基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 Ngene传感器及其制备方法与应用。

背景技术

冠状病毒病(COVID-19)主要通过核酸检测即PCR技术进行检测。然而样本采集和运输的局限性以及试剂盒的性能不足，使病毒的检测时长在2h以上，不能及时检测出阳性样本，并且还需要专业的设备、人员且检测所需的成本较高。因此，迫切需要一种即时、快速、经济有效且选择性的COVID-19诊断测试，需要达到在一个小时内提供准确的测试结果的目标。

光纤传感器在近年来得到了极大的发展，光纤传感主要应用于航空航天、桥梁、石油测井等领域。光纤中传输的光不仅可以用于传输信号，当周围环境发生改变(如应力、温度、折射率等)时，光的某些光学性质(例如光强、相位、偏振态等)会发生改变，因此实现利用光纤来传感。

金纳米棒具有较好的物理化学性质，其中一些性质适合于使用这些纳米材料作为检测载体。局域表面等离子体共振(LSPR)是所有金纳米粒子最重要的性质之一，LSPR是偏振光触发金纳米粒子表面上自由传导电子振荡时发生的光学现象，通常LSPR峰的位置强烈依赖于纳米颗粒的物理性质，例如形状和尺寸，也与粒子所处的环境有关，随着环境折射率的变化或者粒子尺寸的变化，LSPR的峰位和吸光度也会随之变化。随着纳米材料的发展，基于纳米材料出现的传感检测也逐渐发展起来。利用LSPR这一独特效应，金纳米棒可以被广泛应用于抗坏血酸、葡萄糖这类小分子识别物，也可以应用于抗体抗原、microRNA这类大分子识别物，从而实现血糖、病毒、核酸等不同方向的检测。

CN116083535A公开了一种实现多微生物检测的金纳米检测方法，其特征在于通过改变球形金纳米粒子的大小和形状,将不同的寡核苷酸与金纳米粒子结合后，寡核苷酸与不同微生物DNA/RNA的特定部分通过碱基互补配对耦合在一起，基于LSPR效应使得不同大小和形状的金纳米粒子发生不同的颜色变化从而实现目标检测物的检测。但是由于该方案使用的是球形金纳米粒子且实验在溶液环境中进行，导致该检测方法无法重复使用，且球形金纳米粒子由于没有像金纳米棒的各向异性结构或者三角形金纳米片、金纳米星的尖端结构导致检测的灵敏度较低。

发明内容

本发明提供一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene传感器及其制备方法与应用，其用金纳米棒作为敏感材料，由于金纳米棒的各向异性结构，可以有效的提高局域电场的场强，增强LSPR响应的产生，实现SARS-CoV-2 N gene的检测，为其他的RNA检测提供了可能。

本发明的技术方案是，一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene传感器，包括光纤探头，光纤探头设有金纳米棒和在金纳米棒表面结合的反义寡核苷酸ASO1，该ASO1与SARS-CoV-2 N gene的421-440段碱基互补配对。

进一步地，所述光纤探头使用到的光纤直径为600μm。

进一步地，所述金纳米棒的纵向吸收峰为650～900nm，金纳米棒的长径比为2.49～4.90。

本发明涉及一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene检测装置，其包括宽带光源、Y型光纤和光谱仪三部分，Y型光纤的一端连接上述传感器，另一端的两个分支分别连接宽带光源和光谱仪。

本发明还涉及一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene检测方法，包括以下步骤：

S1、通过种子生长法获得金纳米棒(AuNRs)材料，利用静电吸附法将金纳米棒固定于光纤探头表面，再利用化学键结合将巯基修饰的反义寡核苷酸ASO1接在金纳米棒表面，得到传感器；

S2、采用反义寡核苷酸ASO2与金纳米棒溶液混合，该ASO2与SARS-CoV-2 N gene的443-462段碱基互补配对，然后加入SARS-CoV-2 N gene溶液混合得到AuNRs-ASO2-N gene偶联物溶液，该偶联物溶液用于N gene的检测；

S3、检测装置使用到的为Y型光纤，其一端连接S1处理的Au-ASO1传感器，另一端的两个分支分别连接宽带光源和光谱仪构建光学平台；在冰水浴下，将Au-ASO1传感器置于S2制得的AuNRs-ASO2-N gene溶液中孵育，使传感器的ASO1和AuNRs-ASO2-N gene偶联物结合并充分反应，同时利用光学平台记录其LSPR峰位和强度的变化，构建LSPR峰位变化量与SARS-CoV-2 N gene浓度的关系函数，进而实现SARS-CoV-2 Ngene的检测。

进一步地，S1中制备金纳米棒时，向十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中加入HAuCl

进一步地，S1中利用静电吸附法将金纳米棒固定于光纤探头表面时，先依次用PSS盐溶液和柠檬酸钠溶液孵育金纳米棒溶液，改变金纳米棒表面电负性；再将光纤探头清洗打磨后，用过氧化氢和浓硫酸混合溶液浸泡后清洗并烘干，活化光纤表面的羟基使其带负电；再将光纤探头在PAH盐溶液中浸泡三小时，使得光纤表面带正电；最后将处理后的光纤探头浸泡在金纳米棒溶液中，金纳米棒固定于光纤探头表面。

进一步地，S1中利用TCEP溶液将反义寡核苷酸ASO1的巯基活化，然后将固定有金纳米棒的光纤探头浸泡在ASO1溶液中，修饰ASO1的巯基会与光纤表面的金纳米棒通过Au-S键发生结合，使ASO1固定在光纤的表面，得到传感器。

进一步地，S2中反义寡核苷酸ASO2与金纳米棒溶液混合之前，采用TCEP溶液将反义寡核苷酸ASO2的巯基活化；ASO2与金纳米棒溶液体积比为1:1，SARS-CoV-2Ngene溶液与AuNRs-ASO2混合溶液的体积比根据所配置的待测物溶液的浓度进行调整。

本发明还涉及所述的检测方法在SARS-CoV-2检测中的应用。

本发明基于采用金纳米棒溶液作为原料，金纳米棒由于各向异性结构和优异的LSPR效应，可以提高传感器的灵敏度。利用静电吸附法将金纳米棒固定于光纤探头表面，然后利用化学键结合将巯基修饰的反义寡核苷酸ASO1接在金纳米棒表面，制作对SARS-CoV-2N gene有特异性响应的Au-ASO1光纤传感探头。当金纳米棒表面的反义寡核苷酸与目标检测物SARS-CoV-2的N gene发生碱基互补配对结合时，金纳米棒所处的环境的折射率发生变化且探头表面的金纳米棒会因为互补序列的结合出现一定的聚集，金纳米棒的局域表面等离子共振(LSPR)效应被影响，从而导致纵向吸收峰峰位发生偏移，实现SARS-CoV-2 N gene的检测。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提出了一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene传感器。该光纤LSPR传感器采用金纳米棒作为敏感材料，由于金纳米棒的各向异性结构，可以有效的提高局域电场的场强，增强LSPR响应的产生。该光纤传感器实现了SARS-CoV-2 N gene的检测，为其他的RNA检测提供了可能。

2、本发明提出的用于检测SARS-CoV-2 N gene的光纤LSPR传感器，使用到的原理是ASO和N gene的碱基互补配对特异性结合，从而形成一个三明治结构，使待测溶液中的金纳米棒以肩并肩的方式结合到光纤表面，金纳米棒的局域表面等离子共振(LSPR)效应被影响，光纤的纵向吸收峰峰位发生偏移。

3、本发明提出的光纤探头的制备和检测过程操作方便，不依赖于训练有素的操作人员；本传感器经济、灵敏度高；且可以实现快速响应、表现出良好的选择性，特异性高；具有巨大的SARS-CoV-2 N gene检测潜力。

附图说明

图1为传感器制作及其检测SARS-CoV-2 N gene原理图。

图2为传感器检测SARS-CoV-2 N gene的实验装置图。

图3为金纳米棒紫外吸收光谱表征。

图4为本发明中AuNRs和Au-ASO1结合物的FTIR光谱。

图5为本发明中光纤探头表面连接ASO1和与偶联物碱基互补配对后的吸收光谱变化情况。

图6为本发明中Au-ASO1光纤探头峰位移动与不同浓度SARS-Cov-2 N gene之间的变化关系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

本发明涉及的ASO1的序列和ASO2的序列可以参考Parikshit Moitra,etc.；Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2Mediated by N Gene TargetedAntisenseOligonucleotide Capped PlasmonicNanoparticles，ACS Nano2020,14,7617-7627。ASO1和ASO2分别与N gene的421-440段、443-462段碱基互补配对，且ASO1的5p端用巯基进行了修饰，且ASO2的3p端用巯基进行了修饰。

一种基于光纤LSPR的SARS-CoV-2 N gene传感器的传感器，其检测原理如图1所示，制备步骤如下：

1)利用种子法合成金纳米棒并用PSS和柠檬酸钠置换其表面分子；

2)对光纤探头进行处理，利用交联剂PAH将光纤探头表面呈正电性，将光纤探头的S端浸泡在金纳米棒分散液中，将纳米粒子固定在光纤探头的表面；

3)利用TCEP溶液将修饰反义寡核苷酸(ASO1)的巯基活化，然后将功能化后的光纤S端浸泡在反义寡核苷酸(ASO1)溶液中，其中修饰ASO1的巯基会通过Au-S键与金纳米棒结合，就可以得到对SARS-CoV-2 N gene有特异性响应的Au-ASO1光纤传感探头；

4)将ASO2溶液和金纳米溶液混合搅拌1h，在加入适量体积的SARS-CoV-2 N gene溶液得AuNRs-ASO2-N gene检测溶液；

5)将Au-ASO1光纤传感探头应用于检测SARS-CoV-2 N gene时，需要构建光学传感系统，传感系统包含宽带光源、Y型光纤、光纤探头、光谱仪。

6)在冰水浴下，将Au-ASO1光纤传感探头置于不同浓度的AuNRs-ASO2-N gene溶液中孵育一段时间，让N gene和ASO1充分反应。依据LSPR峰位变化情况来进行SARS-CoV-2 Ngene的测定。

实施例1：

柠檬酸钠修饰的金纳米棒的制备方法如下：

金纳米棒采用种子生长法制备，取50uL氯金酸溶液(24mM)于3.75mLCTAB(0.1M)中并均匀搅拌，然后快速加入冰的NaBH

将CTAB包覆的金纳米棒悬浮液在10000rpm离心10分钟，并将下层沉淀物用等量的超纯水重新分散，该过程进行三次，将1mL PSS(5g/L)盐溶液(2.5mM NaCl)添加到10mL离心后的金纳米棒溶液中，常温下孵育1小时，之后将溶液在10000rpm离心10分钟，并将下层沉淀物用10mL超纯水重新分散，此操作重复两次，将上述离心产物用10mL的柠檬酸钠(2mM)溶液重新分散，然后在室温下孵育12小时，得到的金纳米棒悬浮液再以10000rpm离心10分钟，并用5mL柠檬酸钠溶液重新分散。

其紫外吸收光谱表征如图3所示，该图中合成的金纳米棒长径比约为2.69。

实施例2：

AuNRs-ASO2-N gene偶联物的制备

将TCEP(10mM)溶液加入到ASO2溶液中室温孵育1h，按上述实施例1的步骤制备金纳米棒分散液，向AuNRs分散液中加入ASO2溶液(0.5uM)，搅拌1h。然后将混合溶液离心(10000rpm，10min)去掉未结合的ASO2，离心后，将得到的Au-ASO2重新分散在DEPC处理水中，再将适量的N gene加入到Au-ASO2结合物的溶液中孵育1h配置成AuNRs-ASO2-N gene偶联物溶液。

图4显示AuNRs和AuNRs-ASO2-N gene结合物的FTIR光谱，AuNRs在1395、1577和2100cm-1处出现红外吸收峰，这是金纳米棒表面柠檬酸纳的特征吸收峰。接上ASO和N gene后，出现了核苷酸的吸收峰，分别位于1455cm

实施例3：

步骤一(光纤探头表面电负性处理)：截取一根长度约为7cm直形光纤，将其两端表面的涂覆层去掉后，记光纤传感端为S端，并用丙酮浸泡4h去除包层，然后去离子水清洗干净，将光纤的两端在研磨机上磨成光滑的平面，然后利用离子溅射仪将光纤S端端面镀上用于反射的金膜。将打磨好的光纤S端浸泡在过氧化氢和浓硫酸溶液中(3:7)，浸泡时间为60min，将用去离子水冲洗干净的光纤置于烘干箱110℃烘1h，活化光纤表面的羟基。之后，将光纤S端浸泡在4mg/mL的PAH氯化钠(1M NaCl)溶液中，此步骤是为了将PAH固定在光纤表面，使光纤表面带正电，交联时间为3h。

步骤二(金纳米棒固定于光纤探头表面)：按上述实施例1的步骤制备金纳米棒溶液。将光纤的S端浸泡在金纳米棒溶液中，表面带负电的纳米粒子通过静电吸附固定在带正电的光纤表面。浸泡时间为50min。

步骤三(制备Au-ASO1光纤传感探头)：将光纤探头的S端浸泡在用TCEP活化巯基后的ASO1溶液(1uM)中12h，修饰ASO1的巯基会与光纤表面的金纳米棒通过Au-S键发生结合，使ASO1固定在光纤的表面。

步骤四：将AuNRs溶液中加入ASO2溶液(0.5uM)，搅拌1h。然后将混合溶液离心(10000rpm，10min)去掉未结合的ASO2，离心后，将得到的Au-ASO2重新分散在DEPC处理水中，在Au-ASO2溶液中加入适量的SARS-CoV-2 N gene得到AuNRs-ASO2-N gene溶液，二者比例根据需要配置的浓度进行调整。

步骤五：构建如图2所示的光学传感系统，将制备好的Au-ASO1光纤传感探头用于检测SARS-CoV-2 N gene。在冰水浴下，将Au-ASO1光纤传感探头置于AuNRs-ASO2-Ngene溶液中孵育一段时间，让ASO1和AuNRs-ASO2-N gene偶联物结合并充分反应，利用构建的光学平台记录其LSPR峰位和强度的变化。

如图5所示，显示了功能化后和偶联物接在光纤探头表面时，光纤探头的LSPR峰位变化。从图中可以明显看到，AuNRs的LSPR峰为827nm，当功能化后将Au-ASO1的LSPR峰为856nm，对比初始峰位探头的峰位发生了右移，这是由于巯基修饰的ASO通过Au-S相互作用结合在AuNRs的表面，使得LSPR峰位发生了红移。在置于AuNRs-ASO2-N gene偶联物溶液后LSPR峰变为854nm，峰位发生蓝移是因为偶联物结合到光纤表面导致了金纳米棒的肩并肩式聚集，这说明成功制备了可以检测N gene的Au-ASO1光纤传感探头。

实施例4：

按实施例3制备Au-ASO1光纤传感探头。在冰水浴下，将Au-ASO1光纤传感探头置于不同浓度的AuNRs-ASO2-N gene溶液中孵育一段时间，让ASO1和偶联物结合并充分反应，利用构建的光学平台记录其LSPR峰位和强度的变化。

从图6可以看到，当我们将Au-ASO1光纤探头置于AuNRs-ASO2-N gene偶联物溶液中时，ASO1和N gene会通过碱基互补配对特异性结合导致偶联物吸附于光纤表面，粒子的聚集会导致光纤的有效折射率发生变化，导致LSPR峰位发生蓝移。LSPR峰位变化量Δλ会随着SARS-CoV-2 N gene浓度而变化，两者的关系可用函数表示：Δλ＝1.8+1.45ln(x+1.39)(R

上述实施例只为说明本发明的技术思路和特点，所述内容仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此。在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等效变化或改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。