一个或更多个成员：BCMA、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、K、路易斯Y、NKG2D配体、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和gp100。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，抗原包含选自由MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6组成的组中的NKG2D配体。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞还包含能够引起工程化NK细胞死亡的安全开关。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，安全开关包含选自由胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶3、7或9)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、修饰的EGFR和B细胞CD20组成的组中的一个或更多个成员。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞还包含异源细胞因子。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，异源细胞因子包含选自由IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21组成的组中的一个或更多个成员。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，异源细胞因子不是IL15。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞还包含异源免疫调节多肽。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，异源免疫调节多肽包含选自由HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59组成的组中的一个或更多个成员。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，内源免疫调节多肽包含免疫检查点抑制剂或低免疫性调节剂。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含选自由PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、NKG2D、IT、CD96、LAG3、TIGIT、TGFβ受体和2B4组成的组中的一个或更多个成员。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含SHIP2。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，低免疫性调节剂包含选自由B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59组成的组中的一个或更多个成员。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化NK细胞对靶细胞表现出增强的细胞毒性。在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化NK细胞在宿主细胞中诱导降低的免疫应答。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞。

在本文公开的任何一种组合物的一些实施方案中，工程化NK细胞还包含受体，所述受体包含异源IL-15R或其片段。

在一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括：向有需要的对象施用本文公开的任何一种组合物的主题组合物。在一些实施方案中，单独的治疗剂包括化学治疗剂。

从以下详细说明中，本公开的其它方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将认识到的，本公开能够具有其它不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，应该认为附图和说明都是示例性的，而不是限制性的。

援引加入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。在通过援引并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相抵触的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类相抵触的材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用了本发明的原理的说明性实施方案以及附图(在此也称为“图”)的详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点，附图中：

图1A-1G示出了工程化NK细胞，其包含用于增强的CD16信号传导的CD16变体；

图2A-2G示出了工程化NK细胞，其包含针对CD19的嵌合抗原受体；和

图3A和3B示出了包含异源人IL-15的工程化T细胞。

图4A-4C示出了aCD19-CAR、hnCD16和IL-15RF的设计。

图5A-5B示出了NK-019构建体和表达NK-019构建体的工程化NK细胞的设计；

图6A-6C示出了由aCD19-CAR赋予的增强的NK细胞活性；

图7A-7C示出了由hnCD16赋予的增强的ADCC；

图8A-8B示出了由IL-15-RF赋予的增强的IL-15信号传导；

图9示出了在NK92细胞中NK-019构建体的表达；

图10示出了NK-019NK92细胞对K562-CD19细胞的CD19特异性细胞溶解能力；

图11A示出了在人CD19+刺激后在NK-019NK92细胞中增强的CD107a表达，图11B示出了在人CD19+刺激后由NK-019Nk92细胞增强的干扰素-γ产生；

图12A-12C示出了Raji-NCG小鼠模型中NK-019NK92细胞的抗肿瘤活性；

图13A-13B示出了在iPSC中NK-019构建体的表达；和

图14A-14B示出了NK-019iPSC分化为NK-019iNK细胞。

图15示出了OI42(QN-019a)转导的细胞的分化和扩增。

图16A-16C示出了OI42(QN-019a)NK细胞在Raji和Nalm6细胞中的抗肿瘤活性。

图17示出了hnCD16在OI42(QN-019a)细胞上的稳定表达。

图18A-18B示出了在OI42(QN-019a)细胞中用IL-15RF激活STAT5信号传导通路。

图19A-19B示出了OI42(QN-019a)细胞对Nalm6细胞的单次和连续杀伤活性。

图20A-20B示出了OI42(QN-019a)细胞对Raji细胞的单次和连续杀伤活性。

图21A-21C示出了OI42(QN-019a)细胞在Nalm6 NOG肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性。

图22示出了OI42(QN-019a)细胞的核型。

图23示出了hnCD19在KB15细胞上的稳定表达。

图24示出了KB15 NK细胞在Raji细胞中的抗肿瘤活性。

图25A-25B示出了在KB15 NK细胞中用IL-15RF启动STAT5信号传导通路。

图26A-26C示出了KB15细胞在Raji肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性。

图27示出了KB15细胞的核型。

图28示出了KB15 NK细胞在有或没有外源IL-2的情况下的体外生长。

图29A-29B示出了KB15 NK细胞在裸鼠中的致瘤性。

具体实施方式

虽然本文已经示出并描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员而言明显的是，这些实施方案仅以实施例的方式提供。在不脱离本发明内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。

如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一”(“a”)、“一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“嵌合跨膜受体”包括多个嵌合跨膜受体。

术语“约”或“大约”一般意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分地取决于该值是如何测量或测定的，即，测量系统的限制。例如，根据本领域中的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。可替代地，“约”可以表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，该术语可表示数值的一个数量级内，优选地在值的5倍之内，更优选地在值的2倍之内。在本申请和权利要求书中描述了特定值之处，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示在该特定值可接受的误差范围内。

替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案之一、两者或其任何组合。术语“和/或”应该被理解为是指替代方案之一或两者。

术语“细胞”通常是指生物细胞。细胞可以是活生物体的基本结构性、功能性和/或生物学单元。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实施例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、蕃茄、稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类、石松类、角苔、苔类、藓类的细胞)、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Nannochloropsis gaditana、淀粉核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(Sargassum patens)C.Agardh等)、海藻(例如海带)、真菌细胞(例如酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人类等)的细胞，等等。有时，细胞并非源自天然生物体(例如，细胞可以是合成制备的，有时也称为人造细胞)。

如本文中可互换使用的，术语“重程序设计”、“去分化”、“增加细胞潜能”或“增加发育潜能”通常是指增加细胞潜能或使细胞去分化至较低分化状态的方法。例如，与处于非重程序设计状态的相同细胞相比，具有增加的细胞潜能的细胞具有更多的发育可塑性(即，可以分化成更多的细胞类型)。换言之，重程序设计的细胞是比处于非重程序设计状态的相同细胞更低的分化状态的细胞。

术语“分化”通常是指这样的过程，通过该过程，非特化的(“未定型的”)或更少特化的细胞获得特化细胞(例如，免疫细胞)的特征。分化或分化诱导的细胞是在细胞谱系中占据更多特化的(“定型的”)位置的细胞。术语“定型的”通常是指在分化途径中已进行到某点的细胞，在该点处，在正常情况下该细胞将继续分化为特定细胞类型或细胞类型亚类并且在正常情况下不能分化为不同细胞类型或还原为分化程度较低的细胞类型。

术语“多能的”通常是指细胞形成主体或体细胞(即，胚体)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种多能干细胞，其能够从三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)中的每一个形成细胞。多能性可以是发育潜能的连续体，范围从不完全或部分地多能的细胞(例如外胚层干细胞)(其不能产生完整的生物体)到更原始、更多能的细胞(其能够产生完整的生物体(例如胚胎干细胞))。

术语“诱导的多能干细胞”(iPSC)通常是指衍生自分化的细胞(例如，分化的成人、新生儿或胎儿细胞)的干细胞，该分化的细胞已被诱导或改变(即，重程序设计)为能够分化为所有三个胚层或真皮层(中胚层、内胚层和外胚层)的组织的细胞。产生的iPSC并不指自然界中发现的细胞。在一些情况下，可以将iPSC工程化以直接分化为定型细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞)。在一些情况下，可以将iPSC工程化以首先分化为组织特异性干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，然后可以将其进一步诱导以分化为定型细胞(例如NK细胞)。

术语“胚胎干细胞”(ESC)通常是指胚胎囊胚的内部细胞团块的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的，在发育过程中产生三个主要胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的所有衍生物。在一些情况下，可以将ESC工程化以直接分化为定型细胞(例如NK细胞)。在一些情况下，可以将ESC工程化以首先分化为组织特异性干细胞(例如，HSC)，然后可以将其进一步诱导以分化为定型细胞(例如NK细胞)。

术语“分离的干细胞”通常是指从多细胞生物中分离的本文公开的任何类型的干细胞(例如，ESC、HSC、间充质干细胞(MSC)等)。例如，HSC可以从哺乳动物的身体(例如人体)中分离出来。在另一个实例中，可以从胚胎中分离出胚胎干细胞。

术语“分离的”通常是指已经与其原始环境分离的细胞或细胞群。例如，分离的细胞的新环境基本上不含有在“未分离的”参考细胞存在的环境中发现的至少一种组分。分离的细胞可以是从其自然环境中发现的某些或所有组分中去除的细胞，例如从组织或活检样品中分离出来的细胞。该术语还包括从非天然存在的环境中发现的细胞中除去的至少一种、一些或所有组分的细胞，例如从细胞培养物或细胞悬液中分离出来的细胞。因此，分离的细胞是从在自然界中发现的或在非天然存在的环境中生长、储存或生存的至少一种组分(包括其它物质、细胞或细胞群)部分地或完全地分离的。

如本文可互换使用的，术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前体细胞”通常是指细胞，其定型成造血谱系但能够进一步造血分化(例如分化为NK细胞)，并且包括多能造血干细胞(成血细胞)、髓系祖细胞、巨核系祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是多能干细胞，其可产生所有血细胞类型，包括髓系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。在一些情况下，HSC可以是CD34+造血细胞，其能够产生成熟的髓系和淋巴样细胞类型，包括T细胞、NK细胞和B细胞。

术语“免疫细胞”通常是指分化的造血细胞。免疫细胞的非限制性实施例可以包括NK细胞、T细胞、单核细胞、先天淋巴细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。

术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”通常是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺失所定义的外周血淋巴细胞的亚类。在一些情况下，NK细胞，在表型上为CD3-和CD56+，表达NKG2C和CD57中的至少一种(例如，NKG2C、CD57或二者以相同或不同的程度)，并任选地表达CD16，但缺乏以下中的一种或多种的表达：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些情况下，分离的CD56+NK细胞的亚群可表现出CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、活化和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。

如本文所用的，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸的组合。核苷酸可以包括合成核苷酸。核苷酸可以包括合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸(三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP))，和脱氧核糖核苷三磷酸，例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可以包括，例如，[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP及核苷酸衍生物，其赋予含有它们的核酸分子核酸酶抗性。如本文所用的术语核苷酸可表示双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性实施例可以包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过众所周知的技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测的标记可以包括例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4′二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、级联蓝、俄勒冈绿、得克萨斯红、花菁和5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体实施例可以包括可得自Perkin Elmer,Foster City,Calif.的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP；可得自Amersham,Arlington Heights,Ill.的FluoroLink脱氧核苷酸、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLinkCy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；可得自Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2′-dATP；和可得自Molecular Probes,Eugene,Oreg.的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、级联蓝-7-UTP、级联蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、得克萨斯红-5-UTP、得克萨斯红-5-dUTP和得克萨斯红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰来标记或标示。化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化的dNTP的一些非限制性实施例可以包括生物素-dATP(例如，bio-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核酸”在本文中可互换地使用，通常是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物，无论是单链、双链还是多链形式。多核苷酸对于细胞而言可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞的环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以行使已知或未知的任何功能。多核苷酸可以包括一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后赋予。类似物的一些非限制性实施例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、蛹虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如与糖连接的罗丹明或荧光素)、含巯基的核苷酸、与生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性实施例包括基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析定义的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)在内的无细胞多核苷酸、核酸探针以及引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。

术语“基因”通常是指涉及编码RNA转录物的核酸(例如，DNA诸如基因组的DNA和cDNA)及其相应的核苷酸序列。如本文关于基因组DNA所使用的，该术语包括间插的非编码区以及调节区，并且可以包括5'和3'末端。在一些用途中，该术语涵盖转录的序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录的区域将包括编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包括编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转运RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录的序列，而且还包括非转录的区域，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。基因可以指在生物体基因组中在其天然位置的“内源基因”或天然基因。基因可以是指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以是指通常不存在于宿主生物体中但通过基因转移而引入该宿主生物体中的基因。非天然基因也可以是指不在生物体基因组中在其天然位置的基因。非天然基因还可以是指包括突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。

术语“表达”通常是指一种或多种过程，通过该过程多核苷酸从DNA模板被转录(例如，转录成mRNA或其它RNA转录物)和/或经转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中的mRNA的剪接。关于表达，“上调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达水平，多核苷酸(例如，RNA诸如mRNA)和/或多肽序列的升高的表达水平，而“下调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达，多核苷酸(例如，RNA诸如mRNA)和/或多肽序列的降低的表达水平。转染的基因的表达可以在细胞中瞬时或稳定地发生。在“瞬时表达”过程中，转染的基因在细胞分裂过程中不会转移至子细胞。由于其表达仅限于转染的细胞，因此基因的表达会随时间而丧失。相反，当基因与赋予转染的细胞选择优势的另一基因共转染时，可以发生转染的基因的稳定表达。这样的选择优势可以是对呈现给细胞的某种毒素的抗性。

如本文可互换使用的，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”通常是指通过(多个)肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。该术语不表示聚合物的特定长度，也不旨在暗示或区分该肽是使用重组技术、化学或酶促合成产生的还是天然存在的。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及包括至少一种修饰的氨基酸的氨基酸聚合物。在一些情况下，聚合物可能会被非氨基酸中断。该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，以及具有或不具有二级和/或三级结构(例如结构域)的蛋白质。该术语还涵盖已经例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其它操作(例如与标记组分共轭)而被修饰的氨基酸聚合物。本文所使用的，术语“氨基酸”通常是指天然和非天然氨基酸，包括但不限于修饰的氨基酸和氨基酸类似物。修饰的氨基酸可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸(它们已被化学修饰为包括非天然存在于氨基酸上的基团或化学部分)。氨基酸类似物可以是指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸二者。

如本文中针对多肽所使用的，术语“衍生物”、“变体”或“片段”通常是指例如通过氨基酸序列、结构(例如，二级和/或三级)、活性(例如，酶活性)和/或功能与野生型多肽相关的多肽。与野生型多肽相比，多肽的衍生物、变体和片段可以包括一种或多种氨基酸变化(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或其组合。

如本文关于多肽分子(例如，蛋白质)所使用的，术语“工程化”、“嵌合的”或“重组的”通常是指由于基因工程化技术应用于编码多肽分子的核酸以及表达该多肽分子的细胞或生物体而具有异源氨基酸序列或改变的氨基酸序列的多肽分子。如本文关于多核苷酸分子(例如，DNA或RNA分子)使用的，术语“工程化”或“重组”通常是指由于应用基因工程化技术而具有异源核酸序列或改变的核酸序列的多核苷酸分子。基因工程化技术包括但不限于PCR和DNA克隆技术；转染、转化和其它基因转移技术；同源重组；定点诱变；和基因融合。在一些情况下，工程化的或重组的多核苷酸(例如，基因组DNA序列)可以被基因编辑部分修饰或改变。

术语“基因编辑部分”通常是指可以编辑核酸序列的部分，无论对于包括该核酸序列的细胞是外源的还是内源的。在一些实施方案中，基因编辑部分通过编辑核酸序列而调节基因的表达。在一些情况下，基因编辑部分可以通过编辑基因组DNA序列来调节基因的表达。在一些情况下，基因编辑部分可以通过编辑mRNA模板来调节基因的表达。在一些情况下，编辑核酸序列可以改变基因表达的基础模板。

可替代地或附加地，基因编辑部分可以能够通过与可操作地偶联至该基因的靶序列(或该基因内的靶序列)特异性结合，并调节由DNA(例如染色体DNA或cDNA)产生mRNA，来调节基因的表达或活性。在一些情况下，基因编辑部分可以募集或包含至少一种转录因子，其与特定DNA序列结合，从而控制遗传信息从DNA到mRNA的转录速率。基因编辑部分本身可以与DNA结合并通过物理障碍而调节转录，例如防止蛋白质(例如RNA聚合酶)和其它相关蛋白质组装在DNA模板上。基因编辑部分可以在翻译水平上调节基因的表达，例如，通过调节由mRNA模板产生蛋白质。在一些情况下，基因编辑部分可以通过影响mRNA转录物的稳定性来调节基因表达。

术语“抗体”通常是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)，以及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(例如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。其衍生物、变体或片段可以是指保留相应抗体的(例如，完全和/或部分)结合特异性的功能性衍生物或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、微抗体(minibody)、双抗体(diabody)和单域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼科抗体”)。术语抗体包括已经过优化、工程化或化学共轭的抗体和抗体的抗原结合片段。已优化的抗体的实施例包括亲和力成熟的抗体。已工程化的抗体的实施例包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。

术语“嵌合多肽受体”通常是指包括一个或多个抗原结合部分的非天然多肽受体，每个抗原结合部分能够结合特定抗原。嵌合多肽受体可以是单特异性的(即，能够结合一种类型的特异性抗原)。可替代地，嵌合多肽受体可以是多特异性的(即，能够结合两种或更多种不同类型的特异性抗原)。嵌合多肽受体可以是单价的(即，包括单个抗原结合部分)。可替代地，嵌合多肽受体可以是多价的(即，包括多个抗原结合部分)。在一些情况下，嵌合多肽受体可以包括T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)或嵌合抗原受体(CAR)。

术语“抗原结合结构域”通常是指表现出优先结合特定靶抗原的构建体。抗原结合结构域可以是多肽构建体，例如抗体、其修饰、其片段或其组合。抗原结合结构域可以是本文公开的任何抗体或其功能变体。抗原结合结构域的非限制性实施例可以包括鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、鲨鱼仅重链抗体(shark heavy-chain-only antibody，VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体，或其抗体片段。抗体片段的非限制性实施例包括Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、单链抗原结合片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定化的Fv(dsFv)、微抗体、双抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、单结构域抗原结合片段(sdAb、纳米抗体)、重组仅重链抗体(VHH)和维持整个抗体结合特异性的其它抗体片段。

术语“安全开关”通常是指经工程化的多肽构建体，其被设计用于预防细胞疗法的潜在毒性或其它不利影响。当在细胞中表达时，安全开关可以诱导宿主细胞死亡，从而使宿主中(例如，对象体内)细胞的活性失活。因此，安全开关可以是自杀部分。在一些情况下，可以对细胞进行程序设计以在其生命周期的某个阶段(例如，按时间程序设计)表达自杀部分。在一些情况下，细胞中自杀部分的表达可以是有条件的或可诱导的。在一些实例中，自杀部分的有条件调节(例如，表达)可以包括通过小分子介导的翻译后激活以及组织特异性和/或时序转录调节进行控制。因此，安全开关可以是可诱导的自杀部分。安全开关可以介导对凋亡的诱导、对蛋白合成的抑制、DNA复制、生长停滞、转录和转录后遗传调控和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关可以由外源分子(例如，药物或前药)启动，该安全开关在被启动时触发细胞(例如，本文公开的工程化NK细胞)的凋亡和/或细胞死亡。

术语“免疫调节多肽”通常是指能够调节或控制免疫细胞(例如NK细胞)的一种或多种属性的多肽构建体(例如，蛋白质、抗体、膜结合多肽、分泌多肽、可切割的多肽、不可切割的多肽等)。免疫细胞的一种或多种属性可以包括免疫细胞的分化、免疫细胞形态、免疫细胞内多核苷酸或多肽构建体的表达，或免疫细胞的活性(例如，工程化NK细胞对病变细胞(例如癌细胞)的细胞毒活性)。免疫调节多肽可以是宿主细胞内源的。可替代地或附加地，免疫调节多肽可以是与宿主细胞异源的。在一些情况下，可以通过下调免疫调节多肽的表达(例如抑制、敲低或敲除)来介导对免疫细胞的一种或多种属性的控制。可替代地或附加地，可以通过上调免疫调节多肽的表达(例如，内源基因的上调或编码免疫调节多肽的异源基因的敲入)来介导对免疫细胞的一种或多种属性的控制。在另一替代方案中或附加地，控制免疫细胞的一种或多种属性可以通过维持免疫调节多肽的表达比宿主细胞中免疫调节多肽的天然或正常表达谱更长的一段时间来介导。在一些情况下，免疫调节多肽可以包括低免疫性调节剂。在一些情况下，免疫调节多肽可以包括免疫检查点抑制剂。

术语“低免疫性调节剂”通常是指细胞中的多肽构建体，其中细胞中的低免疫性调节剂的增强的表达(例如，通过异源基因的敲入)或降低的表达(例如，通过内源基因的敲除或敲低)可以帮助细胞减少或避免在施用于宿主身体后来自宿主身体的免疫应答(例如，免疫攻击，例如适应性免疫排斥)。在一些情况下，可以修饰细胞(例如，本文公开的工程化NK细胞)以表现出低免疫性调节剂的增强的表达或降低的表达，以便细胞可以在将细胞第二次或进一步输注入宿主(即，受体)时可以逃避宿主免疫攻击。因此，与没有低免疫性调节剂的增强的表达或降低的表达的对照细胞相比，该细胞(i)不会被宿主的免疫系统排斥和/或(ii)将被宿主的免疫系统以较慢的速率排斥。表现出低免疫性调节剂的增强的表达或降低的表达的细胞可以被称为表现出“低免疫性”或“免疫豁免”。

术语“免疫检查点抑制剂”通常是指存在于免疫细胞(例如，T细胞、髓样细胞、NK细胞、B细胞等)的细胞表面上的一组分子，其可以通过下调或抑制免疫细胞对靶细胞诸如癌细胞的免疫应答(即，抗癌或抗肿瘤免疫应答)来调节细胞的免疫应答。靶细胞可以表达存在于免疫细胞表面上的免疫检查点抑制剂的受体或配体，以与免疫检查点抑制剂接合并下调或抑制免疫细胞对靶细胞的免疫应答。因此，在一些情况下，下调或抑制免疫检查点抑制剂在免疫细胞中的表达可以增强或延长免疫细胞对靶细胞的免疫应答。

术语“免疫应答”通常是指从宿主的免疫系统对物体(例如异物)的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。免疫应答的实施例包括T细胞应答，例如细胞因子的产生和细胞的细胞毒性。在一些情况下，免疫应答可以通过T细胞激活，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答细胞例如巨噬细胞的激活而间接地实现。

术语“增强的表达”、“增加的表达”或“上调的表达”通常是指感兴趣部分(例如，多核苷酸或多肽)的产生达到高于宿主株(例如宿主细胞)中该感兴趣部分的正常表达水平的水平。正常表达水平可以基本上为零(或为空值)或高于零。感兴趣部分可以包括宿主株的内源基因或多肽构建体。感兴趣部分可以包括引入到宿主株或引入宿主株中的异源基因或多肽构建体。例如，可以将编码感兴趣多肽的异源基因敲入(KI)到宿主株的基因组中用于宿主株中该感兴趣多肽的增强的表达。

术语“增强的活性”、“增加的活性”或“上调的活性”通常是指经修饰感兴趣部分(例如，多核苷酸或多肽)的活性达到高于宿主株(例如宿主细胞)中该感兴趣部分的正常活性水平的水平。正常活性水平可以基本上为零(或为空值)或高于零。感兴趣部分可以包括宿主株的多肽构建体。感兴趣部分可以包括引入到宿主株或引入宿主株中的异源多肽构建体。例如，可以将编码感兴趣多肽的异源基因敲入(KI)到宿主株的基因组中用于宿主株中感兴趣多肽的增强的活性。

术语“降低的表达”、“减少的表达”或“下调的表达”通常是指感兴趣部分(例如，多核苷酸或多肽)的产生达到低于宿主株(例如宿主细胞)中该感兴趣部分的正常表达水平的水平。正常表达水平高于零。感兴趣部分可以包括宿主株的内源基因或多肽构建体。在一些情况下，感兴趣部分可以在宿主株中被敲除或敲低。在一些实例中，感兴趣部分的降低的表达可以包括在宿主株中完全抑制这种表达。

术语“降低的活性”、“减少的活性”或“下调的活性”通常是指经修饰感兴趣部分(例如，多核苷酸或多肽)的活性达到低于宿主株(例如宿主细胞)中该感兴趣部分的正常活性水平的水平。正常活性水平高于零。感兴趣部分可以包括宿主株的内源基因或多肽构建体。在一些情况下，感兴趣部分可以在宿主株中被敲除或敲低。在一些实例中，感兴趣部分的降低的活性可以包括在宿主株中完全抑制这种活性。

如本文可互换使用的，术语“对象”、“个体”或“患者”通常是指脊椎动物，优选为哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。还包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。

术语“疗法”或“治疗”通常是指获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群体。治疗益处是指对一种或多种受治疗的疾病、病况或症状的任何治疗上相关的改善或效果。为了预防益处，可以将组合物施用于有发生特定疾病、病况或症状的风险的对象，或施用于报告疾病的一种或多种生理症状的对象，即使该疾病、病况或症状可能尚未显现。

术语“有效量”或“治疗有效量”通常是指组合物的量，例如包括含有本公开的系统的免疫细胞例如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物的量，该量足以在施用于有需要的对象时产生所需的活性。在本公开的上下文中，术语“治疗有效的”通常是指组合物的量足以使通过本公开的方法治疗的病症的至少一种症状得以延迟表现、阻止进展、缓解或减轻。

A.概述

T细胞是适应性免疫系统的部分，并且可以被致敏而通过识别外来细胞表面的免疫蛋白(即抗原)来识别特定威胁。相反，NK细胞是先天免疫应答的部分，并可以响应于被认为是“非自我”的各种物体。通常，与T细胞不同，NK细胞可以攻击它们的靶细胞而无需敏化(即，抗原特异性致敏)以消除异物。

衍生自对象(例如，衍生自对象的HSC)的未修饰的NK细胞可以被离体培养和扩增，然后施用给对象作为攻击其靶细胞(例如癌细胞)的治疗。然而，由于NK细胞的离体或体内半衰期短和/或增殖不良，因此可能限制基于NK细胞的疗法。此外，未修饰的NK细胞可能无法有效靶向更难治疗的癌症，例如骨髓瘤或实体瘤。此外，基于血液来源的干细胞(例如，HSC)的NK细胞的离体生产可产生的NK细胞供应对于有效的过继免疫疗法是有限的。

因此，对于有来源且工程化以表现出例如增强的增殖、半衰期和针对靶细胞的细胞毒性活性的NK细胞，仍然存在大量未满足的需求。

B.工程化免疫细胞

本公开描述了用于免疫疗法的系统和方法。与对照细胞(例如，非工程化免疫细胞)相比，免疫细胞可以被工程化以表现出提高的半衰期。与对照细胞相比，免疫细胞可以被工程化以表现出增强的增殖。免疫细胞可以被工程化以有效和特异性地靶向病变细胞(例如癌细胞)，而该病变细胞是对照细胞不足以或无法靶向的。本文公开的工程化免疫细胞可以进行离体工程化、体外工程化和在一些情况下的体内工程化。可以将离体或体外制备的工程化免疫细胞施用给有需要的对象以治疗疾病(例如，骨髓瘤或实体瘤)。工程化免疫细胞对于对象可以是自体的。可替代地，工程化免疫细胞对于对象可以是同种异体的。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)可以衍生自分离的干细胞(例如分离的ESC)。在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

在一些情况下，本文公开的干细胞(例如，分离的干细胞、诱导的干细胞)可以是自体细胞或衍生自自体细胞。自体细胞可以得自患有病况或怀疑患有该病况的对象。可替代地，可以在发现对象患有该病况之前从该对象获得自体细胞。在一些情况下，自体细胞可以是同种异体细胞，例如具有降低的免疫原性、减少的数量或不需要免疫抑制药物的通用干细胞。自体细胞可获自健康供体。

在一些情况下，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以是自体细胞。工程化免疫细胞可以得自患有病况或怀疑患有该病况的对象。可替代地，可以在发现对象患有该病况之前从该对象获得工程化免疫细胞。在一些情况下，工程化免疫细胞可以是同种异体细胞，例如用于具有降低的免疫原性且需要减少量的或不需要免疫抑制药物的通用同种异体免疫疗法。工程化免疫细胞可获自健康供体。

在一些方面，与对照细胞(例如，非工程化T细胞)相比，T细胞可以被工程化以表现出提高的半衰期。与对照细胞相比，T细胞可以被工程化以表现出增强的增殖。T细胞可以被工程化以有效和特异性地靶向病变细胞(例如癌细胞)，而该病变细胞是对照细胞不足以或无法靶向的。本文公开的工程化T细胞可以进行离体工程化、体外工程化和在一些情况下的体内工程化。可以将离体或体外制备的工程化T细胞施用给有需要的对象以治疗疾病(例如，骨髓瘤或实体瘤)。工程化T细胞对于对象可以是自体的。可替代地，工程化免疫细胞对于对象可以是同种异体的。

在一些方面，与对照细胞(例如，非工程化NK细胞)相比，可以将NK细胞工程化以表现出延长的半衰期。与对照细胞相比，可以将NK细胞工程化以表现出增强的增殖。可以将NK细胞工程化以有效和特异性地靶向病变细胞(例如癌细胞)，而该病变细胞是对照细胞不足以或无法靶向的。本文公开的工程化NK细胞可以进行离体工程化、体外工程化和在一些情况下的体内工程化。可以将离体或体外制备的工程化NK细胞施用给有需要的对象以治疗疾病(例如，骨髓瘤或实体瘤)。工程化NK细胞对于对象可以是自体的。可替代地，工程化NK细胞对于对象可以是同种异体的。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含与免疫细胞异源的细胞因子(例如，分泌型细胞因子)。在一些情况下，异源细胞因子可包含异源白介素(IL)(例如，异源分泌型IL-15)。工程化免疫细胞可以进一步包含以下一项或两项：(i)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体和(ii)包含能够结合抗原的抗原结合部分的嵌合多肽受体。在一些实例中，抗原不是CD19。因此，抗原结合部分可以不表现出并且不需要表现出与CD19的任何特异性结合，而是与非CD19的抗原(例如一种或更多种抗原)的特异性结合。

在另一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含与免疫细胞异源的细胞因子(例如，分泌型细胞因子)。在一些情况下，异源细胞因子可包含异源白介素(IL)(例如，异源分泌型IL-15)。工程化免疫细胞可以进一步包含以下一项或两项：(i)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体和(ii)包含能够结合CD19的抗原结合部分的嵌合多肽受体。在一些实施方案中，异源细胞因子可以包括IL-15。在一些情况下，异源IL-15可以包含SEQ ID NO.53的氨基酸序列。

本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可包含异源受体，其是本文公开的异源细胞因子的相应受体(例如，用于异源IL-15的异源IL-15受体(IL-15R，例如IL-15α或IL-15β))。在一些实施方案中，异源受体可以是IL-15Rα。在一些情况下，异源IL-15Rα可以包含SEQ ID NO.54的氨基酸序列。

在一些实施方案中，异源受体可以是IL-15-IL-15Rα融合物。在一些情况下，异源IL-15-IL-15Rα融合物可以包含SEQ ID NO.52的氨基酸序列。或者，工程化免疫细胞可以不并且不需要包含作为异源细胞因子的相应受体的任何异源受体。例如，包含异源IL(例如，IL-15)的工程化免疫细胞缺乏异源IL(例如，IL-15R)的异源受体。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含与免疫细胞异源的细胞因子(例如，分泌型细胞因子)。异源细胞因子还可包含异源白介素(IL)(例如，异源分泌型IL-15)。工程化免疫细胞可以并且不需要包含作为异源细胞因子的相应受体的异源受体(例如，异源IL-15R)。

本文所公开的异源细胞因子(例如异源IL)可以与工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)属于相同的物种。例如，异源细胞因子和工程化免疫细胞两者可以是人类来源的。或者，异源细胞因子可以与工程化免疫细胞属于不同的物种。

可以通过使编码异源细胞因子的异源多核苷酸与工程化免疫细胞接触，而将本文公开的异源细胞因子(例如异源IL)引入工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)。异源多核苷酸可以被整合到工程化免疫细胞的染色体(例如核染色体)中。或者，异源多核苷酸可以不并且不需要被整合到工程化免疫细胞的染色体中。在一个实例中，可以将编码异源细胞因子的mRNA引入(或插入)工程化免疫细胞中。在一些实施方案中，对异源多核苷酸进行密码子优化以改善异源细胞因子的表达。

在一些情况下，本文公开的异源细胞因子可以是异源IL。本文公开的异源IL可包含至少1、2、3、4、5或更多种不同类型的异源IL。本文公开的异源IL可包含至多5、4、3或2种不同类型的异源IL。或者，异源IL可以是单一类型的异源IL。异源IL的非限制性实例可包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。在一些实例中，异源IL可包含选自由IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21及其功能修饰组成的组中的一个或更多个成员。例如，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可包含异源人IL-15(或其编码基因)的至少一部分。

在一些情况下，异源细胞因子是膜结合型IL-15，其包含IL-15和IL-15R的至少一部分。在一些实施方案中，膜结合型IL-15的IL-15和IL-15R的至少一部分通过接头连接。膜结合型IL-15中可以使用本领域已知的任何合适的接头。在一些实施方案中，接头选自由(GGGGS)n、(EGKSSGSGSESKST)n和(EGKSSGSGSESKST)n(GGGGS)n组成的组，并且n可以是选自1-10的任何整数。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)n，并且n可以是选自1-10的任何整数。在一些实施方案中，接头选自GGGGS、(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)5或(GGGGS)6。在一些实施方案中，接头是(EGKSSGSGSESKST)n，并且n可以是选自1-10的任何整数。在一些实施方案中，接头选自由EGKSSGSGSESKST、(EGKSSGSGSESKST)2或(EGKSSGSGSESKST)3组成的组。在一些实施方案中，接头是(EGKSSGSGSESKST)n(GGGGS)n，并且n可以是选自1-10的任何整数。在一些实施方案中，接头是EGKSSGSGSESKSTGGGGS或(EGKSSGSGSESKST)2GGGGS。在一些实施方案中，接头包含选自SEQ IDNo.18-20和55-60的氨基酸序列。

在一些实施方案中，膜结合型IL-15还包含细胞内信号传导结构域。本领域已知的任何合适的细胞内信号传导结构域均可用于本申请的膜结合型IL-15。在一些实施方案中，膜结合型IL-15包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO.21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，膜结合的IL-15包含SEQ ID NO.21的氨基酸序列。

在一些实施方案中，膜结合型IL-15还包含细胞外信号肽。本领域已知的任何合适的细胞外信号肽均可用于本申请的膜结合型IL-15。在一些实施方案中，膜结合型IL-15包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO.22具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，膜结合的IL-15包含SEQ ID NO.22的氨基酸序列。

在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，膜结合型IL-15包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选自SEQ ID NO.13-15和52-54中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在本文公开的任何一种工程化NK细胞的一些实施方案中，膜结合型IL-15包含选自SEQ ID NO.13-15和52-54中的任一个的氨基酸序列。

本文公开的异源细胞因子(例如异源IL)可以是分泌型细胞因子。或者，异源细胞因子可以不并且不需要由工程化免疫细胞分泌。在这种情况下，例如，异源细胞因子可以结合到工程化免疫细胞的细胞表面。

在一些情况下，本文公开的异源细胞因子(例如异源IL)可以是分泌型细胞因子。可以将编码异源细胞因子的表达盒引入工程化免疫细胞中。表达盒可以进一步编码另外的异源多肽，例如异源受体。在表达盒内，编码异源细胞因子的第一多核苷酸序列和编码另外的异源多肽(例如，异源受体)的第二多核苷酸序列可以通过编码切割接头的多核苷酸接头而彼此偶联。在一些实例中，异源受体可以是异源细胞因子(例如，异源IL-15的异源IL-15α或IL-15β)的相应受体。或者，表达盒可以不并且不需要编码除异源细胞因子以外的任何其它异源多肽。在一些实施方案中，对异源多核苷酸进行密码子优化以改善异源多肽的表达。

如本文公开的可切割接头可以包含自切割肽，例如自切割2A肽。自切割肽可以在微小核糖核酸病毒科病毒家族的成员中找到，包含口疮病毒属，例如口蹄疫病毒(FMDV)、马甲型鼻炎病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)(TaV)和猪捷申病毒-1(PTV-1)、以及心病毒，例如泰勒病毒(例如泰勒氏鼠脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。自切割2A肽的非限制性实例可以包括“F2A”、“E2A”、“P2A”、“T2A”及其功能变体。

在一些情况下，本文公开的异源细胞因子(例如，异源IL)可以结合至工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的细胞表面。在一些实例中，可以对工程化免疫细胞进行基因修饰，以便将编码异源细胞因子的异源多核苷酸序列与编码工程化免疫细胞的内源跨膜蛋白的基因偶联。在一个实例中，内源跨膜蛋白可以是异源细胞因子(例如，异源IL-15的异源IL-15α或IL-15β)的相应受体。在一些实例中，可以将编码异源融合多肽的表达盒引入工程化免疫细胞，该异源融合多肽包括与(ii)异源受体偶联的(i)异源细胞因子。在此，异源细胞因子可以不是并且不需要是从异源受体可切割的。异源受体的非限制性实例可以包括异源细胞因子的相应受体(例如，异源IL-15的异源IL-15α或IL-15β)，或不同的受体，例如共同的γ链(γC)受体或其修饰。

本文公开的表达盒可以通过本文公开的基因编辑部分的作用而被整合到工程化细胞(例如，工程化NK细胞)的基因组中。或者，表达盒可以不并且不需要被整合到工程化细胞的基因组中。

本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以表现出涉及本文公开的异源细胞因子(例如，异源IL，例如异源IL-15)和/或异源受体(例如，异源IL受体，例如异源IL-15R)的内源信号传导途径的增强的信号传导。可以通过许多方法来确定本文公开的内源信号传导途径的增强的信号传导，包括但不限于：(i)下游信号传导蛋白(例如，对于IL-15/IL-15R，JAK3、STAT3、STAT5等)的磷酸化或(ii)通过蛋白质印迹或聚合酶链反应(PCR)技术的下游基因(例如，对于IL-15/IL-15R，Mcl1、Cdk4/6、Mki67、Tnf、Gzmb、Gzmc、Ifng等)的表达。

在一些情况下，在本公开的工程化免疫细胞中的由异源细胞因子和/或异源受体诱导的(例如，由本文公开的异源细胞因子和/或异源受体，例如IL-15/IL-15R诱导的)内源信号传导途径的增强的信号传导可以表征为与对照细胞相比，下游信号传导蛋白的磷酸化增加至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，增加至至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。

在一些情况下，在本公开的工程化免疫细胞中的由异源细胞因子和/或异源受体诱导的(例如，由本文公开的异源细胞因子和/或异源受体，例如IL-15/IL-15R诱导的)内源信号传导途径的增强的信号传导可以表征为与对照细胞相比，下游基因的表达增加至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，增加至至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。

本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的增强的CD16信号传导(例如，CD16的组成性激活的信号传导)可以通过在对象细胞中具有不可切割的CD16变体来实现。CD16(例如，CD16a)是免疫细胞(例如，NK细胞)表达的跨膜蛋白，其与附着于靶细胞的单体IgG结合以激活免疫细胞并促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在非工程化免疫细胞中，CD16和单体IgG之间的结合可在跨膜结构域附近的切割位点处诱导CD16蛋白的切割，从而在免疫细胞激活时调节CD16的细胞表面密度。因此，可以修饰工程化免疫细胞的内源CD16，以增强其信号传导。可替代地，可以将CD16的增强的信号传导变体人工引入到工程化免疫细胞中。

在一些情况下，可以通过本文公开的基因编辑部分的作用而在其胞外域(例如，F176V)中对工程化免疫细胞的编码CD16的内源基因进行基因修饰，从而与天然CD16相比，修饰的CD16表现出对其靶标(例如，单体IgG)更高的结合亲和力。在一些情况下，可以将编码这种修饰的CD16的异源基因引入细胞。

在一些情况下，工程化免疫细胞的编码CD16的内源基因可以通过本文公开的基因编辑部分的作用进行基因修饰，从而修饰的CD16是不可切割的，并可以诱导增强的CD16信号传导。在一些实例中，可以修饰或消除CD16的膜近侧区(位置189-212)中的切割位点(例如，位置195-198)(例如，作为不可切割的CD16变体的CD16 S197P变体)。在一些情况下，可以将编码这种修饰的CD16的异源基因引入细胞。

在一些情况下，可以将编码异源CD16变体的异源基因引入细胞(即，hnCD16)，所述异源CD16变体(i)对其靶标(例如，单体IgG)表现出更高的结合亲和力，并且(ii)是不可切割的。在一些实例中，异源CD16变体可以是修饰的CD16，其包括例如F176V和S197P，如本文公开的。在一些实例中，异源CD变体可以是融合受体蛋白，其包括(i)具有灭活的切割位点的CD16的至少一部分和(ii)不同细胞表面蛋白例如糖蛋白(例如CD64)的胞外域，与未修饰的CD16相比，其表现出与靶标(例如单体IgG)的增强的结合。

在一些情况下，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，异源CD16变体包含与SEQ ID NO.23具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，异源CD16变体包含SEQ ID NO.23的氨基酸序列。

本文公开的异源基因可以通过本文公开的基因编辑部分的作用而被整合到工程化细胞(例如，工程化NK细胞)的基因组中。或者，异源基因可以不并且不需要被整合到工程化细胞的基因组中。

可以通过多种方法来确定本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的增强的CD16信号传导，包括但不限于(i)通过蛋白质印迹的下游信号传导蛋白(例如SHP-1)的磷酸化，或(ii)通过蛋白质印迹或PCR技术的下游基因(例如CD25、IFN-γ、TNF等)的表达。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如，包括hnCD16的工程化NK细胞)的CD16信号传导可以是对照细胞的CD16信号传导的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约4倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍大。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如，包括hnCD16的工程化NK细胞)的增强的CD16信号传导可以表征为与对照细胞相比，下游信号传导蛋白的磷酸化增加至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，增加至至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如，包括hnCD16的工程化NK细胞)的增强的CD16信号传导可以表征为与对照细胞相比，下游基因的表达增加至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，增加至至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如，包括hnCD16的工程化NK细胞)的CD16信号传导可以与对照细胞的CD16信号传导相比延长(例如，激活的CD16信号传导的更长的持续时间)至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，延长至至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含本文公开的异源细胞因子，其中异源细胞因子结合至工程化免疫细胞的膜(例如，质膜)。在一些情况下，异源细胞因子可包含如本文公开的异源IL(例如，异源IL-15)。工程化免疫细胞可以进一步包含以下一项、两项或全部：(a)不同的异源细胞因子(例如，本文公开的异源细胞因子，除了与对象细胞的膜结合的异源细胞因子以外)，(b)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性，和(c)安全开关。在一些实例中，内源免疫调节多肽不是B2M。因此，内源免疫调节剂可以是例如，除B2M以外的多肽。

工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可包含不同的异源细胞因子和以下中的一者或两者：(b)内源免疫调节多肽(例如，非B2M多肽)的降低的表达或活性，和(c)安全开关。工程化免疫细胞包含内源免疫调节多肽(例如，非B2M多肽)的降低的表达或活性和以下中的一者或两者：(a)不同的异源细胞因子，和(c)安全开关。工程化免疫细胞包含安全开关和以下中的一者或两者：(a)不同的异源细胞因子，和(b)内源免疫调节多肽(例如，非B2M多肽)的降低的表达或活性。工程化免疫细胞包含(a)、(b)和(c)的全部。

如本文所公开的，与对照细胞相比，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以表现出涉及异源细胞因子的内源信号传导途径的增强的信号传导。

内源免疫调节多肽的表达或活性可以在工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中，例如，通过本文公开的基因编辑部分的作用而降低。

本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)中内源免疫调节多肽的降低的表达或活性可以通过多种方法确定，包括但不限于(i)下游信号传导蛋白(例如，对于PD1/PDL1信号传导，SHP2、Igα/β、Syk等)的磷酸化或去磷酸化；或(ii)通过蛋白质印迹或PCR技术的内源免疫调节多肽(例如，PD1)的表达。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中内源免疫调节多肽的降低的表达可以表征为，与对照细胞相比，内源免疫调节多肽(例如PD1)的表达降低至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，降低至至少或至多约1/2、至少或至多约1/3、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中内源免疫调节多肽的降低的活性可以表征为，与对照细胞相比，下游信号传导蛋白(例如对于PD1/PDL1信号传导，SHP2)的磷酸化减少至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，减少至至少或至多约1/2、至少或至多约1/3、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中内源免疫调节多肽的降低的活性可以表征为，与对照细胞相比，下游靶信号传导蛋白(例如对于PD1/PDL1信号传导，Igα/β或Syk)的磷酸化增加至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，增加至至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。下游靶标信号传导蛋白可以是正常地受内源免疫调节多肽的功能信号传导途径的作用而被抑制的蛋白质。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可以包含如本文所公开的CD16变体，用于在工程化NK细胞中的增强的CD16信号传导。在一些情况下，CD16变体(例如，异源CD16变体)可以包含CD16的至少一部分和CD64的至少一部分(例如，本文公开的hnCD16)。如本文所公开的，与对照细胞相比，工程化免疫细胞可以进一步包含内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。

如本文所公开的，与对照细胞相比，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以表现出增强的CD16信号传导。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含内源性细胞因子信号传导(例如内源性IL信号传导，例如内源性IL-17信号传导)的降低的活性。工程化免疫细胞可以衍生自分离的干细胞(例如分离的ESC)。或者，工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

在一些情况下，可以用内源细胞因子信号传导的抑制剂(例如，小分子抑制剂)处理工程化NK细胞。在一些情况下，工程化NK细胞可以包括内源IL-17或其内源受体的降低的表达(例如，通过插入缺失或转基因突变，通过瞬时或永久抑制等)。在一些情况下，工程化NK细胞可以包括内源IL-17的降低的表达。在一些情况下，工程化NK细胞可以包括内源IL-17R的降低的表达。在一些情况下，工程化NK细胞可以包括内源IL-17和内源IL-17R的降低的表达。

在一些情况下，本文公开的内源细胞因子可以是内源IL。本文公开的内源IL可以包括至少1、2、3、4、5或更多种不同类型的内源IL。本文公开的内源IL可以包括至多5、4、3或2种不同类型的内源IL。可替代地，内源IL可以是单一类型的内源IL。内源IL的非限制性实例可以包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。在一些实例中，内源IL可以是IL-17。内源IL-17的非限制性实例可以包括IL-17A、IL-17F及其天然突变。例如，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以表现出IL-17A或IL-17F的降低的表达或活性。

在一些情况下，可以通过本文公开的基因编辑部分的作用来修饰本文公开的编码内源细胞因子(例如内源IL，例如IL-17)的内源基因。

内源受体可以是本文公开的任何细胞因子的相应受体(例如，本文公开的任何IL的相应受体)。在一些情况下，内源受体可以是IL的相应受体(例如，用于IL-7信号传导的IL-17R)。IL-17R的非限制性实例可以包括IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE及其变体。在一个实例中，内源IL-17R包括IL-17RA。

在一些情况下，本文公开的内源细胞因子(例如内源IL，例如IL-17)或其内源受体的降低的表达或活性可以通过多种方法确定，包括但不限于：(i)下游信号传导蛋白(例如对于IL-17，PI3K、Act1、MAP3K、MEK1/2、MKK3/6、MKK4/7、MKK3/6、ERK、p38、JNK等)的磷酸化或(ii)下游基因的表达(通过蛋白质印迹或PCT技术)。在一些实例中，IL细胞因子例如IL-17的下游基因可以包括趋化因子(例如，CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL20等)、细胞因子(例如，IL-6、TNFa、G-CSF、GM-CSF等)、急性期应答分子(例如SAA、CRP、脂质运载蛋白2/24p3等)和/或酶(例如，金属蛋白酶，例如MMP1、MMP3、MMP9、MMP13)。

在一些情况下，在本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中内源细胞因子(例如内源IL，例如IL-17)或其内源受体的降低的表达或活性可以表征为，与对照细胞相比，内源细胞因子的下游信号传导蛋白的磷酸化减少至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，减少至至少或至多约1/2、至少或至多约1/3、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，在本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中内源细胞因子(例如内源IL，例如IL-17)或其内源受体的降低的表达或活性可以表征为，与对照细胞相比，内源细胞因子的下游基因的表达减少至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，减少至至少或至多约1/2、至少或至多约1/3、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，与没有表现出本文公开的内源细胞因子信号传导(例如，内源IL信号传导，例如内源IL-17信号传导)的降低的活性的对照细胞相比，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)可以表现出针对定型免疫细胞的特异性细胞标志物(例如NK细胞标志物)的增强的表达谱。例如，定型NK细胞的特异性细胞标志物的非限制性实例可以包括CD57或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。KIR可以包括KIR2D和/或KIR3D。KIR2D可以包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4和/或KIR2DS5。KIR3D可以包括KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3和/或KIR3DS1。

如本文公开的，针对定型免疫细胞的特异性细胞标志物(例如，NK细胞的CD57或KIR)的增强表达谱可以通过多种方法来确定，包括但不限于蛋白质印迹或PCR技术。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞中针对定型免疫细胞的特异性细胞标志物(例如，NK细胞CD57或KIR)的表达可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约4倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍高。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含以下一项或两项：(i)异源转录因子(例如，异源STAT)，(ii)内源性细胞因子信号传导(例如，本文公开的内源性IL信号传导)的降低的活性，和(iii)内源性酶(例如，连接酶，例如CBL-B)的降低的表达或活性。工程化免疫细胞可以衍生自分离的干细胞(例如分离的ESC)。或者，工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

异源转录因子可以包括至少1、2、3、4、5或更多种不同类型的异源转录因子。异源转录因子可以包括至多5、4、3或2种不同类型的转录因子。可替代地，异源转录因子可以具有单一类型的转录因子。转录因子可能与工程化免疫细胞的免疫活性、增殖、凋亡和/或分化有关。在一些情况下，工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的异源转录因子可以是STAT。STAT的非限制性实例可以包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6及其修饰。在一个实例中，STAT可以包括STAT3。在另一个实例中，STAT可以包括STAT5B。

在一些情况下，与没有(i)异源转录因子(例如，异源STAT)或(ii)内源细胞因子信号传导(例如内源IL-17信号传导)的降低的活性的对照细胞相比，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可在存在肿瘤细胞的情况下表现出增强的存活。在一些情况下，工程化免疫细胞在存在肿瘤细胞的情况下可以是对照细胞存活的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍长。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。与对照细胞相比，工程化免疫细胞可表现出本文公开的定型免疫细胞的特异性内源细胞标志物(例如，NK细胞标志物，例如KIR)的降低的表达或活性。在一些实例中，特异性内源细胞标志物是KIR。工程化免疫细胞可以进一步包含以下一种或更多种：(a)如本文所公开的包含能够结合抗原的抗原结合部分的嵌合多肽受体，(b)如本文公开的异源细胞因子(例如，异源IL，例如IL-15)，(c)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体，其中CD16变体是与如本文所公开的工程化NK细胞异源的；(d)本文公开的免疫调节多肽，其中免疫调节多肽是与工程化免疫细胞异源的，和(e)如本文所公开的内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。

工程化免疫细胞可包含嵌合多肽受体和以下中的一种或更多种(例如，1、2、3或4种)：(b)异源细胞因子，(c)用于增强的CD16信号传导的CD16变体，(d)异源免疫调节剂，和(e)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。

工程化免疫细胞可包含异源细胞因子和以下中的一种或更多种(例如，1、2、3或4种)：(a)嵌合多肽受体，(c)用于增强的CD16信号传导的CD16变体，(d)异源免疫调节剂，和(e)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。

工程化免疫细胞可包含用于增强的CD16信号传导的CD16变体和以下中的一种或更多种(例如，1、2、3或4种)：(a)嵌合多肽受体，(b)异源细胞因子，(d)异源免疫调节剂，和(e)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。

工程化免疫细胞可包含异源免疫调节剂和以下中的一种或更多种(例如，1、2、3或4种)：(a)嵌合多肽受体，(b)异源细胞因子，(c)用于增强的CD16信号传导的CD16变体，以及(e)内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。

工程化免疫细胞可包含内源免疫调节多肽的降低的表达或活性以及以下中的一种或更多种(例如，1、2、3或4种)：(a)嵌合多肽受体，(b)异源细胞因子，(c)用于增强的CD16信号传导的CD16变体，以及(d)异源免疫调节剂。

针对本文公开的定型免疫细胞的特异性内源细胞标志物(例如针对NK细胞的KIR)的降低的表达或活性可以通过许多方法来确定，包括但不限于蛋白质印迹或PCR技术。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞中针对定型免疫细胞的特异性内源细胞标志物(例如，NK细胞的KIR)的表达可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可表现出一种或多种内源免疫检查点抑制剂(例如CD94、CD96、TGFβ受体、SHIP2等)的降低的表达或活性。在一些情况下，工程化免疫细胞可表现出以下中的一种或多种的降低的表达或活性：(i)内源CD94、(ii)内源CD96、(iii)内源TGFβ受体和(iv)内源SHIP(例如SHIP2)。

在一些情况下，工程化免疫细胞可表现出内源CD94的降低的表达或活性，并且还表现出以下中的一种或多种(例如，1、2种或全部)的降低的表达或活性：(ii)内源CD96、(iii)内源TGFβ受体和(iv)内源SHIP(例如SHIP2)。

在一些情况下，工程化免疫细胞可表现出内源CD96的降低的表达或活性，并且还表现出以下中的一种或多种(例如，1、2种或全部)的降低的表达或活性：(i)内源CD94、(iii)内源TGFβ受体和(iv)内源SHIP(例如SHIP2)。

在一些情况下，工程化免疫细胞可表现出内源TGFβ受体的降低的表达或活性，并且还表现出以下中的一种或多种(例如，1、2种或全部)的降低的表达或活性：(i)内源CD94、(ii)内源CD96和(iv)内源SHIP(例如SHIP2)。

在一些情况下，工程化免疫细胞可表现出内源SHIP(例如SHIP2)的降低的表达或活性，并且还表现出以下中的一种或多种(例如，1、2种或全部)的降低的表达或活性：(i)内源CD94、(ii)内源CD96和(iii)内源TGFβ受体。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的免疫检查点抑制剂(例如CD94、CD96、TGFβ受体、SHIP2等)的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源CD94的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源CD96的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源TGFβ受体的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源SHIP(例如SHIP2)的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。如本文所公开的，工程化免疫细胞可以表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在一些情况下，内源免疫调节多肽包含一种或更多种低免疫性调节剂。在一些情况下，工程化免疫细胞表现出来自以下中的一种或更多种低免疫性调节剂的降低的表达或活性：(i)内源CD80、(ii)内源CD86、(iii)内源ICOSL、(iv)内源CD40L、(v)内源MICA或MICB或(vi)内源NKG2DL。工程化免疫细胞可以衍生自分离的干细胞(例如分离的ESC)。或者，工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

在一些情况下，如本文公开的，如通过蛋白质印迹或PCT技术确定的，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源低免疫性调节剂(例如，CD80、CD86、ICOSL、CD40L、MICA、MICB、NKG2DL等)的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源CD80的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源CD86的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源ICOSL的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源低免疫性调节剂CD40L的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源MICA或MICB的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源NKG2DL的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。如本文所公开的，工程化免疫细胞可以表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在一些情况下，内源性免疫调节多肽包含低免疫性调节剂(例如，ICAM1)。工程化免疫细胞进一步包含以下一种或更多种：(a)如本文公开的包含能够结合抗原的抗原结合部分的嵌合多肽受体，(b)如本文公开的异源细胞因子(例如，异源IL，例如IL-15)，和(c)用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体。

在一些情况下，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)包含本文公开的嵌合多肽受体和以下中的一种或两种：(b)如本文公开的异源细胞因子(例如异源IL，例如IL-15)和(c)用于增强的CD16信号传导的CD16变体。

在一些情况下，工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)包含本文公开的异源细胞因子(例如异源IL，例如IL-15)和以下中的一种或两种：(a)本文公开的嵌合多肽受体，和(c)用于增强的D16信号传导的CD16变体。

在一些情况下，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)包含用于增强的CD16信号传导的CD16变体和以下中的一种或两种：(a)如本文公开的嵌合多肽受体，和(b)如本文公开的异源细胞因子(例如，异源IL，例如IL-15)。

在一些情况下，如本文公开的，如通过蛋白质印迹或PCT技术确定的，本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的内源ICAM1的降低的表达或活性可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，可以是对照细胞对其的表达的至少或至多约1/2、至少或至多约1/4、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。如本文所公开的，工程化免疫细胞可以表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性。在一些情况下，内源性免疫调节多肽包含低免疫性调节剂(例如，ICAM1)。工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

在一些情况下，如本文所公开的，本公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)中内源性ICAM1的降低的表达或活性可以低于对照细胞对其的表达。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可以包含本文公开的免疫调节多肽，其中免疫调节多肽是与工程化免疫细胞异源的。在一些情况下，免疫调节多肽包含低免疫性调节剂。低免疫性调节剂可以是PDL2。可替代地或附加地，低免疫性调节剂可以是TGF-β。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可以包含本文公开的免疫调节多肽，其中免疫调节多肽是与工程化免疫细胞异源的。在一些情况下，免疫调节多肽包含低免疫性调节剂。低免疫性调节剂可包含以下中的一种或更多种成员：(i)异源CCL21、(ii)异源IL-10、(iii)异源CD46、(iv)异源CD55、和(v)异源CD59。工程化免疫细胞可以衍生自分离的干细胞(例如分离的ESC)。或者，工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括异源CCL21和以下中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)：(ii)异源IL-10，(iii)异源CD46，(iv)异源CD55，和(v)异源CD59。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括异源IL-10和以下中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)：(i)异源CCL21，(iii)异源CD46，(iv)异源CD55，和(v)异源CD59。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括异源CD46和以下中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)：(i)异源CCL21，(ii)异源IL-10，(iv)异源CD55，和(v)异源CD59。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括异源CD55和以下中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)：(i)异源CCL21，(ii)异源IL-10，(iii)异源CD46，和(v)异源CD59。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括异源CD59和以下中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)：(i)异源CCL21，(ii)异源IL-10，(iii)异源CD46，和(iv)异源CD55。

在一个方面，本公开提供了工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。工程化免疫细胞可包含本文所公开的不是IL-15的异源细胞因子(例如异源IL)。在一些实例中，异源细胞因子包含IL-21或其变体。工程化免疫细胞可以衍生自诱导的干细胞(例如，iPSC)。

在一些情况下，对照细胞可以是细胞可以是免疫细胞，例如NK细胞，其用于比较目的。在一些情况下，对照细胞可以是不包含异源细胞因子(例如，IL-15)的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不包含用于增强的CD16信号传导的CD16变体的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是包含包含能够结合抗原的抗原结合部分的嵌合多肽受体的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是包含异源IL-15R的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不包含膜结合型异源细胞因子(例如，IL-15)的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不表现出内源性细胞因子(例如，IL-17)或其受体(例如，IL-17R)的降低的表达或活性的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不包含异源转录因子(例如STAT)的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不表现出针对定型免疫细胞的特异性内源性细胞标志物(例如，NK细胞标志物，例如KIR)的降低的表达或活性的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不包含异源免疫调节多肽的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不表现出以下一种或更多种的降低的表达或活性的细胞：内源性CD94、内源性CD96、内源性TGFβ受体或内源性SHIP2。在一些情况下，对照细胞可以是不表现出以下一种或更多种的降低的表达或活性的细胞：内源性CD80、内源性CD86、内源性ICOSL、内源性CD40L、内源性MICA或MICB或内源性NKG2DL。在一些情况下，对照细胞可以是不表现出ICAM1的降低的表达或活性的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不包含异源PDL2或异源TGFβ的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不包含以下一种或更多种的细胞：异源CCL21、异源IL-10、异源CD46、异源CD55或异源CD59。在一些情况下，对照细胞可以是不包含异源IL-21的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不衍生自细胞系的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不衍生自分离的ESC的细胞。在一些情况下，对照细胞可以是不衍生自iPSC的细胞。

C.工程化免疫细胞的另外方面

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以包括本文公开的异源细胞因子(例如异源IL，例如IL-15)。在一些情况下，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)包括异源受体，其是异源细胞因子的相应受体(例如，异源IL-15R)，如本文公开的。因此，工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以表现出由本文公开的异源细胞因子和/或异源受体诱导(例如，由异源细胞因子和/或异源受体例如IL-15/IL-15R诱导)的内源信号传导途径的增强的信号传导。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，与对照细胞相比，该工程化免疫细胞可表现出内源CD38的降低的表达或活性。这样的工程化免疫细胞可以用于治疗患有或怀疑患有白细胞癌例如多发性骨髓瘤(MM)的对象。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞的内源CD38的表达或活性可以不被修饰并且不需要被修饰。这样的工程化免疫细胞可用于治疗患有或怀疑患有非多发性骨髓瘤的疾病(例如，癌症、肿瘤)的对象。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以包括异源IL-15或其片段，并且异源IL-15或其片段可以由工程化免疫细胞分泌。

在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQ ID NO.24具有至少70％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQ ID NO.24具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQ ID NO.24具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQ ID NO.24具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQ ID NO.24具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQ IDNO.24具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含与SEQID NO.24具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌型异源IL-15包含SEQ ID NO.24的氨基酸序列。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以包括异源IL-15或其片段，并且异源IL-15或其片段可以结合到工程化免疫细胞的细胞表面膜上。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以包括至少一种嵌合多肽受体，其包括能够结合抗原的抗原结合部分，如在本公开中所提供的。在一些实例中，工程化免疫细胞可以包括多种不同的嵌合多肽受体以特异性结合多种不同的抗原。在一些实例中，工程化免疫细胞可以包括至少一种嵌合多肽受体，其包括多个抗原结合部分以特异性结合多种不同的抗原。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以包括能够影响工程化免疫细胞的死亡的安全开关。工程化免疫细胞可通过基因编辑部分的作用包括编码安全开关的基因(例如，整合到免疫细胞的基因组中)，如本文公开的。在一些情况下，如果发生不良事件或当不再需要适应性免疫治疗时，可以将前药引入工程化免疫细胞中(例如，施用于包括工程化免疫细胞的对象)，并且可以通过安全开关分子来激活前药以杀死主题免疫细胞。在一些情况下，安全开关可以包括选自胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶3、7或9)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、修饰的EGFR、B细胞CD20及其功能性变体中的一个或多个成员。在一些情况下，可以通过激活剂(例如小分子或蛋白质，例如抗体)来激活安全开关，以进行主题工程化免疫细胞的死亡(或耗竭)的翻译后、时序和/或位点特异性调节。安全开关及其激活剂的非限制性实例可以包括胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)和AP1903；胸苷激酶(TK)和更昔洛韦(GCV)；和胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。可替代地或附加地，当主题细胞暴露于抗体时，包括被抗体(例如抗EGFRAb，例如西妥昔单抗)识别的表位的修饰的表皮生长因子受体(EGFR)可用于消耗工程化免疫细胞。在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括选自胱天蛋白酶9(胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、修饰的EGFR和B细胞CD20.3中的安全开关蛋白。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以包括异源免疫受体多肽。免疫调节多肽可以包括选自HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59中的一个或多个成员。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可表现出内源免疫调节多肽的降低的表达或活性，如本文公开的。内源免疫调节多肽包括免疫检查点抑制剂或低免疫性调节剂(或两者)。

在一些情况下，本文公开的免疫检查点抑制剂可以包括选自PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、NKG2D、TIGIT、CD96、LAG3、TIGIT、TGFβ受体和2B4中的一个或多个成员。在一些情况下，免疫检查点抑制剂可以包括SHIP2。

在一些情况下，本文公开的低免疫性调节剂可以包括选自B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59中的一个或多个成员。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，所述工程化免疫细胞可以包括用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导的CD16变体，其中CD16变体是与工程化免疫细胞异源的。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化免疫细胞可以表现出对靶细胞的增强的细胞毒性。在一些情况下，如通过例如跟踪靶细胞群体的数量的变化来确定的，本文公开的工程化免疫细胞可以对靶细胞或靶细胞群体表现出的细胞毒性(例如，体外、离体或体内)是对照细胞对其的细胞毒性的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍大。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化免疫细胞可以诱导来自分离的免疫细胞(例如，体外的分离的T细胞和/或B细胞，或将工程化免疫细胞施用于宿主后，宿主的免疫细胞)的免疫应答的降低。在一些情况下，如通过例如测量(i)暴露于分离的免疫细胞后工程化免疫细胞的初始群体的数量的变化，或(ii)暴露于工程化免疫细胞的初始群体后分离的免疫细胞的细胞因子释放的变化而确定的，与暴露于对照细胞时来自分离的免疫细胞的免疫应答相比，本文公开的工程化免疫细胞可以将来自分离的免疫细胞的免疫应答降低至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍，降低至至少或至多约1/2、至少或至多约1/3、至少或至多约1/4、至少或至多约1/5、至少或至多约1/6、至少或至多约1/7、至少或至多约1/8、至少或至多约1/9、至少或至多约1/10、至少或至多约1/20、至少或至多约1/30、至少或至多约1/40、至少或至多约1/50、至少或至多约1/60、至少或至多约1/70、至少或至多约1/80、至少或至多约1/90、至少或至多约1/100、至少或至多约1/500、至少或至多约1/1,000、至少或至多约1/5,000，或至少或至多约1/10,000。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化免疫细胞可以在暴露于分离的免疫细胞(例如，体外的分离的T细胞和/或B细胞，或将工程化免疫细胞施用于宿主时，宿主的免疫细胞)时表现出提高的半衰期。在一些情况下，如通过监测随着时间工程化免疫细胞的数量变化(例如通过FACS)来确定的，在暴露于分离的免疫细胞(例如体外或体内)时，工程化免疫细胞的半衰期可以是对照细胞的半衰期的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化免疫细胞可以实现对象身体组织的功能或病理状况的增强。在一些情况下，用工程化免疫细胞处理可以实现对照细胞或运载体(即无细胞)的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍的对象的身体组织的功能或病理状况的增强。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，与对照细胞相比，工程化免疫细胞可以实现对象身体组织的功能或病理状况的延迟退化。在一些情况下，用工程化免疫细胞处理可以实现对照细胞或运载体(即无细胞)的至少或至多约0.1倍、至少或至多约0.2倍、至少或至多约0.3倍、至少或至多约0.4倍、至少或至多约0.5倍、至少或至多约0.6倍、至少或至多约0.7倍、至少或至多约0.8倍、至少或至多约0.9倍、至少或至多约1倍、至少或至多约2倍、至少或至多约3倍、至少或至多约4倍、至少或至多约5倍、至少或至多约6倍、至少或至多约7倍、至少或至多约8倍、至少或至多约9倍、至少或至多约10倍、至少或至多约20倍、至少或至多约30倍、至少或至多约40倍、至少或至多约50倍、至少或至多约60倍、至少或至多约70倍、至少或至多约80倍、至少或至多约90倍、至少或至多约100倍、至少或至多约500倍、至少或至多约1,000倍、至少或至多约5,000倍，或至少或至多约10,000倍的对象的身体组织的功能或病理状况退化延迟。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，身体组织可以包括选自血液、血浆、血清、尿液、外淋巴液、粪便、唾液、精液、羊水、脑脊液、胆汁、汗液、眼泪、痰液、滑膜液、呕吐物、骨头、心脏、胸腺、动脉、血管、肺、肌肉、胃、肠、肝、胰腺、脾脏、肾脏、胆囊、甲状腺、肾上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮肤、脂肪、眼、脑、感染组织、病变组织、恶性组织、钙化组织和健康组织中的一个或多个成员。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，工程化免疫细胞可以诱导针对靶细胞的免疫应答。靶标可以是例如，病变细胞、癌细胞、肿瘤细胞等。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，异源基因可以可操作地与组成型、可诱导的、时序的、组织特异性的和/或细胞类型特异性的启动子偶联(例如，用于敲入)。感兴趣的启动子的非限制性实例可以包括CMV、EFla、PGK、CAG和UBC。插入位点的非限制性实例可以包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原、HTRP、H11、B2M、GAPDH、TCR、RUNX1、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCR a或b恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的一些实施方案中，可以表现出一种或多种以下内源基因的降低的表达或活性以增强工程化免疫细胞在肿瘤微环境中(即，肿瘤微环境基因或“TME”)的功能。在一些情况下，具有TME的降低的表达或活性可以增强工程化免疫细胞对靶细胞的免疫活性。在一些情况下，TME基因可以是免疫检查点抑制剂。TME的非限制性实例可以包括：NKG2A、NKG2D、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、KIR2D、CD94、CD96、TGFβ受体、2B4和SHIP2。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，可以表现出一种或多种异源基因(例如敲入的)用于例如增强的功能：CD137、CD80、CD86、DAP10(例如，带有或不带有点突变)。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，可以表现出一种或多种以下内源基因的降低的表达或活性用于例如低免疫性：B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tap相关蛋白、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB和NKG2DL(例如，ULBP1)。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，可以表现出一种或多种异源基因(例如敲入的)用于例如低免疫性：HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59。

在本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的一些实施方案中，可以表现出一种或多种异源基因(例如敲入的)：CD3、CD4、CD80、41BBL和CD131。

D.嵌合抗原受体

本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)可以包括本文公开的嵌合多肽受体(例如，至少1、2、3、4、5或更多种不同类型的嵌合多肽受体)。可以将工程化免疫细胞工程化以暂时或永久地表达嵌合多肽受体。在一些情况下，重组嵌合多肽受体可通过例如脂质体而被递送至工程化免疫细胞，并通过膜融合而被掺入到工程化免疫细胞中。在一些情况下，可以将编码嵌合多肽受体的异源多核苷酸构建体(例如DNA或RNA)递送至工程化免疫细胞。可以将编码异源多核苷酸构建体的异源多核苷酸构建体(即，基因)掺入到工程化免疫细胞的染色体(即染色体基因)中，或者，可以不整合到或不需要整合到本文公开的工程化免疫细胞的染色体中。

嵌合多肽受体可以包括T细胞受体融合蛋白(TFP)。术语“T细胞受体融合蛋白”或“TFP”通常是指重组多肽构建体，所述重组多肽构建体包括(i)一个或多个抗原结合部分(例如，单特异性或多特异性的)，(ii)TCR细胞外结构域的至少一部分，(iii)TCR跨膜结构域的至少一部分，和(iv)TCR细胞内结构域的至少一部分。

在一些情况下，本公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的内源T细胞受体(TCR)可以被灭活。在一些实例中，工程化免疫细胞的内源TCR的功能可以被抑制剂抑制。在一些实例中，编码内源TCR的亚基的基因可以被灭活(例如，通过本文公开的基因编辑部分的作用而被编辑)，从而内源TCR被灭活。编码内源TCR亚基的基因可以是以下中的一种或多种：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。

嵌合多肽受体可以包括嵌合抗原受体(CAR)。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指重组多肽构建体，所述重组多肽构建体包括至少细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包括衍生自刺激分子的功能信号传导结构域的细胞质信号传导结构域(本文也称为“细胞内或内在信号传导结构域”)。在一些情况下，刺激分子可以是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一些情况下，细胞内信号传导结构域还包括一个或多个衍生自至少一种共刺激分子的功能信号传导结构域。在一些情况下，共刺激分子可以包括4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N-末端)包括任选的前导序列。在一方面，CAR在细胞外抗原识别结构域的N-末端进一步包括前导序列，其中该前导序列任选地在细胞加工和将CAR定位于细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。

CAR可以是第一代、第二代、第三代或第四代CAR系统、其功能变体或其任何组合。第一代CAR(例如，CD19R或CD19CAR)包括：对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域(例如，抗体或其抗原结合片段，例如scFv、Fab片段、VHH结构域或仅重链抗体的VH结构域)、衍生自适应性免疫受体的跨膜结构域(例如来自CD28受体的跨膜结构域)，和衍生自适应性免疫受体的信号传导结构域(例如一个或多个(例如三个)衍生自CD3ζ受体或FcεRIγ的细胞内区域的ITAM结构域)。第二代CAR通过向CAR的细胞内信号传导结构域部分添加共刺激结构域(例如，衍生自与T细胞受体(例如CD28、CD137/4-1BB和CD134/OX40)共同作用的共刺激受体的)来修饰第一代CAR，这消除了与第一代CAR一起施用辅因子(例如IL-2)的需要。第三代CAR将多个共刺激结构域添加到CAR的细胞内信号传导结构域部分(例如CD3ζ-CD28-OX40或CD3ζ-CD28-41BB)。第四代CAR通过向CAR的细胞内信号传导部分(例如，在一个或多个共刺激结构域和CD3ζITAM结构域之间)添加激活细胞因子(例如IL-12、IL-23或IL-27)或在CAR诱导的启动子(例如，NFAT/IL-2最小启动子)的控制下来修饰第二代或第三代CAR。在一些情况下，CAR可以是与本文所公开的第一代、第二代、第三代或第四代CAR系统不同的新一代CAR系统。

本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的CAR的铰链结构域(例如，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的接头)可以包括CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的天然或修饰的跨膜区的全长或至少一部分。在一些实施方案中，铰链结构域可以是CD8α铰链。在一些情况下，CD8α铰链可以包含SEQ ID NO.36的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域可以是CD28铰链。在一些情况下，CD28铰链可以包含与SEQ IDNO.49的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的CAR的跨膜结构域可以包括CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的天然或修饰的跨膜区的全长或至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是CD8α跨膜结构域。在一些情况下，CD8α跨膜结构域可以包含SEQ ID NO.37的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是CD28跨膜结构域。在一些情况下，CD28跨膜结构域可以包含与SEQ ID NO.50的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

本文公开的CAR的铰链结构域和跨膜结构域(例如，用于工程化免疫细胞，例如工程化NK细胞)可以衍生自相同的蛋白质(例如，CD8)。可替代地，本文公开的CAR的铰链结构域和跨膜结构域可以衍生自不同的蛋白质。

本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中的CAR的信号肽可以包含CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的天然的或修饰的多肽的全长或至少一部分。信号肽可以从成熟的CAR蛋白中切割(例如，自切割)。在一些实施方案中，信号肽可以是CD8α信号肽。在一些情况下，CD8α信号肽可以包含与SEQ ID NO.31的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

CAR的信号传导结构域可包含至少或至多约1个信号传导结构域、至少或至多约2个信号传导结构域、至少或至多约3个信号传导结构域、至少或至多约4个信号传导结构域、至少或至多约5个信号传导结构域、至少或至多约6个信号传导结构域、至少或至多约7个信号传导结构域、至少或至多约8个信号传导结构域、至少或至多约9个信号传导结构域或至少或至多约10个信号传导结构域。

本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)中CAR的信号传导结构域(例如，细胞内信号传导结构域的信号传导肽)可以包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或其任何组合的多肽的全长或至少一部分。在一些实施方案中，信号传导结构域可以是CD3ζ信号结构域。在一些情况下，CD3ζ信号传导结构域可以包含与SEQ ID NO.38的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

可替代地或除此(即，共刺激结构域)之外，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)中的信号传导结构域CAR可包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合的多肽的全长或至少一部分。在一些实施方案中，共刺激结构域可以是2B4共刺激结构域。在一些情况下，2B4共刺激结构域可以包含与SEQ ID NO.32的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域可以是CD28共刺激结构域。在一些情况下，CD28共刺激结构域可以包含与SEQ ID NO.51的多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)包括嵌合多肽受体(例如CAR)，该嵌合多肽受体包括至少CD8跨膜结构域和以下中的一个或多个：(i)2B4信号传导结构域和(ii)DAP10信号传导结构域。在一些情况下，本文公开的工程化细胞(例如，工程化NK细胞)包括嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)，该嵌合多肽受体包括至少(i)CD8跨膜结构域、(ii)2B4信号传导结构域和(iii)DAP10信号传导结构域。2B4信号传导结构域的两侧可以是CD8跨膜结构域和DAP10信号传导结构域。可替代地，DAP10信号传导结构域的两侧可以是CD8跨膜结构域和2B4信号传导结构域。在一些情况下，本文公开的嵌合多肽受体可以进一步包括衍生自CD3ζ的另外的信号传导结构域。

本文公开的嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)的抗原结合部分的抗原(即，靶抗原)可以是细胞表面标志物、分泌标志物或细胞内标志物。

本文所公开的嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)的抗原结合部分的抗原(即靶抗原)的非限制性实例可以包括ADGRE2、碳酸酐酶IX(CA1X)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3ζ、CD5、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD133、CD138、CD269(BCMA)、CD S、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、gp100、人类表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白细胞介素13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、κ、路易斯A(CA19.9)、路易斯Y(LeY)、L1细胞黏附分子(L1-CAM)、LILRB2、MART-1、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、黏蛋白1(Muc-1)、黏蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、NY-ESO-2、癌胚胎抗原(h5T4)、PRAIVIE、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、Wilms肿瘤蛋白(WT-1)和各种病原体抗原(例如，衍生自能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物的病原体抗原)。在一些实例中，病原体抗原衍生自HIV、HBV、EBV、HPV、Lasse病毒、流感病毒或冠状病毒。

本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分的抗原的其它实例可以包括：1-40-β-淀粉样蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、甲胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽芽孢杆菌炭疽、BAFF、β-淀粉样蛋白、B淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬(Canis lupus familiaris)IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白(basigin))、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44 v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌、凝集因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体类型4、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺氏毒素类型1、大肠杆菌志贺氏毒素类型2、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮膜抗原(episialin)、ERBB3、大肠杆菌、呼吸道合胞病毒的F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白额外结构域B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、GD3神经节苷脂、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血凝素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人分散因子受体激酶、人TNF、人β淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL17A、IL17F、IL20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整合素α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整合素αIIbβ3、整合素αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、黏蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌生长抑制素、NCA-90(粒细胞抗原)、神经细胞凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠协同转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板源性生长因子受体β、前列腺癌细胞、铜绿假单胞菌、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白(sclerostin)、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、1-磷酸鞘氨醇、金黄色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、腱生蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化、肿瘤相关钙信号转导子2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白和VWF。

本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分的抗原的其它实例可以包括：707-AP、生物素化分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、胱天蛋白酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞黏附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、路易斯Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A(Mammaglobin-A)、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活蛋白(Survivin)、存活蛋白-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。

本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分的抗原的其它实例可以包括抗体、其片段或其变体。此类抗体可以是天然抗体(例如，对象的免疫细胞(例如B细胞)天然分泌的)、合成的抗体或修饰的抗体。在一些情况下，本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分的抗原可以包括来自下组的抗体的Fc结构域，该组包括：20-(74)-(74)(米拉珠单抗(milatuzumab)；维妥珠单抗(veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉珠单抗(milatuzumab)；维妥珠单抗(veltuzumab))、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿比特珠单抗(abituzumab)、林妥珠单抗(zlintuzumab))、阿克托单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿德木单抗(adecatumumab)、阿杜卡奴单抗(aducanumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、AFM13、阿福图珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、培阿赛珠单抗(alacizumabpegol)、ALD518、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿利珠单抗(alirocumab)、戊酸阿替莫单抗(altumomab pentetate)、阿麦妥单抗(amatuximab)、AMG 228、AMG 820、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)、阿尼弗洛姆单抗(anifrolumab)、安芦珠单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(sevacizumab)、APX005M、阿西莫单抗(arcitumomab)、ARX788、阿斯库昔单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、ATL101、atlizumab(还称为托珠单抗(tocilizumab))、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、B-701、贝平珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝戈洛单抗(begelomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝西洛索单抗(besilesomab)、Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、BEVZ92(贝伐珠单抗(bevacizumab)生物类似物)、bezlotoxumab、BGB-A317、BHQ880、BI836880、BI-505、比西单抗(biciromab)、bimagrumab、bimekizumab、莫比瓦妥单抗(bivatuzumab mertansine)、BIW-8962、博纳吐单抗(blinatumomab)、布洛唑单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、bococizumab、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、BrevaRex、briakinumab、布罗达单抗(brodalumab)、布洛珠单抗(brolucizumab)、支舒巴单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、康纳单抗(canakinumab)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、拉坎妥珠单抗(cantuzumab ravtansine)、卡普赛珠单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、卡鲁单抗(carlumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、CBR96-多柔比星(doxorubicin)免疫偶联物、CBT124(贝伐珠单抗(bevacizumab))、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、替可利妥珠单抗(clivatuzumabtetraxetan)、CM-24、codrituzumab、雷星-考妥昔单抗(coltuximab ravtansine)、康妥单抗(conatumumab)、康赛珠单抗(concizumab)、Cotara(碘I-131地洛妥单抗(derlotuximab)生物素)、cR6261、克瑞组单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥珠单抗(trastuzumab)生物类似物)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达鲁妥珠单抗(dalotuzumab)、达非洛利单抗聚乙二醇(dapirolizumab pegol)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、达雷妥尤单抗(Daratumumab Enhanze)(达雷妥尤单抗(daratumumab))、Darleukin、dectrekumab、demcizumab、denintuzumab mafodotin、地诺单抗(denosumab)、德帕妥昔组单抗(Depatuxizumab)、地帕西珠单抗(Depatuxizumab mafodotin)、德尔罗妥单抗生物素(derlotuximab biotin)、地莫单抗(detumomab)、DI-B4、地努妥昔单抗(dinutuximab)、地利达武单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、曲齐妥单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、度戈妥珠单抗(duligotumab)、dupilumab、度伐鲁单抗(durvalumab)、度司妥单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗(edobacomab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、埃迪鲁单抗(eldelumab)、埃格曼图姆单抗(elgemtumab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、依西单抗(elsilimomab)、艾莫妥单抗(emactuzumab)、艾米单抗(emibetuzumab)、依那妥单抗(enavatuzumab)、伏马汀(enfortumab vedotin)、恩妥单抗(enlimomab pegol)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、enokizumab、enoticumab、恩妥昔单抗(ensituximab)、西艾匹莫单抗(epitumomabcituxetan)、依普珠单抗(epratuzumab)、erlizumab、厄妥索单抗(ertumaxomab)、达珠单抗(etaracizumab)、etrolizumab、evinacumab、evolocumab、exbivirumab、fanolesomab、faralimomab、farletuzumab、fasinumab、FBTA05、felvizumab、fezakinumab、FF-21101、FGFR2抗体-药物偶联物、Fibromun、ficlatuzumab、figitumumab、firivumab、弗兰妥他单抗(flanvotumab)、弗莱妥单抗(fletikumab)、fontolizumab、foralumab、foravirumab、FPA144、fresolimumab、FS102、富拉珠单抗(fulranumab)、氟妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、加尼单抗(ganitumab)、甘特珠单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、Gerilimzumab、gevokizumab、girentuximab、glembatumumab vedotin、GNR-006、GNR-011、golimumab、gomiliximab、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、guselkumab、Hu14.18K322A MAb、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、依巴利珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、艾芦库单抗(icrucumab)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗(igovomab)、IMAB362、IMAB362(claudiximab)、伊玛鲁单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、imciromab、imgatuzumab、IMGN529、IMMU-102(钇Y-90依普鲁单抗(epratuzumab tetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗抗体、INCAGN1876、inclacumab、INCSHR1210、indatuximab ravtansine、indusatumab vedotin、infliximab、依诺莫单抗(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、intetumumab、Ipafricept、IPH4102、依匹莫单抗(ipilimumab)、依拉妥单抗(iratumumab)、伊妥昔单抗(isatuximab)、伊司特罗单抗(Istiratumab)、伊曲珠单抗(itolizumab)、依克珠单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、凯利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、Labetuzumab Govitecan、LAG525、lambrolizumab、lampalizumab、L-DOS47、来波珠单抗、lemalesomab、lenzilumab、lerdelimumab、Leukotuximab、lexatumumab、libivirumab、lifastuzumab vedotin、ligelizumab、lilotomab satetraxetan、lintuzumab、lirilumab、LKZ145、lodelcizumab、洛基韦单抗(lokivetmab)、洛洛单抗美沙胆碱(lorvotuzumab mertansine)、卢卡单抗(lucatumumab)、卢利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁米单抗(lumiliximab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、LY3164530、mapatumumab、margetuximab、maslimomab、matuzumab、mavrilimumab、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(inebilizumab)、MEDI-565、MEDI6469、mepolizumab、metelimumab、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)-SN-38、minretumomab、mirvetuximab soravtansine、mitumomab、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、mogamulizumab、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫罗木单抗(morolimumab)、莫妥珠单抗(motavizumab)、莫妥昔单抗假单抗(moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、namilumab、埃托-那普妥莫单抗(naptumomabestafenatox)、narnatumab、那他珠单抗(natalizumab)、nebacumab、necitumumab、nemolizumab、nerelimomab、nesvacumab、nimotuzumab、纳武单抗(nivolumab)、诺非他莫单抗(nofetumomab merpentan)、NOV-10、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、奥比单抗(obinutuzumab)、奥卡珠单抗(ocaratuzumab)、奥珠单抗(ocrelizumab)、odulimomab、ofatumumab、olaratumab、olokizumab、omalizumab、OMP-131R10、OMP-305B83、恩妥珠单抗(onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(Ontuxizumab)、奥匹单抗(opicinumab)、莫妥组单抗(oportuzumab monatox)、oregovomab、奥替苏单抗(orticumab)、奥昔组单抗(otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥昔单抗(oxelumab)、奥扎尼珠单抗(ozanezumab)、奥沙利珠单抗(ozoralizumab)、帕吉单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕诺单抗(pankomab)、PankoMab-GEX、panobacumab、parsatuzumab、pascolizumab、pasotuxizumab、pateclizumab、帕特鲁单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、派姆单抗(pembrolizumab)、平妥单抗(pemtumomab)、培拉凯珠单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、帕克珠单抗(pexelizumab)、PF-05082566(utomilumab)、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、pidilizumab、pinatuzumab vedotin、pintumomab、placulumab、polatuzumab vedotin、ponezumab、普利利昔单抗(priliximab)、普利妥昔单抗(pritoxaximab)、普利妥单抗(pritumumab)、PRO140、Proxinium、PSMA ADC、雷珠单抗(quilizumab)、雷克托玛单抗(racotumomab)、radretumab、rafivirumab、ralpancizumab、ramucirumab、ranibizumab、raxibacumab、refanezumab、regavirumab、REGN1400、REGN2810/SAR439684、瑞利珠单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利洛单抗(rilotumumab)、rinucumab、利妥昔单抗(rituximab)、RM-1929、RO7009789、robatumumab、roledumab、romosozumab、rontalizumab、罗韦珠单抗(rovelizumab)、ruplizumab、sacituzumab govitecan、samalizumab、SAR408701、SAR566658、sarilumab、SAT 012、satumomab pendetide、SCT200、SCT400、SEA-CD40、secukinumab、seribantumab、setoxaximab、sevirumab、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西罗妥珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗(sifalimumab)、siltuximab、simtuzumab、siplizumab、sirukumab、sofituzumab vedotin、solanezumab、solitomab、sonepcizumab、sontuzumab、stamulumab、sulesomab、suvizumab、SYD985、SYM004(福妥昔单抗(futuximab)和莫妥昔单抗(modotuximab))、Sym015、TAB08、他巴单抗(tabalumab)、他卡妥珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度组单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、他尼单抗(Tanibirumab)、taplitumomab paptox、tarextumab、TB-403、tefibazumab、Teleukin、telimomab aritox、特那妥单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替普珠单抗(teplizumab)、替普鲁单抗(teprotumumab)、替西鲁单抗(tesidolumab)、替妥洛单抗(tetulomab)、TG-1303、TGN1412、钍-227-依帕珠单抗(Epratuzumab)偶联物、替尼单抗(ticilimumab)、替加妥珠单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、Tisotumab vedotin、TNX-650、托珠单抗(tocilizumab)、托拉珠单抗(toralizumab)、托沙妥单抗(tosatoxumab)、托西妥玛单抗(tositumomab)、托韦单抗(tovetumab)、曲妥单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)emtansine、TRBS07、TRC105、tregalizumab、tremelimumab、trevogrumab、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、tuvirumab、U3-1565、U3-1784、ublituximab、ulocuplumab、urelumab、urtoxazumab、乌司奴单抗(ustekinumab)、瓦达妥昔单抗他利林(Vadastuximab Talirine)、维汀-万多妥珠单抗(vandortuzumab vedotin)、凡克妥单抗(vantictumab)、万古珠单抗(vanucizumab)、vapaliximab、varlilumab、vatelizumab、VB6-845、vedolizumab、veltuzumab、vepalimomab、vesencumab、visilizumab、volociximab、vorsetuzumab mafodotin、votumumab、YYB-101、扎鲁单抗(zalutumumab)、扎诺莫单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉莫单抗(ziralimumab)和佐利马单抗(zolimomab aritox)。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)，该嵌合多肽受体包括抗原结合结构域，并且抗原结合结构域可以能够特异性并且优先地结合抗原，所述抗原包括选自BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、κ、路易斯Y、NKG2D配体、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和gp100中的一个或多个成员。NKG2D配体的非限制性实例包括选自MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6中的一个或多个成员。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包含嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)，该嵌合多肽受体包含抗原结合结构域，并且抗原结合结构域可以能够特异性并优先地结合CD19。能够特异性并优先地结合CD19的任何合适的抗原结合结构域可以用于本申请的嵌合多肽受体中。在一些实施方案中，抗原结合结构域选自Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和sdAb。在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域包含重链可变区、轻链可变区或其组合。

在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域的重链可变区包含与SEQ ID No.16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO.16的氨基酸序列。

在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域的重链可变区包含与SEQ ID NO.39具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO.39的氨基酸序列。在一些情况下，SEQ ID NO.39的重链可变区可以是“2型”抗CD19重链可变区。

在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域的重链可变区包含与SEQ ID NO.43具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO.43的氨基酸序列。在一些情况下，SEQ ID NO.43的重链可变区可以是“3型”抗CD19重链可变区。

在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域的轻链可变区包含与SEQ ID NO.17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列。

在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域的轻链可变区包含与SEQ ID NO.40具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO.40的氨基酸序列。在一些情况下，SEQ ID NO.40的轻链可变区可以是“2型”抗CD19轻链可变区。

在一些实施方案中，能够特异性并且优先地结合CD19的抗原结合结构域的轻链可变区包含与SEQ ID NO.44具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO.44的氨基酸序列。在一些情况下，SEQ ID NO.44的轻链可变区可以是“3型”抗CD19轻链可变区。

在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区可以通过接头序列融合在一起。在一些情况下，接头序列可以是SEQ ID NO.18-20和55-60中的任何一个。

包含(i)重链可变区(其包含与SEQ ID NO.16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列)以及(ii)轻链可变区(其包含与SEQ ID NO.17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列)的抗CD19 scFv、包含此类scFv的CAR构建体或包含此类CAR的细胞在本公开内容全文中通常可称为“1型”或“KB15”。

包含(i)重链可变区(其包含与SEQ ID NO.39具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列)以及(ii)轻链可变区(其包含与SEQ ID NO.40具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列)的抗CD19 scFv、包含此类scFv的CAR构建体或包含此类CAR的细胞在本公开内容全文中通常可称为“2型”或“OI42”。

包含(i)重链可变区(其包含与SEQ ID NO.43具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列)以及(ii)轻链可变区(其包含与SEQ ID NO.44具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列)的抗CD19 scFv、包含此类scFv的CAR构建体或包含此类CAR的细胞在本公开内容全文中通常可称为“3型”。

在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是scFv。在一些实施方案中，scFv可以是1型抗CD19 scFv，其包含(i)具有SEQ ID NO.16序列的抗CD19重链可变区、(ii)SEQ IDNO.17的抗CD19轻链可变区和(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列。在一些情况下，1型抗CD19 scFv可以具有SEQ ID NO.35的氨基酸序列。

在一些实施方案中，scFv可以是2型抗CD19 scFv，其包含(i)具有SEQ ID NO.39序列的重链可变区、(ii)SEQ ID NO.40的轻链可变区和(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列。在一些情况下，2型抗CD19 scFv可以具有SEQ ID NO.41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，scFv可以是3型抗scFv。3型抗CD19 scFv的第一实例可以包含(i)具有SEQ ID NO.43的序列的重链可变区、(ii)SEQ ID NO.44的轻链可变区和(iii)GSTSGSGKPGSGEGSTKG的接头序列。在一些情况下，3型抗CD19 scFv的第一实例可以包含SEQID NO.45的氨基酸序列。3型抗CD19 scFv的第二实例可以包含(i)具有SEQ ID NO.43序列的重链可变区、(ii)SEQ ID NO.44的轻链可变区和(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列。在一些情况下，3型抗CD19 scFv的第二实例可以包含SEQ ID NO.47的氨基酸序列。

在一些实施方案中，公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包含嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)，其包含能够特异性结合靶细胞的抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，工程化CAR免疫细胞(例如，工程化CAR NK细胞)可以与靶细胞上的CD19结合。在一些实施方案中，工程化抗CD19 CAR免疫细胞(例如，工程化抗CD19 CAR NK细胞)可以具有1型抗CD19 CAR，其包含(i)SEQ ID NO.16的抗CD19重链可变区、(ii)SEQ ID NO.17的抗CD19轻链可变区、(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列和(iv)具有SEQ ID NO.31序列的CD8α信号肽序列。在一些情况下，具有CD8α信号肽的1型抗CD19 CAR可以包含SEQ ID NO.33的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化抗CD19 CAR免疫细胞(例如，工程化CAR NK细胞)可以具有1型抗CD19 CAR，其包含(i)具有SEQ ID NO.16的序列的抗CD19重链可变区、(ii)具有SEQ ID NO.17的序列的抗CD19轻链可变区和(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列，但没有CD8α信号肽序列。在一些情况下，不具有CD8α信号肽的1型抗CD19 CAR可以包含SEQ IDNO.34的氨基酸序列。

在一些实施方案中，工程化抗CAR免疫细胞(例如，工程化CAR NK细胞)可以具有2型抗CD19 CAR，其包含(i)具有SEQ ID NO.39的序列的抗CD19重链可变区、(ii)SEQ IDNO.40的抗CD19轻链可变区和(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列。在一些情况下，2型抗CD19 CAR可以具有SEQ ID NO.42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，工程化抗CAR免疫细胞(例如工程化CAR NK细胞)可以具有3型抗CD19 CAR。3型抗CD19 CAR的第一实例可以包含(i)具有SEQ ID NO.43的序列的重链可变区、(ii)SEQ ID NO.44的轻链可变区和(iii)GSTSGSGKPGSGEGSTKG的接头序列。在一些情况下，3型抗CD19CAR的第一实例可以包含SEQ ID NO.46的氨基酸序列。3型抗CD19 CAR的第二实例可以包含(i)具有SEQ ID NO.43的序列的重链可变区、(ii)SEQ ID NO.44的轻链可变区和(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列。在一些情况下，3型抗CD19的第二实例可以包含SEQ ID NO.48的氨基酸序列。3型抗CD19 CAR的第三实例可以包含(i)具有SEQ ID NO.43的序列的重链可变区、(ii)SEQ ID NO.44的轻链可变区、(iii)GGGGSGGGGSGGGGS的接头序列和(iv)SEQ ID NO.31的CD8α信号肽。在一些情况下，3型抗CAR的第三实例可以包含SEQ IDNO.61的氨基酸序列。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)可以包括嵌合多肽受体(例如TFP或CAR)，该嵌合多肽受体包括能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合结构域，并且工程化免疫细胞可表现出编码嵌合多肽受体的相同抗原的内源基因的降低的表达或活性。因此，工程化免疫细胞的群体可以例如在施用给有需要的对象时避免互相靶向和杀伤。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)，该嵌合多肽受体包括抗原结合结构域，并且抗原结合结构域可以能够特异性并优先地结合CD38。在一些情况下，可以对工程化免疫细胞的编码CD38的内源基因进行修饰，以实现内源CD38的降低的表达或活性。在一些情况下，包括针对CD38的嵌合多肽受体的主题工程化免疫细胞可以能够靶向并实现浆细胞的死亡(或降解)。

在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以包括嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)，该嵌合多肽受体包括抗原结合结构域，并且抗原结合结构域可以能够特异性并优先地结合CD38。在一些实例中，工程化免疫细胞是衍生自分离的ESC或诱导的干细胞(例如，iPSC)的工程化NK细胞。在一些情况下，工程化免疫细胞的编码CD38的内源基因可以被修饰以实现内源CD38的表达或活性降低。

在一些实施方案中，本文所述的任何组分可以使用接头序列融合在一起(例如，融合scFv的轻链和重链或融合IL-15和IL-15R)。在一些情况下，接头序列可以是SEQ IDNO.18-20和55-60中的任何一个。

E.干细胞

本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以衍生自分离的干细胞(例如，ESC)或诱导的干细胞(iPSC)。分离的干细胞或诱导的干细胞可以被修饰(例如，基因修饰)以产生工程化免疫细胞。

在一些情况下，可以部分地通过评估细胞的多能性特征来确定干细胞(例如，ESC或iPSC)的多能性。多能性特征可以包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜力；(iii)多能干细胞标志物，包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50的表达；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；和(vi)由三种体细胞谱系的细胞组成的胚状体的形成。

在一些情况下，可以对干细胞(例如，ESC或iPSC)进行基因修饰以产生(例如，诱导分化为)CD34+造血干细胞。可以在诱导的造血干细胞分化之前、之后或期间，对干细胞进行基因修饰以表达本文公开的任何一种异源多肽(例如，细胞因子、受体等)。可以在诱导的造血干细胞分化之前、之后或期间对干细胞进行基因修饰以降低本文公开的内源基因或多肽(例如，细胞因子、受体等)的任何一种的表达或活性。在一些情况下，这样的基因修饰的CD34+造血干细胞是本公开的任何一种工程化免疫细胞或是其来源。

在一些实例中，本文公开的干细胞可以在具有ROCKi(Y-27632)(例如，以约10微摩尔(μM))、SCF(例如，以约40纳克/毫升(ng/mL)的培养基)、VEGF(例如，以约20ng/mL的培养基)和BMP-4(例如，以约20ng/mL的培养基)的APEL培养基中培养以分化为CD34+造血干细胞。

在一些情况下，可以诱导CD34+造血干细胞(例如，用本公开的任何一种工程化免疫细胞的一种或多种特征进行基因修饰)以分化为定型免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。因此，在一些情况下，诱导的分化过程产生本公开的任何一种工程化NK细胞。

在一些实例中，在IL-3(例如，约5ng/mL)、IL-7(例如，约20ng/mL)、IL-15(例如，约10ng/mL)、SCF(例如，约20ng/mL)和Flt3L(例如，约10ng/mL)的存在下培养经基因修饰的CD34+造血干细胞以分化为CD45+NK细胞。

在一些情况下，CD45+NK细胞可以使用透气性快速扩增(G-Rex)平台在例如包括IL-2、mbIL-21aAPC的培养基中在培养物中扩增。

在一些情况下，本文公开的iPSC衍生的NK细胞可以与一种或多种包括Il-2、IL-15或IL-21的异源细胞因子一起培养。在一些情况下，本文公开的iPSC衍生的NK细胞可以与一种或多种选自Il-2、IL-15和IL-21中的异源细胞因子一起培养(例如，用于细胞扩增)。在一些情况下，本文公开的iPSC衍生的NK细胞可以与两种或更多种选自Il-2、IL-15和IL-21的异源细胞因子(例如IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、或IL-15和IL-21)一起同时地或以任何顺序依次地培养。在一些情况下，本文公开的iPSC衍生的NK细胞可以与II-2、IL-15和IL-21的全部一起同时地或以任何顺序依次地培养。

F.基因编辑或遗传物质递送

本文公开的基因编辑部分可以包括CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调节多肽、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、转录激活因子样效应物相关基因调控多肽、大范围核酸酶、自然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、Argonaute蛋白、其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方案中，致动器部分包括Cas蛋白，并且系统还包括与Cas蛋白复合的向导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，致动器部分包括与能够与Cas蛋白形成复合物的gRNA复合的RBP。在一些实施方案中，gRNA包括靶向区段，其与靶多核苷酸表现出至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，Cas蛋白基本上缺乏DNA切割活性。

在一些情况下，合适的基因编辑部分包括CRISPR相关的(Cas)蛋白或Cas核酸酶，其包括I型CRISPR相关的(Cas)多肽、II型CRISPR相关的(Cas)多肽、III型CRISPR相关的(Cas)多肽、IV型CRISPR相关的(Cas)多肽、V型CRISPR相关的(Cas)多肽和VI型CRISPR相关的(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如原核Argonaute(pAgo)、古菌Argonaute(aAgo)和真核Argonaute(eAgo))；其任何衍生物、其任何变体；及其任何片段。

Cas蛋白的非限制性实例包括：c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas1O、Cas1Od、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx1O、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966及其同源物或修饰形式。

在一些情况下，本文公开的基因编辑部分可以与另外的功能部分融合(例如，以形成融合部分)，并且另外的功能部分的功能的非限制性实例可以包括：甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酰化活性、脱腺苷化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性和脱肉豆蔻酰化活性。例如，融合蛋白可以是Cas蛋白与效应物或阻遏物功能部分的融合体。

可替代地或附加地，可以实现基因编辑(例如敲入)或异源遗传物质的递送。其它基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于将核酸引入宿主细胞(例如本文公开的干细胞、造血干细胞等)中。此类方法可用于将编码本公开的多肽分子的核酸施用到培养物中(或宿主生物体中)的细胞。病毒载体递送系统可以包括DNA和RNA病毒，其在递送到细胞后可以具有游离的或整合的基因组。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、RNA(例如本文所述的载体的转录物)、裸核酸以及与递送运载体诸如脂质体复合的核酸。

基于RNA或DNA病毒的系统可用于靶向特定细胞，并将病毒有效载荷转运到细胞的细胞核。病毒载体可以用于体外处理细胞，并且可以任选地(离体)施用修饰的细胞。可替代地，可以将病毒载体直接(体内)施用给对象。基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。可通过逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法在宿主基因组中发生整合，这可以导致插入的转基因的长期表达。

核酸的非病毒递送方法可以包括脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质-核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的试剂增强的吸收。可以使用适合于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质。

可替代地或附加地，可以使用反义寡核苷酸来抑制或沉默靶基因表达。反义寡核苷酸的非限制性实例可以包括短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。

G.联合疗法

本公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以与联合治疗剂组合以治疗有需要的对象。在一些情况下，可以在将联合治疗剂施用于对象之前、同时或之后将工程化免疫细胞施用于对象。

在一方面，本公开提供了一种组合物，其包括(a)本文公开的任一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)和(b)联合治疗剂(即，单独的治疗剂)(例如，抗体，例如抗CD20抗体或抗PD1抗体)。在一些情况下，工程化免疫细胞可以包括以下中的一种或多种：(i)本文公开的异源细胞因子(例如，异源IL，例如IL-15)，(ii)本文公开的用于增强的CD16信号传导的CD16变体，和(iii)本文公开的嵌合多肽受体，该嵌合多肽受体包括能够结合抗原的抗原结合部分。在一些实例中，联合治疗剂包括抗CD20抗体。

在一些情况下，工程化免疫细胞可以包括本文公开的异源细胞因子(例如IL-15)和以下的一种或两种：(ii)用于增强的CD16信号传导的CD16变体，和(iii)包括抗原结合部分的嵌合多肽受体。

在一些情况下，工程化免疫细胞可以包括用于增强的CD16信号传导的CD16变体和以下的一种或两种：(i)异源细胞因子(例如，IL-15)，和(iii)包括抗原结合部分的嵌合多肽受体。

在一些情况下，工程化免疫细胞可以包括嵌合多肽受体，该嵌合多肽受体包括抗原结合部分和以下的一种或两种：(i)异源细胞因子(例如IL-15)，和(ii)用于增强的CD16信号传导的CD16变体。

联合治疗剂的非限制性实例可以包括：细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制剂、用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂，例如，抗CD20抗体、抗PD1抗体(例如派姆单抗)血小板衍生的生长因子抑制剂(例如GLEEVEC

术语“细胞毒性剂”通常是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。细胞毒性剂的非限制性实例可以包括：放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂如甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂、酶及其片段(例如溶核酶)、抗生素和毒素(例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)。

化疗剂的非限制性实例可以包括：烷基化剂，例如噻替呱和

化疗剂的实例还可以包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用为调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用，并且通常呈全身性形式，或全身治疗。它们本身可能就是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括，例如他莫昔芬(包括

化疗治疗剂的实例还可以包括抗体，例如阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(

化疗剂的实例还可以包括“酪氨酸激酶抑制剂”，例如EGFR靶向剂(例如小分子、抗体等)；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，例如TAK165(可获得自Takeda)；CP-724,714(ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双重HER抑制剂，如优先结合EGFR但抑制过表达HER2和EGFR两者的细胞的EKB-569(可获得自Wyeth)；拉帕替尼(GSK572016；可获得自Glaxo-SmithKline)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可获得自Novartis)；泛HER抑制剂，如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，如抑制Raf-1信号传导的反义试剂ISIS-5132(可获得自ISIS Pharmaceuticals)；非HER靶向的TK抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(

化疗剂的实例还可以包括：地塞米松、干扰素、秋水仙碱、氯苯氨啶、环孢菌素、两性霉素、甲硝唑、阿仑单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、氨磷汀、三氧化二砷、天冬酰胺酶、活BCG、贝伐单抗(bevacuzimab)、贝沙罗汀(bexarotene)、克拉屈滨、氯法拉滨、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、地尼白细胞介素(denileukin)、右丙亚胺、阿法依伯汀(epoetinalfa)、埃洛替尼(elotinib)、非格司亭(filgrastim)、醋酸组氨瑞林、替伊莫单抗(ibritumomab)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、来那度胺、左旋咪唑、美司钠、甲氧沙林、诺龙、奈拉滨、诺非单抗(nofetumomab)、奥普瑞白细胞介素、帕利弗明、帕米膦酸盐、培加酶、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠、普卡霉素、卟吩姆钠、奎纳克林、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、唑来膦酸盐和唑来膦酸、及其药学上可接受的盐。

化疗剂的实例还可以包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、新戊酸替可的松、曲安奈德、去炎松醇(triamcinolone alcohol)、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟新诺龙酯、肤轻松、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸盐、氢化可的松-17-戊酸盐、氯米松二丙酸盐(aclometasonedipropionate)、倍他米松戊酸盐、倍他米松二丙酸盐、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸盐、氯倍他索-17-丙酸盐、氟可龙己酸盐、氟可龙新戊酸盐和氟泼尼定醋酸盐：免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，例如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(IMULANBioTherapeutics,LLC)；抗风湿药，如咪唑硫嘌呤、环孢素(环孢霉素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、来氟米诺环素(leflunomideminocycline)、柳氮磺吡啶、肿瘤坏死因数α(TNFα)阻滞剂(例如依那西普

术语“生长抑制剂”通常是指在体外或体内抑制细胞(例如，其生长依赖于PD-L1表达的细胞)的生长和/或增殖的化合物或组合物。生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的抑制剂。生长抑制剂的非限制性实例包括阻断细胞周期进程(在S期以外的地方)的药剂，例如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻滞剂包括长春花类(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂，例如蒽环类抗生素多柔比星((8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧基-α-L-来苏糖基-六吡喃糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰)-1-甲氧基-5,12-萘并萘二酮)、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。那些阻滞G1的药剂也溢出到S期阻滞中，例如DNA烷化剂，例如他莫昔芬、泼尼松、达喀尔巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷(Ara-C)。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是来源于紫杉的抗癌药。多西他赛(

H.使用方法

可使用(例如施用)本公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)以治疗有需要的对象。对象可以患有或可以怀疑患有病况诸如疾病(例如，癌症、肿瘤、组织变性、纤维化等)。可以从对象获得细胞(例如，干细胞或定型成年细胞)，并且可以将这种细胞离体培养并进行基因修饰以产生本文所公开的任何对象工程化免疫细胞(例如任何工程化NK细胞)。随后，可以将工程化免疫细胞施用于对象以进行适应性免疫治疗。

可以使用至少或至多约1个剂量、至少或至多约2个剂量、至少或至多约3个剂量、至少或至多约4个剂量、至少或至多约5个剂量、至少或至多约6个剂量、至少或至多约7个剂量、至少或至多约8个剂量、至少或至多约9个剂量，或至少或至多约10个剂量的本公开的工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)的群体对对象进行治疗(例如施用)。

在一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括：(a)从对象获得细胞；和(b)从细胞产生本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)。在一些情况下，从对象获得的细胞是ESC。在一些情况下，将从对象获得的细胞(例如成纤维细胞，例如成人皮肤成纤维细胞)修饰并转化为iPSC。

在一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括向有需要的对象施用包括本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)的NK细胞群体。在一些情况下，该方法可以进一步包括向对象施用联合治疗剂(例如，化疗剂、抗CD20抗体等)。

在一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括向有需要的对象施用本文公开的任何一种组合物。在一些情况下，组合物可以包括(i)本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如工程化NK细胞)，和(ii)联合治疗剂(例如化疗剂、抗CD20抗体等)。

本文公开的任何一种方法可以用于治疗对象的靶细胞、靶组织、目标病况或目标疾病。

目标疾病可以是病毒、细菌和/或寄生虫感染；炎性和/或自身免疫性疾病；或赘生物，例如癌症和/或肿瘤。

靶细胞可以是病变细胞。病变细胞可能具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。病变细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和凋亡细胞。病变细胞可以是来自患病对象的细胞。示例性疾病可以包括血液病症、癌症、代谢病症、眼睛病症、器官病症、肌肉骨骼病症、心脏病等。

可以使用本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)杀死多种靶细胞。靶细胞可以包括多种细胞类型。靶细胞可以是体外的。靶细胞可以是体内的。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养物中的细胞。靶细胞可以是细胞集合之一。靶细胞可以是哺乳动物细胞或衍生自哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或衍生自啮齿动物细胞。靶细胞可以是人类细胞或衍生自人类细胞。靶细胞可以是原核细胞或衍生自原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以衍生自细菌细胞。靶细胞可以是古细菌细胞或衍生自古细菌细胞。靶细胞可以是真核细胞或衍生自真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或衍生自植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或衍生自动物细胞。靶细胞可以是无脊椎动物细胞或衍生自无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或衍生自脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或衍生自微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或衍生自真菌细胞。靶细胞可以来自特定的器官或组织。

靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可以包括干细胞(例如成体干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可以包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可以包括细胞的后代。靶细胞可以包括靶核酸。靶细胞可以在活生物体中。靶细胞可以是基因修饰的细胞。靶细胞可以是宿主细胞。

靶细胞可以是全能干细胞，然而，在本公开的一些实施方案中，可以使用术语“细胞”，但是可以不表示全能干细胞。靶细胞可以是植物细胞，但在本公开的一些实施方案中，可以使用术语“细胞”，但是可以不表示植物细胞。靶细胞可以是多能细胞。例如，靶细胞可以是多能造血细胞，其可以分化为造血细胞谱系中的其它细胞，但是可能不能分化为任何其它非造血细胞。靶细胞可能能够发育成整个生物体。靶细胞可能能够或可能无法发育成整个生物体。靶细胞可以是整个生物体。

靶细胞可以是原代细胞。例如，原代细胞的培养物可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。细胞可以是单细胞生物。细胞可以在培养中生长。

靶细胞可以是病变细胞。病变细胞可能具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。病变细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和凋亡细胞。病变细胞可以是来自患病对象的细胞。示例性疾病可以包括血液病症、癌症、代谢病症、眼睛病症、器官病症、肌肉骨骼病症、心脏病等。

如果靶细胞是原代细胞，则可以通过任何方法从个体收获它们。例如，白细胞可以通过单采、白细胞单采、密度梯度分离等来收获。来自组织例如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、肠、胃等的细胞可以通过活组织检查来收获。可以使用适当的溶液来分散或悬浮收获的细胞。这样的溶液通常可以是平衡盐溶液(例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank氏平衡盐溶液等)，方便地补充有胎牛血清或其它天然存在的因子和低浓度的可接受的缓冲液。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可以被立即使用，或者可以将它们储存(例如通过冷冻)。冷冻的细胞可以被解冻，并且能够被重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如10％ DMSO、50％血清、40％缓冲的培养基)中和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其它此类普通溶液中。

可以是靶细胞的细胞的非限制性实例包括但不限于：淋巴样细胞，例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、辅助T细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞(参见例如US20080241194)；髓样细胞，例如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多叶核中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、巨细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞和垂体(促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素分泌细胞、促甲状腺细胞、促生长激素细胞、催乳激素分泌细胞)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏(肝细胞、枯否细胞)、软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞，包括成软骨母细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括丝胞(Trichocyte)、角质形成细胞、黑素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足细胞、肾小球旁细胞、肾小球内系膜细胞/肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、塞尔托利细胞、睾丸间质细胞、卵子；和其它细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞、表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛轴细胞、皮质毛轴细胞、表皮毛轴细胞、表皮毛根鞘细胞、赫胥黎层毛根鞘细胞、亨勒层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞(干细胞)、湿分层屏障上皮细胞、(角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远程和阴道的)分层鳞状上皮的表面上皮细胞、(角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远程和阴道的)上皮的基底细胞(干细胞)、尿道上皮细胞(内衬在膀胱和尿道内)、外分泌上皮细胞、唾液腺黏液细胞(富含多糖的分泌物)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌物)、舌中的冯·埃布纳腺细胞(味蕾洗液)、乳腺细胞(乳汁分泌物)、泪腺细胞(泪液分泌物)、耳中的耵聍腺细胞(蜡分泌物)、小汗腺暗细胞(糖蛋白分泌物)、小汗腺透明细胞(小分子分泌物)、顶泌汗腺细胞(有气味的分泌物，对性激素敏感)、眼睑莫耳腺细胞(特化的汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌物)、鼻鲍曼腺细胞(嗅上皮洗液)、十二指肠布鲁纳腺细胞(酶和碱性黏液)、精囊细胞(分泌精液成分，包括用于精子泳动的果糖)、前列腺细胞(分泌精液成分)、尿道球腺细胞(黏液分泌物)、前庭大腺细胞(阴道润滑物分泌物)、利特雷氏腺细胞(黏液分泌物)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌物)、呼吸道和消化道的分离的杯状细胞(黏液分泌物)、胃黏膜黏液细胞(黏液分泌物)、胃腺酶原细胞(胃蛋白酶原分泌物)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌物)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌物)、小肠潘氏细胞(溶菌酶分泌物)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌物)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、催乳素激素分泌细胞、促甲状腺激素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、垂体中叶细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、卵泡内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒黄体细胞、泡膜黄体细胞、肾小球旁细胞(肾素分泌物)、肾脏的致密斑细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾脏、I型肺细胞(肺内衬空气空间)、胰管细胞(泡心细胞)、(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非横纹导管细胞、(精囊、前列腺等的)导管细胞、封闭内部体腔的上皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(红细胞)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨骼中)、树突细胞(淋巴组织中)、小胶质细胞(中枢神经系统中)、血液和免疫系统(各种类型)的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、干细胞和定型祖细胞、多能干细胞、全能干细胞、诱导的多能干细胞、成体干细胞、感觉传感器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞干细胞)、精子、哺育细胞、卵泡细胞、塞尔托利细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。

特别感兴趣的是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。癌细胞的非限制性实例包括癌细胞，所述癌包括：棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性成髓细胞白血病伴成熟、急性髓性树突状细胞白血病、急性髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质上皮瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、未分化甲状腺癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤样横纹肌瘤、基底细胞癌、基底样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝里尼管癌、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、布伦纳瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶未知的癌(cancer)、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶未知的癌(carcinoma)、癌肉瘤、巨大淋巴结增生症、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性中性粒细胞白血病、透明细胞肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、德戈斯病、隆突性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、增生性小圆形细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、胚胎癌、内膜窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳腺外佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节细胞瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、生殖细胞瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞瘤、多形胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、脑胶质瘤、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺母细胞瘤、颗粒细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合症、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽喉癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型骨髓单核细胞白血病、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肾脏癌、克拉特斯金瘤、克鲁肯伯格瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣性黑素瘤、白血病、白血病、嘴唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘瘤、恶性横纹肌瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合性苗勒氏瘤、单核细胞白血病、口腔癌、黏液性肿瘤、多发性内分泌腺瘤综合症、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、蕈样真菌病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合症、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、黏液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、肿瘤、神经元瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤、少突星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周围上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体中分化实质肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚胎瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假黏液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及第15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性腺瘤、支援-间质细胞肿瘤、性索基质细胞瘤、Sezary综合症、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆形细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩散性黑色素瘤、幕上原始性神经外胚层肿瘤、表面上皮间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性成淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞性白血病、畸胎瘤、末期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖道肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、Verner Morrison综合症、疣状癌、视觉通路胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、Warthin肿瘤、Wilms肿瘤及其组合。在一些实施方案中，靶向的癌细胞代表癌细胞群内的亚群，例如癌症干细胞。在一些实施方案中，该癌症是造血谱系的，例如淋巴瘤。抗原可以是肿瘤相关抗原。

在一些情况下，本文公开的靶细胞(例如，B细胞)是与自身免疫疾病有关或被怀疑与自身免疫疾病有关。用本公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)治疗的对象可以患有或可以怀疑患有自身免疫疾病。

自身免疫性疾病的非限制性实例可以包括：急性弥漫性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑白质炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗体介导的移植排斥、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合症(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴洛病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、巨大淋巴结增生症、乳糜泻、恰加斯病、慢性疲劳综合症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合症、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩病、Cogans综合症、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST病、特发性混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德勒斯勒综合症、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊万斯综合症、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、肺出血-肾炎综合症、肉芽肿伴多血管炎(GPA)、格雷夫斯病、格林-巴利综合症、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、高丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关的硬化性疾病、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、炎症性肠病、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病、川崎综合症、兰伯特-伊顿综合症、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病、美尼尔病、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病(MCTD)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、穆伦溃疡、Mucha-Habermann病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic's)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌有关的小儿自身免疫性神经精神疾病)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕里·罗姆伯格综合症、帕森奇-特纳综合症、睫状体平坦部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合症、结节性多发炎、I型、II型和III型自身免疫性多腺综合症、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合症、心包切开术后综合症、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯红细胞再生障碍性贫血、雷诺现象、反射性交感神经营养不良、赖特氏综合症、复发性多软骨炎、不安腿综合症、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合症、巩膜炎、硬皮病、干燥综合症、精子和睾丸自身免疫、僵硬人综合症、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合症、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合症、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化的结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱大疱性皮肤病、白癜风、华氏巨球蛋白血症(WM)和韦格纳肉芽肿(肉芽肿伴多血管炎(GPA))。

在一些情况下，自身免疫性疾病包括选自包括以下成员的组中的一个或多个成员：类风湿关节炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(狼疮或SLE)、重症肌无力、多发性硬化症、硬皮病、艾迪生氏病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、Guillain-Barré综合症、干燥综合症、皮肌炎、血栓性血小板减少性紫癜、高丙种球蛋白血症、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症(WM)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)、桥本脑病(HE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、韦格纳肉芽肿病和抗体介导的移植排斥(例如，用于组织移植，例如肾脏移植)。在实例中，自身免疫性疾病可以是1型糖尿病、狼疮或类风湿性关节炎。

在一些情况下，目标疾病是急性髓性白血病(AML)。例如，可以将本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)施用于有需要的对象以治疗AML，该工程化免疫细胞包括以下中的一种或多种：(i)包括能够与本文公开的抗原(例如，CD33)结合的抗原结合结构域的嵌合多肽受体，(ii)本文公开的异源细胞因子(例如，IL-15)，和(iii)本文公开的用于增强的CD16信号传导的CD16变体。

在一些情况下，目标疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

在一些情况下，目标疾病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

在一些情况下，目标疾病是B细胞白血病(BCL)。例如，可以将本文公开的任何一种工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)施用于有需要的对象以治疗BCL，该工程化免疫细胞包括以下中的一种或多种：(i)本文公开的包括能够结合CD19的抗原结合结构域的嵌合多肽受体，(ii)本文公开的异源细胞因子(例如，IL-15)，和(iii)本文公开的用于增强的CD16信号传导的CD16变体。

在一些情况下，目标疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)。

在一些情况下，靶细胞形成肿瘤(即实体瘤)。用本文的方法治疗的肿瘤可导致稳定的肿瘤生长(例如，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，和/或不转移)。在一些情况下，肿瘤得以保持稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周。在一些情况下，肿瘤得以保持稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在一些情况下，肿瘤得以保持稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在一些情况下，肿瘤的大小或肿瘤细胞的数量减少至少约5％、10％、15％、20％、25、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些情况下，肿瘤被完全消除或减少到低于检测水平。在一些情况下，对象在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周保持无肿瘤(例如处于缓解期)。在一些情况下，对象在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多月保持无肿瘤。在一些情况下，对象在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年保持无肿瘤。

实施例

实施例1：工程化NK细胞

表1示出了具有或不具有基因修饰的工程化NK细胞，以及可能的功能和治疗适应症的示例。治疗适应症的示例可以包含急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合症(MDS)、B细胞白血病、T细胞白血病、实体瘤和血癌。

表1

实施例3：增强的CD16信号传导

为了改善适应性免疫疗法，可以将NK细胞工程化以表现出增强的CD16信号传导。

示例性hnCD16氨基酸序列：

SEQ ID NO.1:

MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK

SEQ ID NO.23

MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFVIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVPTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK

工程化NK细胞：

将NK92细胞工程化以表现出增强的CD16信号传导。将工程化NK92细胞修饰以表达CD64/CD16A融合蛋白(SEQ ID NO.1)和CD16变体(SEQ ID NO.24)(即hnCD16)。

通过使用荧光激活细胞分选(FACS)鉴定CD16(例如，通过抗CD16-PE抗体)和CD64(例如，通过抗CD64-APC/AF700抗体)二者的增强表达来验证所得的hnCD16 NK92细胞，如图1A所示。野生型(WT)NK92细胞用作对照。

hnCD16构建体序列可包含“FHVS”(SEQ ID NO.2)。hnCD16构建体序列可包含“WFHVS”(SEQ ID NO.3)。hnCD16构建体序列可包含“FHVSF”(SEQ ID NO.4)。hnCD16构建体序列可包含“WFHVSF”(SEQ ID NO.5)。hnCD16构建体序列可包含“VWFHVSFC”(SEQ IDNO.6)。hnCD16构建体序列可包含“PVWFHVSFCL”(SEQ ID NO.7)。hnCD16构建体序列可包含“TPVWFHVSFCLV”(SEQ ID NO.8)。

增强的靶向：

将hnCD16 Nk92细胞单独培养(未受刺激的，对照)，或在能够激活NK细胞的K562细胞(K562)或佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)存在下培养以激活CD16并诱导其切割。数据显示，与作为对照的外周血(PB)NK细胞相比，hnCD16 NK92细胞对激活诱导的CD16a的切割具有高度抗性(图1B)。例如，对于hnCD16 NK92细胞，用PMA处理将CD16+细胞的百分比从92％略微降低到85％，而相同的处理将CD16+细胞的百分比从96％降低到25％(图1B)。使用抗-CD64抗体也证实了hnCD16在hnCD16 NK92细胞中的持久性(图1C)。另外，观察到hnCD16 NK92细胞在(例如K652或PMA)刺激时并未下调内源性CD16表达(图1D和图1E)。

增强的抗体联合治疗

用(i)hnCD16 NK92细胞和(ii)抗CD20抗体或hIgG作为对照处理靶细胞(Raji细胞)。数据显示，与对照(例如，带有抗CD20抗体的野生型NK92细胞，或带有hIgG的hnCD16NK92细胞)相比，hnCD16 NK92细胞与抗CD20抗体联合诱导靶细胞的死亡增加(例如，至少部分由ADCC介导的死亡)(图1F和图1G)。

实施例4：NK细胞的增强的存活率和持久性

为了提高适应性免疫疗法的持久性，可以将NK细胞工程化以包含至少(i)异源转录因子(例如STAT)和(ii)内源性细胞因子受体(例如内源性IL受体，例如IL-17R)的降低的表达或活性。与仅具有(i)和(ii)之一或都不具有的情况相比，在工程化NK细胞中具有(i)和(ii)的组合可以协同地改善工程化NK细胞的持久性。

工程化NK细胞：

NK细胞由分离的ESC或iPSC产生。将NK细胞工程化以表达异源STAT(例如STAT3和/或STAT5B)。编码异源STAT的基因通过病毒转导或通过本文公开的基因编辑部分的作用而被掺入到NK细胞的基因组中。NK细胞也被工程化为表现出内源性IL-17R的降低的表达或活性(即STAT3+IL-17R-NK细胞)。将具有(i)异源STAT和(ii)IL-17R的降低的表达或活性之一的NK细胞或未工程化NK细胞用作对照。

体外存活率和持久性：

在不存在外源细胞因子的情况下，可以在体外培养工程化STAT3+IL-17R-NK细胞，以评估工程化STAT3+IL-17R-NK细胞的生存力和生长(或增殖能力)。将NK细胞在不添加外源细胞因子的培养基中培养3-6周。与对照细胞相比，工程化STAT3+IL-17R-NK细胞表现出明显更高的NK细胞数量，表明工程化STAT3+IL-17R-NK细胞在体外具有增强的存活率和持久性。

体内药代动力学(PK)：

可以在具有Raji异种移植模型的NCG小鼠中施用工程化STAT3+IL-17R-NK细胞。NCG小鼠具有三重免疫缺陷，并且缺乏功能/成熟的T、B和NK细胞，并且具有降低的巨噬细胞和树突状细胞功能以容纳异种移植模型。经由静脉内(IV)尾静脉注射将工程化STAT3+IL-17R-NK细胞和对照细胞分别施用到各自的Raji异种移植模型小鼠，每只动物约1×106个细胞的剂量。从输注后约7天到约28天，注射有工程化STAT3+IL-17R-NK细胞的小鼠在外周血中显示较高的NK细胞浓度，表明工程化STAT3+IL-17R-NK细胞的增强的体内存活率和持久性。

实施例5：工程化抗CD19 NK细胞

将NK92细胞工程化以表达抗CD19 CAR，然后在CD19+Raji细胞存在下培养，以评估工程化抗CD19 NK细胞对Raji细胞的靶向作用。野生型(WT)NK92细胞用作对照。与对照相比，抗CD19 CAR NK细胞对Raji细胞表现出增强的细胞毒性(如通过减少数量的存活Raji细胞确定的)(图2A和图2B)。此外，当在Raji细胞存在下培养时，与对照相比，抗CD19 CAR NK细胞表现出内源性CD107a的增强的表达(指示细胞毒性颗粒释放)(图2C和图2D)。此外，当在Raji细胞存在下培养时，与对照相比，抗CD19 CAR NK细胞表现出增强的细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或TNF-α产生)(图2E-2G)。

实施例6：工程化hIL15 NK细胞

工程化NK细胞：

用(i)hIL-15敲入或(ii)hIL-15-hIL15R融合多肽敲入而将NK92细胞工程化。测试了hIL-15-hIL15R融合多肽的两种变体。第一变体(即，hIL15-IL15Ra融合型-1或“fus1”)被设计为具有在hIL-15和hIL15R之间的接头，该接头包含一个或更多个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个重复)“GGGGS”(SEQ ID NO.9)，例如“GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS”(SEQ ID NO.10)。第二变体(即，hIL15-IL15Ra融合型-2或“fus2”)被设计为具有在hIL-15和hIL15R之间的接头，该接头包含一个或更多个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个重复)“GGGGS”(SEQ ID NO.9)和一个或更多个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个重复)“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO.11)，例如“EGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGS”(SEQ IDNO.12)。敲入hIL-15-hIL15R融合多肽变体中的任一个的NK92细胞对hIL-15呈阳性(图3A)。

另外，与工程化表达IL-15分泌形式的对照NK92细胞相比，表达用于增强的IL-15信号传导的hIL-15-hIL15R融合多肽的任一种变体的工程化NK92细胞表现出更长的持久性。蛋白质印迹分析显示，与分泌型IL-15(IL15)相比，在表达hIL15-IL15Ra融合型-1(fus1)或hIL15-IL15Ra融合型-2(fus2)的NK92细胞中，IL-15刺激的STAT5的增加的磷酸化(图3B)。

hIL15-IL15Ra融合型-1序列(SEQ ID NO.13)：

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL

hIL15-IL15Ra融合型-2序列(SEQ ID NO.14)：

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGGGSGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL

实施例7：体外aCD19-CAR、hnCD16和IL-15的功能分析

aCD19-CAR

如图4A所示，设计了包含人源化抗CD19 scFv、人CD8a铰链、CD8a跨膜结构域、2B4共刺激和CD3ζ信号传导结构域的aCD19-CAR，其中在aCD19-CAR中使用的抗CD19 scFv的VH和VL序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示。在一些情况下，SEQ ID NO.16在本文中可称为1型抗CD19重链可变区。在一些情况下，SEQ ID NO.17在本文中可称为1型抗CD19轻链可变区。

将NK92细胞工程化以表达aCD19-CAR，然后在K562(CD19阴性)和K562-CD19(CD19阳性)细胞的存在下培养以评估工程化aCD19-CAR NK细胞对K562-CD19细胞的靶向。野生型(WT)NK92细胞用作对照。

图6A中的FACS分析示出了在NK-CAR NK92细胞的细胞表面处的aCD19-CAR的表达。图6B示出了aCD19-CAR NK92细胞显示出在0.2:1和1:1的效应物:靶(E:T)比率下对K562-CD19细胞的CD19抗原特异性杀伤。图6C示出了在0.2:1和1:1的E:T比下，与WT-NK92细胞相比，aCD19-CAR NK92细胞在K562-CD19细胞的抗原特异性刺激时显示出更高的IFN-γ产生。(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，且****表示P<0.0001(学生t检验))。

hnCD16

如图4B所示，设计了具有F158V和S197P突变的人CD16变体的hnCD16(SEQ IDNO.23)。然后，将NK92细胞工程化以表达hnCD16以增强CD16信号传导。所得的NK92细胞对激活诱导的CD16a切割具有高度抗性，并且对表达CD19的Raji细胞具有优异的体外ADCC。

具体地，如图7A所示，FACS分析示出了在NK92细胞的细胞表面处hnCD16(具有F158V和S197P突变的人CD16变体)的表达。图7B示出了表达hnCD16的NK92细胞对激活诱导的CD16a切割的高度抗性，并且PMA/离子霉素被用作刺激的阳性对照。图7C示出了在不同的E:T比率下，表达hnCD16的NK92细胞显示出对表达CD19的Raji细胞的优异的体外ADCC。

IL-15

图4C示例性地示出了包含IL-15和IL15受体的示为IL-15-RF(膜结合型异源IL-15)的设计。将NK92细胞工程化以表达IL-15-RF(如实施例6中所述的hIL15-IL15Ra融合型-1，SEQ ID No.13)。

如图8A所示，IL-15-RF被表达并锚定在NK92细胞表面上。图8B中的蛋白质印迹分析结果还示出了IL-15刺激的STAT5和STAT3的增强的磷酸化，表明在表达IL-15-RF和分泌型IL-15(SEQ ID NO.24)的NK92细胞中IL-15下游途径的激活。加入外源性IL-15的WT NK92细胞用作阳性对照。

实施例8：包含aCD19-CAR、hnCD16和IL-15RF的NK-019构建体的设计，以及NK-019构建体在NK92细胞中的表达。

包含aCD19-CAR、hnCD16和IL-15的NK-019构建体的示例性设计如图5A所示。然后，用三种不同的NK-019构建体转染NK92细胞：

(1)包含aCD19-CAR、hnCD16和分泌型IL-15(SEQ ID No.25)的NK-019w、NK-019构建体；

(2)NK-019wf1：包含aCD19-CAR、hnCD16和hIL15-IL15Ra融合型-1(SEQ ID No.13)的NK-019构建体；

(3)NK-019wf2：包含aCD19-CAR、hnCD16和hIL15-IL15Ra融合型-2(SEQ ID No.14)的NK-019构建体。

转染后，通过FAC分别检测NK92细胞中的aCD19-CAR、hnCD16和IL-15组分的表达。如图9所示，NK019构建体的aCD19-CAR、hnCD16和IL-15组分同时成功地在NK92细胞上表达。

实施例9：表达NK-019的NK细胞对表达CD19的靶细胞的功效。

在功效测定中，将K562(CD19阴性)和K562-CD19(CD19阳性)细胞用作靶细胞。

特别地，用NK-019w、NK-019wf1和NK-019wf2转染NK92细胞，然后在K562(CD19阴性)和K562-CD19(CD19阳性)细胞的存在下培养以评估工程化NK细胞对K562-CD19细胞的靶向。野生型(WT)NK92细胞用作对照。如图10所示，用不同的NK-019构建体转染的NK92细胞全部显示出对K562-CD19细胞的hCD19-抗原特异性细胞溶解能力，其中用NK-019w转染的NK92细胞显示出最高的细胞溶解活性。

此外，如图11A所示，当在K562细胞存在下培养时，与对照相比，用NK-019w、NK-019wf1和NK-019wf2转染的NK92细胞表现出增强的内源性CD107a的表达，表明NK细胞的细胞毒性颗粒释放。此外，如图11B所示，当在K562细胞存在下培养时，与对照相比，用NK-019w、NK-019wf1和NK-019wf2转染的NK92细胞表现出增强的IFN-γ产生。

实施例10：Raji NCG小鼠模型中NK-019NK92细胞的抗肿瘤活性。

在第-2天对NCG小鼠进行100cGy照射，并在第-1天静脉内注射表达荧光素酶的Raji-Luc细胞(5x105个细胞/小鼠)。在第0天，将小鼠分成五组，其中四组被静脉内(5x106个细胞/小鼠)注射NK92细胞、以及表达NK-019w(w-NK019-NK92)、NK-019wf1(wf1-NK019-NK92)和NK-019wf2(wf2-NK019-NK92)的NK92细胞，如图12A所示。

在第7天、第14天、第21天和第28天，通过体内成像观察并基于荧光强度分析小鼠中肿瘤细胞的扩增。如图12B和图12C所示，在第12天，表达NK-019w、NK-019wf1和NK-019wf2的NK92细胞显著地抑制了NCG小鼠中CD19阳性肿瘤的扩增，表明NK-019NK92细胞的体内抗肿瘤活性。

实施例11：NK-019在iPSC中的表达以及iPSC向iNK细胞的分化。

包含侧接PiggyBac转座子ITR的aCD19-CAR、hnCD16和IL-15的示例性NK-019构建体用作用于转基因整合的供体载体。如图13A和图13B所示，在基因编辑和克隆衍生之后，在iPSC单克隆的细胞表面检测aCD19-CAR、hnCD16和IL-15的表达。SSEA-4是iPSC的多能性标记物。图13A示出了SSEA-4在基因编辑的iPSC上的表达，表明编辑的iPSC细胞的多能性。

进一步评估了基因编辑的iPSC分化为iNK细胞的能力。如图14A所示，在第7天，表达NK-019w的iPSC分化为CD34+iHSC。在第34天，CD34+iHSC进一步分化为成熟的iNK细胞(CD45+和CD56+)，在细胞表面上始终表达aCD19-CAR、hnCD16和IL-15RF，如图14B所示。

实施例12：工程化OI42 NK细胞的功能分析。

iPSC衍生的工程化NK细胞

工程化NK细胞由iPSC产生，类似于实施例4和实施例11中所述。如图15所示，iPSC被工程化(例如，通过AAV、CSIPR-Cas9介导的插入进行转导)以包含(例如，表达)抗CD19CAR、用于增强的CD16信号传导的异源CD16变体(例如，hnCD16)和用于增强的IL-15信号传导的异源IL构建体(例如，IL-15RF)。随后，iPSC分化为HSC，并进一步分化为NK。在分化为NK细胞后，然后扩增NK细胞的培养物。在该实施例中，抗CD19 CAR包含具有本文公开的2型scFv的氨基酸序列的scFv(例如，SEQ ID NO.42)。

包含aCD19-CAR、hnCD16和IL-15RF的示例性OI42(QN-019a)构建体用作转基因整合的供体载体。OI42构建体通过CRISPR-Cas9介导的位点特异性插入而插入，并将转基因的一个拷贝插入iPSC基因组中。如图15所示，基因编辑后，第0天在iPSC细胞表面检测到aCD19-CAR、hnCD16和IL-15的表达。包含有SSEA-4作为iPSC的多能性标志物。如图15所示，基因编辑的iPSC表达SSEA-4，表明经编辑的iPSC细胞是多能的。此外，经编辑的iPSC表达了TRA-1-81表位，表明iPSC保持未分化状态。

进一步评估了基因编辑的iPSC分化为iNK细胞的能力。如图15所示，在第9天，表达OI42的iPSC分化为CD34+iHSC。在第27天，CD34+iHSC进一步分化为iNK细胞(CD56+)，其在细胞表面表达aCD-19-CAR。扩增7天后，所得扩增的NK细胞(CD56+)在细胞表面持续表达aCD19-CAR、hnCD16和IL-15RF，如图15所示。

表达OI42的NK细胞对表达CD19的靶细胞的功效

使用经标记的CD19抗体测量OI42(QN-019a)NK细胞的细胞表面上的aCD19-CAR表达水平。OI42 NK细胞和未修饰的脐带血NK细胞(CB-NK)在有或没有经标记的CD19抗体的情况下孵育。与经标记的CD19抗体一起孵育的OI42 NK细胞在所有测试条件下具有最高水平的CD19表达，如图16A所示，表明OI42 NK细胞表达CD19。

OI42 NK细胞在表达CD19的GFP+Nalm6细胞(图16B)或表达CD19的GFP+Raji细胞(图16C)的存在下以1:1的效应物:靶(E:T)比率培养。作为另外的对照，Nalm6和Raji细胞与CB-NK、未修饰的iNK细胞(QN-001)孵育或在没有任何NK细胞情况下孵育。添加OI42 NK细胞后，每3小时对共培养的细胞拍照，记录GFP信道的荧光面积值，并且通过荧光面积值计算靶细胞数。如图16B和图16C所示，OI42 NK细胞分别在Nalm6和Raji细胞中显示出最高的溶细胞活性。

此外，测试了受刺激的OI42 NK细胞的CD16表达水平。OI42(QN-019a)NK细胞、QN-001和CB-NK细胞在不同刺激条件下刺激4小时，并测量细胞表面上CD16表达的水平。包含的刺激条件是：未刺激的细胞、与Raji细胞+IgG共培养、与Raji细胞+抗CD20抗体共培养、与K562细胞共培养和用单迭氮丙啶(PMA)/离子霉素刺激。然后通过将刺激后CD16阳性细胞的百分比除以未刺激的CD16+NK细胞的百分比来计算CD16+NK细胞的百分比。在所有测试的刺激条件下，OI42 NK细胞在细胞表面上显示一致的CD16表达，如图17所示。

OI42 NK细胞激活信号通路的功效

在OI42 NK(QN-019a)和QN-001细胞中测量磷酸化的STAT5(p-STAT5)的水平。OI42NK细胞和QN-001细胞在有或没有IL-2的情况下孵育24小时，然后测量p-STAT5的水平。此外，作为阴性对照，细胞可替代地与同种型而不是针对p-STAT5的抗体一起孵育。如图18A和图18B所示，在添加或不添加IL-2的情况，OI42 NK细胞都能够一致地表达p-STAT5水平。

OI42细胞单次和连续杀伤肿瘤细胞的功效

测试了OI42细胞单次和多次连续裂解肿瘤细胞的能力。对于单次杀伤，OI42(QN-019a)NK细胞与GFP+Nalm6细胞以1:1的E:T比率孵育，每3小时拍摄一次共培养细胞的照片，并且记录GFP信道的荧光面积值。阴性对照条件包括：Nalm6细胞单独培养、CB-NK细胞与Nalm6细胞一起培养和QN-001细胞与Nalm6细胞一起培养。如图19A所示，OI42 NK细胞在Nalm6细胞中表现出最高的溶细胞活性。

为了研究OI42 NK细胞在Nalm6细胞中的连续杀伤能力，将OI42 NK细胞与GFP+Nalm6细胞以1:1的E:T比率孵育。每24小时，将新的肿瘤细胞添加到裂解系统中。共培养期间，每3小时拍照，记录GFP信道的荧光面积值，并且通过荧光面积值计算靶细胞数。如图19B所示，OI42 NK细胞在每次添加新肿瘤细胞时在Nalm6细胞中显示出最高的溶细胞能力。

OI42 NK细胞单次和多次连续裂解肿瘤细胞的功效也在Raji细胞中进行了测试。对于单次杀伤，OI42(QN-019a)NK细胞与GFP+Raji细胞以3:1的E:T比率孵育，每3小时拍摄一次共培养细胞的照片，并且记录GFP信道的荧光面积值。阴性对照条件包括：Raji细胞单独培养、CB-NK细胞与Raji细胞一起培养和QN-001细胞与Raji细胞一起培养。如图20A所示，OI42 NK细胞在Raji细胞中表现出最高的溶细胞活性。

为了研究OI42 NK细胞在Raji细胞中的连续杀伤能力，将OI42NK细胞与GFP+Raji细胞以3:1的E:T比率孵育。每24小时，将新的肿瘤细胞添加到裂解系统中。共培养期间，每3小时拍照，记录GFP信道的荧光面积值，并且通过荧光面积值计算靶细胞数。如图20B所示，OI42 NK细胞在每次添加新肿瘤细胞时在Raji细胞中显示出最高的溶细胞能力。

Nalm6 NOG小鼠模型中OI42 NK细胞的抗肿瘤活性

如图21A所示，在第-1天给NOG小鼠静脉注射1x105个表达荧光素酶的Nalm6细胞。在第0、3和6天，给小鼠静脉注射1x107个CB-NK细胞或OI42(QN-019a)NK细胞。包括另外的阴性对照组，该对照组不向小鼠引入任何异源NK细胞。从第0-7天，每天一次给予小鼠1μg每只小鼠(/小鼠)的IL-15。从第0-21天，每2-3天给予小鼠100,000IU/小鼠的IL-2。每周一次使用体内成像系统(IVIS)对小鼠进行成像。如图21B所示，IVIS成像时间过程(第7、14、18天)的量化显示OI42 NK细胞有效抑制小鼠中的肿瘤生长。当生成肿瘤负荷曲线时，如图21C所示，OI42(QN-019a)NK细胞组显示的肿瘤荧光值低于仅CB-NK和Nalm6(肿瘤)组。

OI42 NK细胞的染色体分析

使用G带中期细胞进行核型表征，如图22所示。共扫描了2张图像并分析了50个细胞。数据显示OI42(QN-019a)NK细胞染色体数等于46。性染色体由两条X染色体组成，与女性的核型相匹配。未发现OI42 NK细胞的明显染色体异常。

实施例13：OI42 NK细胞的致瘤性。

小鼠可以皮下注射肿瘤细胞或OI42(QN-019a)NK细胞。注射后可监测小鼠数月。可以监测小鼠的体重并且可以计算体重的变化。可以监测和测量每只经注射的小鼠的肿瘤体积。可以从小鼠中取出病理样本以对组织的部分进行染色和成像。

实施例14：工程化KB15 NK细胞的功能分析。

iPSC衍生的工程化NK细胞

工程化NK细胞由iPSC产生，类似于实施例4和实施例11中所述。iPSC被工程化(例如，通过AAV、CRSIPR-Cas9介导的插入进行转导)以包含(例如，表达)抗CD19 CAR、用于增强的CD16信号传导的异源CD16变体(例如，hnCD16)和用于增强的IL-15信号传导的异源IL构建体(例如，IL-15RF)。随后，iPSC分化为HSC，并进一步分化为NK。在分化为NK细胞后，然后扩增NK细胞的培养物。在该实施例中，抗CD19 CAR包含具有本文公开的3型scFv的氨基酸序列的scFv(例如，SEQ ID NO.45、47)。

包含aCD19-CAR、hnCD16和IL-15RF的示例性KB15(QN-019)构建体用作转基因整合的供体载体。通过PiggyBac介导的转基因随机插入来将KB15构建体插入，并将转基因的四个拷贝插入iPSC基因组。KB15+iPSC分化为CD34+iHSC，然后进一步分化为CD56+iNK细胞。将iNK细胞扩增7天。

表达KB15的NK细胞对表达CD19的靶细胞的功效

KB15 NK细胞、QN-001细胞或CB-NK细胞用不同的肿瘤细胞或试剂刺激4小时。包括的不同刺激条件是：未刺激、与Raji细胞培养、与Raji细胞+抗CD20抗体培养、与K562细胞培养和用PMA/离子霉素刺激。用PMA/离子霉素刺激作为CD16从细胞膜裂解的阳性对照。如图23所示，在所有测试的刺激条件下，hnCD16转基因在KB15 NK细胞中稳定表达。

为了测试KB15 NK细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)裂解肿瘤细胞的能力，首先将GFP+Raji细胞与利妥昔单抗(抗CD20抗体)在4℃孵育1小时。然后将利妥昔单抗洗掉，并将效应细胞(KB15、QN-001或CB-NK)以0.3:1的E:T比率添加到相应的孔中。阴性对照包括未与利妥昔单抗孵育且未添加效应细胞的Raji细胞和与利妥昔单抗孵育且未添加效应细胞的Raji细胞。每三个小时拍摄一次图像，总共48小时。通过计算成像时间过程中绿色荧光强度的面积来评估效应细胞的杀伤能力。如图24所示，KB15 NK细胞，在或不在预先的利妥昔单抗孵育的情况下，在Raji细胞中都显示出最高的溶细胞活性。

KB15 NK细胞激活信号传导通路的功效

在KB15 NK细胞和QN-001细胞中测量磷酸化的STAT5(p-STAT5)的水平。KB15 NK细胞和QN-001细胞在有或没有IL-2的情况下孵育24小时，然后测量p-STAT5的水平。此外，作为阴性对照，细胞可替代地与同种型而不是针对p-STAT5的抗体一起孵育。如图25A和图25B所示，在添加或不添加IL-2的情况下，KB15 NK细胞都能够一致地表达p-STAT5水平。

KB15 NK细胞在Raji肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性

如图26A所示，在第0天给NOG小鼠静脉注射1x105个表达荧光素酶的Raji细胞。在第0、3和6天，给小鼠静脉注射1x107个KB15 NK细胞。包括另外的阴性对照组，该对照组不向小鼠引入任何异源NK细胞。从第0-7天，每天一次给予小鼠1μg/小鼠的IL-15。从第0-21天，每2-3天给予小鼠100,000IU/小鼠的IL-2。每周一次使用体内成像系统(IVIS)对小鼠进行成像。如图26B所示，IVIS成像时间过程(第5、8、14和20天)的量化显示KB15 NK细胞有效抑制小鼠中的肿瘤生长。当生成肿瘤负荷曲线时，如图26C所示，KB15 NK细胞组显示的肿瘤荧光值低于仅Raji(肿瘤)组。

KB15 NK细胞的染色体分析

使用G带中期细胞进行核型表征，如图27所示。共扫描了252张图像并分析了50个细胞。数据显示KB15 NK细胞染色体数等于46。性染色体由两条X染色体组成，与女性的核型相匹配。未发现KB15 NK细胞的明显染色体异常。

KB15 NK细胞的体外生长分析

KB15 NK细胞和QN-001细胞在有或没有外源性IL-2(200U/ml)的情况下培养。每3-4天一次计数细胞数，用于评估细胞生长和细胞死亡。如图28所示，当与或不与IL-2一起培养时，在KB15 NK细胞中未观察到异常的体外生长。

KB15 NK细胞的致瘤性

KB15 NK细胞皮下致瘤性评估采用中国药典方法进行。将HeLa细胞(阳性对照)或KB15细胞皮下注射到裸鼠体内。监测小鼠体重(图29A)和肿瘤生长(图29B)16周。如图29A所示，两组小鼠的体重在研究期间均增加。为了评估肿瘤生长，在第120天测量了HeLa和KB15NK细胞组的小鼠中的肿瘤体积。如图29B所示，注射了HeLa细胞的小鼠在第120天都出现了肿瘤；然而对于KB15组，在第120天未观察到明显的肿瘤/结节。

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。本发明意在不限于说明书中提供的具体实例。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中对实施方案的描述和图示并非意在以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面都不限于本文所阐述的取决于各种条件和变量的具体描述、构造或相对比例。应该理解，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以想到，本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同形式。以下权利要求意在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

序列表

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