一种锰金属白蛋白TLR4激动剂及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫调节技术领域，更具体地说，涉及一种锰金属白蛋白TLR4激动剂及其制备方法。

背景技术

Toll样受体(TLRs)可以识别病原体相关分子模式(PAMPs)或危险相关分子模式(DAMPs)，随后诱导先天免疫细胞分泌促炎因子的，帮助机体抵抗病毒或细胞感染(Abreu,M.T.；Arditi,M.Innate Immunity and Toll-like Receptors:Clinical Implicationsof Basic Science Research.J.Pediatr.2004,144(4),421-429)。TLRs的发现极大促进了免疫领域的发展，Bruce Beutler和Jules Hoffmann也因在TLRs方面的相关工作获得2011年诺贝尔生理学或医学奖。作为TLRs中重要成员之一，TLR4可被脂多糖(LPS)激活，并进一步触发MyD88和TRIF依赖的急性炎症反应并诱导I型干扰素的产生。

20世纪40年代早期，LPS首次被引入癌症治疗领域，并在多项研究中都呈现出良好的抗癌效果(Shear,M.J.；Perrault,A.Chemical Treatment of Tumors.IX.Reactions ofMice with Primary Subcutaneous Tumors to Injection of a Hemorrhage-ProducingBacterial Polysaccharide.J.Natl.Cancer Inst.1944,4(5),461-476.)。1978年，Berendt等研究了静脉注射LPS对小鼠体内肿瘤的影响。结果表明，单次注射50μg的LPS对A/J小鼠的SA-1梭形细胞肉瘤和BALB/c小鼠的Meth A纤维肉瘤具有非常好的治疗效果(Berendt,M.J.；North,R.J.；Kirstein,D.P.The Immunological Basis of Endotoxin-Induced Tumor Regression.Requirement for a Pre-Existing State of ConcomitantAnti-Tumor Immunity.J.Exp.Med.1978,148(6),1560-1569.)。在活体小鼠上的实验成功也推动了LPS的临床试验(Engelhardt,R.；Mackensen,A.；Galanos,C.Phase I Trial ofIntravenously Administered Endotoxin(Salmonella Abortus Equi)in CancerPatients.Cancer Res.1991,51(10),2524-2530.)。然而，在有效刺激免疫系统的同时，LPS的副作用也逐渐显现。以往的研究也给出了一些相应的减少LPS副作用，改善其免疫治疗效果的策略，如通过改变给药途径、利用LPS修饰纳米颗粒、与其他免疫刺激物联用或开发其他毒性较小的衍生物和类似物等等(Shetab Boushehri M A,Lamprecht A.TLR4-BasedImmunotherapeutics in Cancer:AReview of the Achievements andShortcomings.Mol.Pharmaceutics 2018,15(11),4777–4800)。此外，一些LPS衍生物或类似物例如：脂质A、单磷酸脂质A(MPLA)、脂多糖邻苯二甲酸钠(SP-LPS)等陆续被设计合成，通过复杂化学改性途径来缓解LPS的系统毒副作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于锰金属白蛋白的TLR4激动剂的制备方法，利用痕量Mn离子与白蛋白结合，制备Mn@BSA纳米复合物，开发一种不同于通过化学改性途径，制备出具有类似LPS激动效果的新型TLR4激动剂，同时具有工艺简单、反应绿色温和、成本较低等特点；本发明要解决的另一技术问题是提供一种上述方法制备获得的锰金属白蛋白TLR4激动剂，可以通过与LPS相同的TLR4途径激活免疫反应，且具有类似的免疫刺激效应。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种锰金属白蛋白TLR4激动剂的制备方法，利用痕量Mn离子与白蛋白结合，制备Mn@BSA纳米复合物，即得锰金属白蛋白TLR4激动剂。

所述的锰金属白蛋白TLR4激动剂的制备方法，具体步骤为：将BSA的溶解液与MnCl

作为优选，所述BSA的溶解液的制备方法为：将BSA溶解于PBS溶液中，搅拌溶解。

作为优选，所述PBS溶液的浓度为0.01M，pH7.2-7.4。

作为优选，所述BSA与PBS溶液的摩尔比为45～46:10000。

作为优选，所述BSA溶解液与MnCl

作为优选，所述将混合物溶液倒入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用去离子水透析24h，于冷冻干燥保存。

所述的锰金属白蛋白TLR4激动剂的制备方法所获得的锰金属白蛋白TLR4激动剂。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本申请提供的锰金属白蛋白TLR4激动剂的制备方法，制备步骤简单高效，利用痕量Mn离子与白蛋白结合，制备Mn@BSA纳米复合物，即得锰金属白蛋白TLR4激动剂，反应绿色温和，无有毒有害产物生成；

2)本发明的制备原料价格低廉，合成成本低，节约成本。

附图说明

图1为实施例1制备的Mn@BSA的电镜图；

图2为实施例1制备的Mn@BSA的粒径图；

图3为实施例1制备的Mn@BSA的电位图；

图4为实施例1制备的Mn@BSA的毒理性图；

图5为不同物质作用后的基因表达图；其中，BSA表示100μg/mL BSA与细胞作用的结果；Mn表示0.0827μg/mL Mn

图6为100ng/mL LPS+25ng/mL IFN-γ刺激的细胞组中TNF-α基因的表达图；

图7为100μg/mL Mn@BSA刺激的细胞组中TNF-α基因的表达图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

BSA、MnCl

仪器：200KV透射电子显微镜JEOL JEM2100；马尔文激光粒度仪Zetasizer NanoZS。

实施例1

称取89.34μg的MnCl

从图1可知，通过该方法制备得到的Mn@BSA纳米复合物呈球状，且伴有轻微聚集。

从图2可知，相比于BSA的水合粒径(Size＝3.666nm，多分散系数PDI＝0.280)，Mn@BSA纳米复合物的水合粒径增加到5.890nm(PDI＝0.377)。这一进一步说明了Mn

从图3可知，BSA分子的zeta电位随着Mn

实施例2

将BSA溶解于不同pH值的PBS溶液中，并测量其zeta电位。结果表明，在酸性条件下(pH值小于BSA等电点4.7)，BSA的zeta电位为正，接近4.7时其zeta电位接近于0，大于4.7时，其zeta电位为负。这表明，当溶液pH值大于BSA等电点时，BSA中带负电荷区域暴露更多，更有利于带正电的Mn

实施例3

称取89.34、178.68、357.36、714.72、1429.44μg的MnCl

制备了不同BSA与MnCl

结果表明随着Mn与BSA比例的增加，其PDI逐步增高，如表1所示。因此，为了得到更加均一、性能更加优异的纳米复合物，选择BSA:Mn＝1:1的纳米复合物作为优选比例。

表1

实施例4

细胞实验

1)RAW 264.7细胞培养和毒理性测试

RAW 264.7细胞在添加了10％胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)和1％青霉素链霉素(北京索莱宝科技有限公司)的DMEM培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)中37℃，5％ CO

为了评估Mn@BSA的生物相容性，将RAW 264.7细胞以5×10

细胞活力(％)＝实验组吸光度/空白对照组吸光度×100％

毒理性结果如图4所示。由图4可知，当Mn@BSA使用浓度≤100μg/mL时，其对RAW264.7细胞的毒性可以忽略不计。而且相比于单独的Mn离子的作用，Mn@BSA的毒性明显降低了很多。

2)基因表达

为了验证Mn@BSA对TLR4的激活，以典型的100ng/mL LPS+25ng/mL IFN-γ刺激RAW264.7细胞作为TLR4激活的对照，采用最大安全浓度100μg/mL的Mn@BSA在相同条件下刺激同等数量的RAW264.7细胞。同时，以相同浓度(100μg/mL)的BSA以及最大等当量(0.0827μg/mL)的Mn

3)TLR4抑制实验

为了进一步证实Mn@BSA可以激活TLR4，将不同浓度(10、20、50、100nM)的TLR4抑制剂TAK 242加入到含有100μg/mL Mn@BSA(或100ng/mL LPS+25ng/mL IFN-γ)的培养基中，再与细胞共培养6h。6h后，提取相应的细胞RNA，并采用实时荧光定量PCR的方式检测相应细胞组中TNF-α基因的表达，结果如图6-7所示。可以看出，无论是100ng/mL LPS+25ng/mLIFN-γ刺激的细胞组还是100μg/mL Mn@BSA刺激的细胞组，在加入不同浓度的TLR4抑制剂TAK 242后，TNF-α基因的表达都出现浓度依赖式降低，呈现出显著的抑制效果(p＜0.001)。这些结果进一步表明，Mn@BSA是一种新型的TLR4激动剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。