含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用。

背景技术

黑色素是一种表现为面部、手背、颈部等暴露于阳光部位、出现的深色或棕色斑点或斑块，又称雀斑、肝斑或黑斑。紫外线照射、衰老等因素均会导致皮肤内黑色素的生成和沉积增加，而黑色素的过度沉积也被认为是导致老年斑、雀斑等皮肤色斑形成的主要原因。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)是一种可抑制神经传递、调节情绪、对抗焦虑、抑郁等的神经递质。研究表明，γ-氨基丁酸能够通过中枢神经系统的信号传递机制，影响脂褐素的形成和活性，间接减少黑色素。此外，γ-氨基丁酸还具有抗氧化、抗炎、促进胶原蛋白合成及放松肌肤等功效，具有优秀的皮肤抗衰老功效。多酚化合物是一种具有抗氧化、抗炎等多种生物活性的天然小分子化合物。研究表明，植物多酚可通过抑制酪氨酸酶活性减少黑色素的生成。此外，植物多酚还可通过抗氧化作用，减少黑色素细胞受到的氧化应激，发挥抑制黑色素合成的活性。

目前，皮肤老年斑、雀斑等的治疗方法主要包括外用药物、光疗和化学剥脱等。研究发现，虽有多种植物提取物用于护肤品并具有抑制或减少黑色素生成的活性，但植物提取物成分复杂、抑制或减少黑色素生成的活性不佳等因素极大的限制了其应用。因此，从植物提取物中开发出具有抑制黑色素生成的活性成分具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种天然小分子化合物以及含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种天然小分子化合物，所述的天然小分子化合物具有式Ⅰ、式Ⅱ或式III所示的结构：

优选地，所述的含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物，包含γ-氨基丁酸，以及式Ⅰ、式Ⅱ或式III所示结构的天然小分子化合物中的任意一种或一种以上的混合。

优选地，所述的含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物，包含γ-氨基丁酸，以及式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物。

进一步优选地，γ-氨基丁酸与式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物的质量比为1:(1-100):(1-100):(1-100)。

更进一步优选地，γ-氨基丁酸与式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物的质量比为1:(1-50):(1-50):(1-50)。

最优选地，γ-氨基丁酸与式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物的质量比为1:0.5:2.4:3.9。

本发明还提供了一种上述天然小分子化合物或组合物在制备具有抗衰老作用和/或美白作用的产品中的应用。

本发明还提供了一种上述天然小分子化合物或组合物在制备具有抗UVB暴露导致的光老化作用的产品中的应用。

本发明还提供了一种上述天然小分子化合物或组合物在制备具有抑制酪氨酸酶活性作用的产品中的应用。

本发明还提供了一种上述天然小分子化合物或组合物在制备具有抑制黑色素和/或脂褐素生成作用的产品中的应用。

优选地，所述的产品为食品、护肤品或药品。

(1)本发明提供了一种全新的结构的天然小分子化合物；研究表明，本发明所述的天然小分子化合物具有抗衰老、美白、抗UVB暴露导致的光老化、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素和/或脂褐素生成等一系列的作用。

(2)本发明还提供了一种全新的含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物；研究表明，将γ-氨基丁酸同时与式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物组合后形成的含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物，其抗衰老、美白、抗UVB暴露导致的光老化、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素和/或脂褐素生成等作用得到了进一步的显著提高；其抗衰老、美白、抗UVB暴露导致的光老化、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素和/或脂褐素生成等作用要显著高于本发明式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物，同时也显著高于γ-氨基丁酸；这可能是将γ-氨基丁酸同时与本发明式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物组合后产生协同增效作用的结果。

(3)由于本发明所述的天然小分子化合物以及含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物均具有抗衰老、美白、抗UVB暴露导致的光老化、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素和/或脂褐素生成等一系列的作用；因此，将其作为有效成分用于制备具有相应作用的产品具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明天然小分子化合物-1的HPLC检测图谱。

图2为本发明天然小分子化合物-1的HR-ESI-MS谱。

图3为本发明天然小分子化合物-1的

图4为本发明天然小分子化合物-1的

图5为本发明天然小分子化合物-1的DEPT-135谱。

图6为本发明天然小分子化合物-1的

图7为本发明天然小分子化合物-1的HMBC谱。

图8为本发明天然小分子化合物-1的

图9为本发明天然小分子化合物-2的HPLC检测图谱。

图10为本发明天然小分子化合物-2的HR-ESI-MS谱。

图11为本发明天然小分子化合物-2的

图12为本发明天然小分子化合物-2的

图13为本发明天然小分子化合物-2的DEPT-135谱。

图14为本发明天然小分子化合物-2的HMBC谱。

图15为本发明天然小分子化合物-2的

图16为本发明天然小分子化合物-3的HPLC检测图谱。

图17为本发明天然小分子化合物-3的高分辨质谱。

图18为本发明天然小分子化合物-3的

图19为本发明天然小分子化合物-3的

图20为本发明天然小分子化合物-3的

图21为本发明天然小分子化合物以及组合物对UVB辐照损伤线虫氧化性指标的影响。

图22为本发明天然小分子化合物以及组合物对对UVA辐照损伤皮肤成纤维细胞氧化性指标及酪氨酸酶活性、黑色素生成的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1天然小分子化合物的制备

(1)取仙人掌提取物、麦冬提取物以及苦参叶提取物按重量比为1:1:1混合均匀后得混合提取物；

所述的仙人掌提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：将仙人掌粉碎后加水混合均匀得仙人掌浆料；接着在仙人掌浆料中加入氯仿进行萃取，得氯仿萃取液；将氯仿萃取液浓缩干燥后即得所述的仙人掌提取物；其中，仙人掌与水以及氯仿的用量比为1kg:4L:4L；

所述的麦冬提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：取麦冬，然后用有机溶剂进行提取得有机溶剂提取液；将有机溶剂提取物液浓缩干燥后即得所述的麦冬提取物；其中，所述的提取为浸渍提取；所述的有机溶剂为乙酸乙酯；所述浸渍提取的时间为2天；麦冬与乙酸乙酯的用量比为1kg:6L；

所述的苦参叶提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：取苦参叶，然后用有机溶剂进行提取得有机溶剂提取液；将有机溶剂提取物液浓缩干燥后即得所述的苦参叶提取物；其中，所述的提取为浸渍提取；所述的有机溶剂为氯仿；所述浸渍提取的时间为2天；苦参叶与氯仿的用量比为1kg:8L；

(2)将混合提取物上硅胶柱，先用3倍柱体积的体积比为100:35的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱，弃去体积比为100:35的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液；接着再用5倍柱体积的体积比为100:55的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为100:55的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的硅胶柱洗脱部位；

其中，硅胶柱中的硅胶采用的是200-300目的硅胶，硅胶的重量为混合提取物重量的40倍；

(3)将硅胶柱洗脱部位再次上硅胶柱，先用3倍柱体积的体积比为100:40的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱，弃去体积比为100:40的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液；接着再用8倍柱体积的体积比为100:45的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为100:45的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱液，浓缩干燥后即得所述的硅胶柱活性部位；

其中，硅胶柱中的硅胶采用的是200-300目的硅胶，硅胶的重量为混合提取物重量的50倍；

(4)将步骤(3)制备得到的硅胶柱活性部位进一步采用制备型HPLC制备得到天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2以及天然小分子化合物-3，即分别为式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物；

所述的制备型HPLC的制备条件为：

以0.1％三氟乙酸-乙腈溶液为流动相A，以0.1％三氟乙酸的水溶液为流动相B，测波长为220nm，流速为10mL/min；色谱柱为：XBridge BEH C18 OBD Prep Column,5μm,19mm*150mm；洗脱条件为梯度洗脱。

制备天然小分子化合物-1的梯度洗脱条件如表1所示，收集9.32min色谱峰对应的洗脱液，浓缩干燥后得天然小分子化合物-1。

表1HPLC洗脱时间设置

天然小分子化合物-1的结构解析如下：

HR-ESI-MS(图2)显示准分子离子峰m/z 373.1985[M+Na]

1

化合物的

在

综合以上的结构解析，鉴定天然小分子化合物-1的结构如式Ⅰ所示。所述的天然小分子化合物-1即本发明式Ⅰ所示结构的天然小分子化合物。

表2天然小分子化合物-1 1D and 2D NMR数据(CDCl

制备天然小分子化合物-2的梯度洗脱条件如表3所示，收集11.51min色谱峰对应的洗脱液，浓缩干燥后得天然小分子化合物-2。

表3HPLC洗脱时间设置

天然小分子化合物-2的结构解析如下：

HR-ESI-MS(图10)显示准分子离子峰m/z 359.1825[M+Na]

化合物

化合物的

在HMBC谱(图14、15)中，H-1″(δ

综合以上的结构解析，鉴定天然小分子化合物-2的结构如式Ⅱ所示。所述的天然小分子化合物-2即本发明式Ⅱ所示结构的天然小分子化合物。

表4天然小分子化合物-2 1D and 2D NMR数据(CDCl

制备天然小分子化合物-3的梯度洗脱条件如表5所示，收集11.00min色谱峰对应的洗脱液，浓缩干燥后得天然小分子化合物-3。

表5HPLC洗脱时间设置

天然小分子化合物-3的结构解析如下：HR-ESI-MS(图17)显示其准分子离子峰m/z377.1603[M+H]

1

进一步解析该化合物的2D NMR(表6)相关信号，发现亚甲基(δ

综合以上的结构解析，鉴定天然小分子化合物-3的结构如式III所示。所述的天然小分子化合物-3即本发明式III所示结构的天然小分子化合物。

表6天然小分子化合物-3 1D and 2D NMR数据(CDCl

实施例2含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物的制备方法

将γ-氨基丁酸与天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3按质量比为1:0.5:2.4:3.9混匀，得所述γ-氨基丁酸、天然小分子组合物，即本发明所述的含γ-氨基丁酸以及天然小分子化合物的组合物；

所述的天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3分别为本发明式Ⅰ、式Ⅱ和式III所示结构的天然小分子化合物。

效果实施例1抗光老化活力、抑制紫外光辐照诱导的秀丽隐杆线虫脂褐素生成的活性评价

实施方法：N2野生型线虫20℃条件下培养，随机分成9组(每组数量不小于60条)，每组3个平行对照组。正常对照组用磷酸缓冲盐溶液代替活性物，除正常对照组外，其余各组L4期线虫在NGM/OP50板上正常培养2天，然后用配备有254nm UV灯泡(20瓦)，1000J/m

表7实验分组

结果如图21a、b、c、d、e所示，UVB辐照处理后，与空白对照组相比，UVB辐照组线虫体内的ROS、MDA及脂褐素含量显著增加，而线虫体内的抗氧化酶SOD、CAT的活性则显著下降，说明UVB辐照显著诱发线虫氧化应激，使线虫受到严重氧化损伤并加速线虫的衰老。分析本实验例结果数据发现，与空白对照组相比，UVB辐照组线虫体内ROS、MDA及脂褐素含量则分别增加265.6％(p<0.01)、178.3％(p<0.01)及334.1％(p<0.01)；而线虫体内抗氧化酶SOD及CAT活性则分别下降44.1％(p<0.01)及34.7％(p<0.01)。不同于UVB辐照组，经γ-氨基丁酸、本发明天然小分子化合物以及γ-氨基丁酸、天然小分子组合物预处理的线虫体内SOD、CAT活性得到有效提高，且经γ-氨基丁酸、本发明天然小分子化合物以及γ-氨基丁酸、天然小分子组合物处理后，线虫体内ROS、MDA及脂褐素含量低于UVB辐照组。其中，与UVB辐照组相比，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组线虫体内ROS、MDA及脂褐素含量则分别降低了60.6％(p<0.01)、41.1％(p<0.01)、59.7％(p<0.01)。说明，本发明天然小分子化合物以及本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物能够有效的抑制紫外光辐照导致的线虫氧化损伤，发挥其抗氧化活性，同时能够抑制紫外辐照导致的脂褐素生成，说明γ-氨基丁酸、天然小分子组合具有优秀的抗衰老活性。

而进一步分析实验结果发现，本发明天然小分子化合物以及本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物能够有效提高线虫体内抗氧化酶SOD及CAT的活性；其中，与UVB辐照组相比，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组线虫体内的抗氧化酶SOD及CAT活性分别提高69.7％(p<0.01)、40.2％(p<0.01)。

本部分实验结果显示，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物提高线虫清除体内ROS、MDA及抑制体内脂褐素生成的活性强于同等浓度的γ-氨基丁酸、白藜芦醇、槲皮素或天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3。我们推测本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物中的γ-氨基丁酸及天然小分子可通过协同作用发挥提高线虫体内抗氧化酶SOD、CAT活性并提高线虫清除ROS、MDA及抑制体内脂褐素生成的活性进而更好的抵抗UVB暴露导致的光老化。

效果实施例2提高皮肤细胞活力、抑制紫外光辐照诱导的酪氨酸酶活性升高、抑制黑色素生成活性评价

实施方法：人皮肤成纤维细胞正常培养，待细胞生长至90％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化后分别接种于24孔培养板中，待细胞80％融合时进行紫外辐照实验。实验中，UVA紫外灯选用UVA 360nm灯管照射，先将紫外线灯管消毒后置入超净台中，恒温水浴箱严格消毒后加入纯水置入超净台中，超净台紫外灯消毒30min。照射前将长波紫外灯置于恒温水浴箱上，测量灯管与24孔板照射平面之间距离为15cm。测前长波紫外灯预热30min，待照射功率稳定后测得功率为20.0mJ/s，照射时以PBS置换培养基，掀开盖子在恒温水浴箱中将细胞暴露于UVA辐照装置下，照射距离为15cm。照射前2h加入PBS液，培养板置入37℃恒温水浴箱中，照射后置换含10％小牛血清及活性物(终浓度为30μg/mL)的DMEM置入培养箱中继续培养，24h后收集细胞及培养上清，CCK 8试剂盒检测细胞活力；按ROS、SOD、MDA、CAT及酪氨酸酶活性、黑色素含量ELISA试剂盒操作说明书操作，检测其含量，实验分组如表8。

表8实验分组

分析本效果实施例实验结果(图22a)显示，与空白对照组相比，UVA辐照使细胞活力降低27.5％(p<0.01)，但分析实验结果发现，经本发明天然小分子，尤其是γ-氨基丁酸、天然小分子组合物处理的细胞活性显著高于UVA辐照组。其中，与UVA辐照组相比，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组细胞活力提高33.8％(p<0.01)。而相比于同等浓度的γ-氨基丁酸、白藜芦醇、天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3或槲皮素，γ-氨基丁酸、天然小分子组合能够更好的提高UVA辐照条件下的细胞的活力，说明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物能够更好的提高细胞的抗UVA辐照损伤活性。

进一步分析本效果实施例实验结果发现，与γ-氨基丁酸、白藜芦醇、天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3或槲皮素组相比，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组细胞活力提升更明显。说明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物提升细胞活力的活性强于γ-氨基丁酸、白藜芦醇、天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3或槲皮素。我们推测，本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物中的γ-氨基丁酸和天然小分子化合物可能通过协同作用更好的提高细胞活力，提高细胞抗UVA损伤活性。

进一步分析本效果实施例实验结果(图22b、c)显示，与空白对照组相比，UVA辐照使细胞ROS、MDA含量增加148.3％(p<0.01)及191.5％(p<0.01)，但分析本效果实施例实验结果发现，经本发明天然小分子化合物，尤其是本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物处理的细胞内ROS、MDA含量显著低于UVA辐照组。其中，与UVA辐照组相比，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组细胞ROS、MDA含量减少37.5％(p<0.01)及51.2％(p<0.01)。且进一步分析实验结果发现，相比于同等浓度的γ-氨基丁酸、白藜芦醇、天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3或槲皮素，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物能够更好的提高UVA辐照条件下的细胞清除ROS、MDA的活性，说明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物具有更好的提高细胞的抗UVA辐照损伤的活性。

进一步分析本效果实施例实验结果(图22d、e)显示，与空白对照组相比，UVA辐照使细胞SOD及CAT活性降低22.9％(p<0.01)及24.5％(p<0.01)，但分析本效果实施例实验结果发现，经本发明天然小分子化合物，尤其是本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物处理的细胞SOD及CAT活性显著高于UVA辐照组。其中，与UVA辐照组相比，γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组细胞SOD及CAT活性提高23.4％(p<0.01)及40.2％(p<0.01)。且进一步分析实验结果发现，相比于同等浓度的γ-氨基丁酸、白藜芦醇、天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3或槲皮素，本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物能够更好的提高UVA辐照条件下的细胞SOD及CAT活性的活性，说明本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物具有更好的提高细胞的抗UVA辐照损伤的活性。

分析本效果实施例实验结果发现，与空白对照组相比，UVA辐照组(图22f)的活性显著增加，而黑色素含量也显著增加(图22g)，说明UVA辐照能够损伤皮肤成纤维细胞，激活酪氨酸酶或者促进其表达或分泌，进而促进黑色素的表达、分泌。与空白对照组相比，UVA辐照组酪氨酸酶活性增加266.1％(p<0.01)，但分析本效果实施例实验结果发现，活本发明天然小分子化合物，尤其是本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组酪氨酸酶活性显著低于紫外辐照组。其中，与UVA辐照组相比，本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物酪氨酸酶活性降低56.8％(p<0.01)。与空白对照组相比，UVA辐照组黑色素含量增加156.3％(p<0.01)，但分析本效果实施例实验结果发现，本发明天然小分子化合物组，尤其是γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组黑色素含量显著低于UVA辐照组。其中，与UVA辐照组相比，本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物黑色素含量降低46.1％(p<0.01)。

而进一步分析本效果实施例实验结果发现，同等浓度条件下，本发明γ-氨基丁酸、天然小分子组合物组酪氨酸酶活性及黑色素含量低于γ-氨基丁酸、白藜芦醇、天然小分子化合物-1、天然小分子化合物-2、天然小分子化合物-3或槲皮素组。我们推测，本发明发γ-氨基丁酸、天然小分子组合物中的γ-氨基丁酸和天然小分子化合物可能通过协同作用抑制UVA辐照诱发的人皮肤成纤维细胞酪氨酸酶活性升高或者抑制其表达或分泌，进而抑制人皮肤成纤维细胞黑色素的表达或分泌。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。