一种兽用高稳定性复方注射液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽药制剂制备领域，具体涉及一种兽用高稳定性复方注射液及其制备方法和应用。

背景技术

恩诺沙星作为动物专用的新型氟喹诺酮类药物，对多种病原菌抑菌效力强，体内分布广泛，消除半衰期长，在兽医临床被广泛用于治疗肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌、支原体、衣原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等菌引起的感染。然而，报道显示细菌对恩诺沙星的耐药性越来越多严重。细菌外膜的屏障作用和外排泵的外排作用极大制约了恩诺沙星在细菌胞内的有效蓄积，是影响药效的重要原因。

硫酸多黏菌素为多肽类抗生素，可破坏细菌外膜，对阴性菌有优良抗菌活性。其与环丙沙星、利福平、万古霉素等药物联用可使细菌胞质内的药物累积量显著升高（doi:10.1111/nyas.13598）。同时，外膜结构破环，也限制外排泵活性。因此，与多黏菌素联用是提高其它抗菌药物透过外膜屏障、在菌体内高效蓄积的有效手段。本发明拟制备恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方制剂，以提高恩诺沙星的抗菌效力及其对耐药菌的治疗效果。

虽然已有相关专利报道将恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用制成口服溶液（授权号：CN 111821258 B）。然而，如图2所示，按照专利（授权号：CN 111821258 B）所提供的技术方案无法制得其所述的“稳定、不析晶的溶液型制剂”。且本领域公知，恩诺沙星味极苦，对猪经口给药易被拒食，口服剂型极难达到专利（授权号：CN 111821258 B）所述的“适口性好”的目的。且欧盟于2016年发文称经口给予硫酸多黏菌素将加速肠道菌群对其耐药性的产生，口服硫酸黏菌素产品应尽早撤出市场。从实际应用和公共卫生安全的角度出发，恩诺沙星与硫酸黏菌素复方不宜制成口服产品。注射液是更符合公共卫生及使用要求的剂型，恩诺沙星与硫酸多黏菌素复方注射液在养殖临床中具有较大的应用前景。

然而，大量研究表明，氟喹诺酮类药物（如恩诺沙星）的溶液制剂在长期存储过程中易结晶析出（谢勇，2015）。据《农业农村部办公厅关于2021年第三期兽药质量监督抽检情况的通报》中的报道，部分市售恩诺沙星注射液产品就面临着析晶的问题。药物的结晶析出除了将导致药物含量不足、影响药效外，结晶物还可能在注射时引起局部炎症、毛细血管堵塞、肉芽肿，严重者将影响靶动物的生命健康，甚至危及生命。据报道，增大药物在溶液中的溶解度是减少药物析晶、提高稳定性的有效手段。其中，增溶剂、助溶剂的加入以及成盐是增加难溶性药物溶解度的重要手段，例如，使用氢氧化钠与恩诺沙星反应生成恩诺沙星钠即可提高恩诺沙星溶液剂型的稳定性。然而，高pH值的注射液刺激性较大，易对注射部位造成损伤。市售恩诺沙星注射液（拜有利）说明书所述，产品可能对局部组织出现暂时性损伤（图1）。同时，硫酸多黏菌素为多肽类化合物，高的pH易使酰胺键水解，影响其活性。综上所述，要制备出质量稳定、pH适宜的恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液需采取更加合理的策略。

本发明以谷氨酸钠、葡甲胺、三乙醇胺、氢氧化钠中的一种或其组合为助溶剂，以正丁酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸中的一种或其组合为酸度调节剂，以聚乙二醇-400、正丁醇、乙醇中的一种或其组合为潜溶剂，以依地酸二钠、依地酸钙中的一种或其组合为络合剂。首先利用酸碱中和法制得恩诺沙星钠盐，提高了恩诺沙星的溶解度，又经酸度调节剂处理，保证了硫酸多黏菌素的稳定性，将pH稳定于低刺激性范围，再联合潜溶技术进一步增强恩诺沙星与潜溶剂分子的氢键作用，使得恩诺沙星分子在水溶液中更加稳定，解决了恩诺沙星溶液剂型长期存储易析晶的问题。本发明巧妙地将多黏菌素与恩诺沙星联用，二者的抗菌靶点不同，使其发挥出最大的抗菌活性，延缓细菌耐药性的发展，对固有外膜的破坏使细菌适应性代偿增加，抑制细菌生物膜亚群和滞留菌亚群的产生，减小临床顽固感染、反复感染的概率。联用在提高两者抗菌效力的同时降低用量，符合我国“减量、增效”政策要求。更重要的是，本发明兼顾剂型实用性、组方安全性、保存稳定性，解决了临床使用刺激性强及产品稳定性低的应用及生产限制问题，有利于恩诺沙星与硫酸多黏菌素复方产品的广泛应用。综上，本发明所提供的恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液无疑将有助于养殖临床中对畜禽细菌性感染的防治，延缓细菌耐药性发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高稳定性恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液，同时为了获得刺激性小，可用于肌肉注射给药；而且还可抑制细菌耐受亚群的产生，可降低病原菌耐药突变频率的复方制剂。本发明的开发不仅将有利于临床中动物耐药菌感染的治疗，还可延缓病原菌耐药性的发展。

本发明以谷氨酸钠、葡甲胺、三乙醇胺、氢氧化钠中的一种或其组合为助溶剂，以正丁酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸中的一种或其组合为酸度调节剂，以聚乙二醇-400、正丁醇、乙醇中的一种或其组合为潜溶剂，以依地酸二钠、依地酸钙中的一种或其组合为络合剂。创新性地联合酸碱中和法和潜溶技术，解决了恩诺沙星溶液剂型易结晶析出、刺激性大、与硫酸多黏菌素不易配伍的难题。本发明巧妙地利用了多黏菌素靶向细菌固有外膜的特点，其与恩诺沙星联用将有利于恩诺沙星跨越细菌外膜，提高其细菌胞质内的浓度，从而促进恩诺沙星与DNA聚合酶的结合，以发挥最大的抗菌效力。同时，硫酸多黏菌素靶向外膜的特点，也将有助于休眠状态细菌亚群（高度耐受恩诺沙星）的清除。所提供的复方注射液不仅显提高了恩诺沙星、硫酸多黏菌素对耐药菌抗菌的活性，也解决了市售恩诺沙星溶液剂型易析晶的不足。该复方注射液不仅具有适宜的pH，还可在低温及室温下长期储存。本发明的进一步开发不仅将有利于临床中动物细菌尤其是耐药菌感染的治疗，还可延缓病原菌耐药性的发展，是我国“减量、增效”政策的一次切实的实践。

具体的，本发明提供如下技术方案：

本发明的第一个方面提供一种兽用恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液，其特征在于所述注射液的成分按质量/体积混合前构成如下的制剂组成：

（1）恩诺沙星2.0~10.0%；

（2）硫酸多黏菌素1.0~5.0%；

（3）助溶剂0.5%~2.0%；

（4）酸度调节剂0.5~3.0%；

（5）潜溶剂20.0%~45.0%；

（6）络合剂0.2~0.5%；

（7）其余为注射用水。

在一个优选的实施方式中，所述注射液的成分按质量/体积混合前构成如下的制剂组成：

（1）恩诺沙星2.0~5.0%；

（2）硫酸多黏菌素1.0~2.5%；

（3）助溶剂0.5%~2.0%；

（4）酸度调节剂0.5~3.0%；

（5）潜溶剂20.0%~45.0%

（6）络合剂0.2~0.5%

（7）其余为注射用水。

在一个优选的实施方式中，所述的助溶剂选自谷氨酸钠、葡甲胺、三乙醇胺、氢氧化钠中的一种或其组合；优选的，助溶剂选自氢氧化钠。

在另外一个具体的实施方式中，所述的酸度调节剂为正丁酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸中的一种或其组合；优选的，所述的酸度调节剂为苹果酸和/或乳酸；最优选的为乳酸。

在另外一个具体的实施方式中，所述的潜溶剂为聚乙二醇-400、正丁醇、乙醇中的一种或其组合；优选的，所述的潜溶剂为1,2-丙二醇和/或聚乙二醇-400。

在另外一个具体的实施方式中，所述的络合剂为依地酸二钠、依地酸钙中的一种或其组合；优选的为依地酸二钠。

本发明的第二个方面是提供第一方面所述的一种兽用恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液的制备方法，具体的，所述的方法包括如下步骤：

1）按配方量称取助溶剂、络合剂，用注射用水溶解后，加入配方量的恩诺沙星，室温搅拌至完全溶解，滤膜过滤除菌后，备用；

2）按配方量称取酸度调节剂、潜溶剂，用注射用水溶解后，加入配方量的硫酸黏菌素，室温搅拌至完全溶解，滤膜过滤除菌后，备用；

3）将1）中滤液加入滤液2）中，并不断搅拌至获得澄清的混合液，于负压真空下滤膜过滤除菌后，即得复方注射液。

在一个优选的实施例中，所述步骤1）-3）中的过滤是采用0.22 μm的膜过滤除菌；

在另外一个具体的实施方式中，所述步骤3）中的负压真空是-0.1~0.05 个大气压。

本发明的第三个方面是提高含恩诺沙星的复方注射液的稳定性的方法，所述的方法为：在所述的复方注射液中添加助溶剂、潜溶剂、酸度调节剂以及络合剂；

在一个优选的实施方式中，所述的助溶剂选自谷氨酸钠、葡甲胺、三乙醇胺、氢氧化钠中的一种或其组合；优选的，助溶剂选自氢氧化钠。

在另外一个具体的实施方式中，所述的酸度调节剂为正丁酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸中的一种或其组合；优选的，所述的酸度调节剂为苹果酸和/或乳酸；最优选的为乳酸。

在另外一个具体的实施方式中，所述的潜溶剂为聚乙二醇-400、正丁醇、乙醇中的一种或其组合；优选的，所述的潜溶剂为1,2-丙二醇和/或聚乙二醇-400。

在另外一个具体的实施方式中，所述的络合剂为依地酸二钠、依地酸钙中的一种或其组合；优选的为依地酸二钠。

在另外一个优选的实施方式中，所述的含恩诺沙星的复方注射液为恩诺沙星-多黏菌素复方注射液。

本发明的第四个方面是第一方面所述的兽用恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液在制备治疗细菌感染的药物中的应用。

在一个具体的实施方式中，所述的细菌包括但不限于肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、胸模肺炎放线菌、沙门氏菌、MRSA、多杀性巴氏杆菌。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的兽用高稳定性恩诺沙星--硫酸多黏菌素复方注射液一方面利用多黏菌素破坏细菌外膜的特点，极大程度上增强了恩诺沙星进入细菌胞质的能力，提高了恩诺沙星对病原菌尤其是耐药菌的抗菌活性；另一方面，硫酸多黏菌素靶向外膜的特点也有利于耐受恩诺沙星的休眠亚群的清除。在提高恩诺沙星和硫酸多黏菌素使用效力的同时，也可延缓耐药性的产生。同时，该复方注射液既提高了恩诺沙星溶解度及稳定性，又保证了临床应用中注射剂的使用，规避了原剂型适口性差及刺激性大的问题，可保证于低温（4℃）和加速（30℃）条件下长期储存不析晶，有利于恩诺沙星和硫酸多黏菌素的临床应用。该混悬液工艺中所采用酸碱中和结晶法和潜溶法对仪器设备和人员素质要求较低，且辅料成本低廉易得，利于工业上的大规模生产。此外，该复方注射液的提出将可与国外相似产品竞争市场份额，减少国外产品对我国兽药市场的冲击，将有利于提高我国兽药企业的国际竞争力。该复方注射液市场前景广阔，可肌注用于防治猪、牛、羊、鸡等动物由多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎链球菌、支原体等特别是相关耐药菌引起的畜禽感染。

附图说明

图1 市售恩诺沙星注射液（拜有利注射液）的说明书

图2 基于参考发明专利（授权号：CN 111821258 B）中技术方案所制备的复方口服溶液析晶情况：A海藻酸丙二醇酯和荞麦蛋白多糖按料液质量比1：4制成溶液实际为糊状半固体物质，B，按照参考发明专利方法制备的100 mL体系下层有大量沉淀；

图3 恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用时对动物源病原菌的协同效力：A 肺炎克雷伯菌WNX-1, B 沙门氏菌80048, C 肺炎克雷伯菌25-2, D 肺炎克雷伯菌 29-1, E 肺炎克雷伯菌37-1, F MRSA T144；

图4 恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用时对恩诺沙星耐药肺炎克雷伯菌的抗菌优势；

图5 本发明复方注射液的皮肤刺激性与注射部位刺激性：A、C、E为兔左侧后腿（生理盐水）注射部位在连续注射第7 d时皮肤状态，B、D、F为兔右侧后腿（复方注射液）注射部位在连续注射第7 d时皮肤状态；

图6 本发明复方注射液对兔子血常规、血生化的影响；

图7 本发明复方注射液对兔子注射部位肌肉损伤及肝脏肾脏的组织病理学影响；

图8 本发明复方注射液对小鼠多杀性巴氏杆菌感染模型的治疗效果，A PBS组与复方注射液治疗组的小鼠生存曲线, B 存活小鼠肺部载菌量。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 复方注射液中助溶剂种类的确定

制备饱和谷氨酸钠、葡甲胺、三乙醇胺、氢氧化钠溶液，使用饱和溶液分别溶解2.5g恩诺沙星至完全溶解，记录所用饱和溶液体积。结果显示助溶剂对恩诺沙星的助溶作用从强到弱依次为氢氧化钠、三乙醇胺、谷氨酸钠、葡甲胺，因此选用氢氧化钠作为复方注射液助溶剂。

实施例2 复方注射液中酸度调节剂种类的确定

使用氢氧化钠饱和溶液37 mL恰好将2.5 g恩诺沙星完全溶解，以获得碱性条件的恩诺沙星饱和溶液五份，分别向其中逐滴加入正丁酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸，在此过程中溶液快速浑浊，继续滴加，溶液逐渐澄清，至完全澄清时止。记录此过程中所用的酸溶液用量，并将获得澄清溶液于室温中静置，观察溶液沉淀情况。结果如表1所示，乳酸及苹果酸酸度调节所用体积较少且室温放置48 h无沉淀析出，但苹果酸原料成本较高，因此选用乳酸作为复方注射液酸度调节剂。

表1复方注射液酸度调节剂的确定

实施例3 复方注射液中潜溶剂种类的确定

组方中原辅料种类和用量如表2所示：

表2. 一种复方注射液的原辅料种类和用量

按表2中所列原辅料种类及其用量，称取所需用量，按以下制备方法进行制备：

1）按表2称取助溶剂、络合剂，用30 mL注射用水溶解后，加入配方量的恩诺沙星，室温搅拌至完全溶解，0.22 µm滤膜过滤除菌后，备用；

2）按表2称取酸度调节剂，用20 mL注射用水溶解后，按表2所示量分别加入乙醇/正丁醇/丙二醇/聚乙二醇-400中的一种作为潜溶剂，加入配方量的硫酸多黏菌素，室温搅拌至完全溶解，0.22 µm滤膜过滤除菌后，备用；

3）将1）中滤液加入滤液2）中，并不断搅拌至获得澄清的淡黄色溶液，于0.08个大气压下用0.22 µm滤膜过滤除菌后，封装于5个30 mL的棕色中硼硅玻璃瓶中，即得复方注射液。

将上述含有不同潜溶剂的4种复方注射液至于30℃培养箱放置15 d，期间每天观察析晶情况，记录于表3。如表3所示，与不加潜溶剂组相比，吐温-80、正丁醇、乙醇、1,2-丙二醇和聚乙二醇-400组均对复方注射液的析晶情况有所改善，其中1,2-丙二醇和聚乙二醇-400组在15 d时仍未观察到析晶，因而后续制备过程中将1,2-丙二醇和/或聚乙二醇-400拟定为潜溶剂。

表3. 含不同潜溶剂复方注射液的析晶情况

实施例4 复方注射液中潜溶剂、pH、络合剂用量的确定

由于本发明制备的是恩诺沙星-硫酸多黏菌素的水针剂，恩诺沙星与Ca

在本研究中选用常用的依地酸二钠作为螯合剂，按照FDA推荐的依地酸二钠注射时的用量范围（0.01%~0.1%）（https://db.yaozh.com/），设置0.02~0.03%、0.05~0.06%、0.1~0.11% 3个梯度水平进行试验；以1,2-丙二醇为潜溶剂，分别设置30~35%、35~40%、40~45%3个水平进行试验；pH值分别设置3.5~4.0、4.5~5.0、5.0~5.5 3个水平（表3）。也即以3因素3变量共9组不同组合的正交设计来考察不同络合剂、pH和潜溶剂用量下复方溶液于30℃下90 d内的析晶情况，以最终确定上述参数。

表4. 正交试验设计表

表5 正交试验结果

实施例5 本发明提供复方注射液与市售恩诺沙星注射液（拜有利注射液）pH对比

用注射器分别吸取本发明复方注射液与市售恩诺沙星注射液（拜有利注射液，批号KV03XF8，图1为其产品说明书）各5 mL于10 mL离心管中，用校准后的pH计进行pH检测，每组3个重复。结果显示市售恩诺沙星注射液（拜有利注射液）的pH值为10.95 ± 0.13，本发明的pH值为5.0 ± 0.11。可见本发明提供的恩诺沙星-硫酸多黏菌素复方注射液的pH范围更接近动物生理pH，与市售恩诺沙星注射液（拜有利注射液）相比预期对靶动物将具有更好的顺应性。

实施例6 对发明专利（授权号：CN 111821258 B）中所提供复方口服液的重复

按照发明专利（授权号：CN 111821258 B）实施例中所述方法进行恩诺沙星-硫酸多黏菌素复方口服溶液的制备。主要问题有二：

（1）按专利描述辅料无法完全溶解：专利所述内容“海藻酸丙二醇酯和荞麦蛋白多糖按料液质量比1：4制成溶液”实际为糊状半固体物质而非专利（授权号：CN 111821258 B）所述的溶液（图2A）。经尝试，实则应为海藻酸丙二醇酯和荞麦蛋白多糖按料液比1：8加入注射用水，且需90℃水浴加热20 min才可溶解为溶液；

（2）制备出的溶液有明显沉淀，应为混悬液，与其“溶液型外观和不析晶”的相关描述不符。

如图2B所示，按发明专利（授权号：CN 111821258 B）中的技术方案所制备出的100mL体系下层有大量沉淀，并非专利所述“均一澄清溶液”。同时，室温避光7 d后，离心取上层澄清液体使用高效液相色谱（HPLC）对恩诺沙星含量进行检测，结果显示恩诺沙星含量仅为2.8%，与专利（授权号：CN 111821258 B）中提到的理论值5.0%严重不符，表明按照专利（授权号：CN 111821258 B）的技术方案制得的制剂形式十分不稳定。且本领域内公知，恩诺沙星味极苦，作为口服液使用时不难揣测上清液中大量游离的恩诺沙星将引起适口性的问题。因此，发明专利（授权号：CN 111821258 B）所述技术方法无法制得其所述“不易析晶、适口性较好”的恩诺沙星-硫酸多黏菌素复方口服溶液。基于此，为给我国兽医临床提供一种高效、质量合格的恩诺沙星-硫酸多黏菌素复方制剂产品，提升我国兽药企业的国际竞争力，本发明经过周密地的组方配伍研究，提出了更加合理的技术方案。

实施例7 恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用时对猪源病原菌的协同效力考察

分别将肺炎克雷伯菌（WNX-1、37-1、29-1、25-2）、大肠杆菌（OF B2 D19、OF 25922D38）胸膜肺炎放线杆菌（杭8）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（T144）、沙门氏菌（80048）和多杀性巴氏杆菌（P32 D7）复苏，传代。

按照CLSI规定的方法进行棋盘试验验证恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用时的效力。具体方法如下：

1）用新鲜的肉汤培养基把原菌液稀释到浓度为~10

2）在试管架上摆两排试管，每排7支，第1排用于稀释A药，第2排用于稀释B药；在第1排试管中，把A药用肉汤培养基作2倍稀释，使1~7管的A药浓度依次为2 MIC、1 MIC、1/2MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC，B药同A药稀释步骤一致；

3）分别把A与B药菌药液按顺序加入96孔细胞培养板的横排与竖列的各孔中；把第1管的A药液依次加到细胞培养板横排第1排8个孔中，每孔50 µL，第2管的药液依次加到第2排8个孔中，每孔50 µL。同法向第3~7排各孔加入第3~7管的A药液。第8排作为B药的单独的药敏对照，不加A药；B药按照A药方法；

4）依次加入竖排的1~7孔；随后横排和竖排第8列各加入50 µL MH肉汤，然后在各孔中加入100 µL上述稀释好的菌液，使得菌液的终浓度为10

5）结果判断：通过以下公式计算恩诺沙星与硫酸多黏菌素的协同或者相加指数。其中当FICI ≤ 0.5时为协同作用，当0.54时为拮抗作用。

表 6. 恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用时对猪源病原菌的协同效力

注：MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；ENR：恩诺沙星；Coli：硫酸多黏菌素

恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用时对常见猪源病原菌的协同效力如表1所示。由表可知肺炎克雷伯菌（WNX-1）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（T144）和沙门氏菌（80048）对恩诺沙星的耐药水平均较高，当添加硫酸多黏菌素时，以上高水平耐药菌株对恩诺沙星的敏感性显著升高，最大增效效力可达16倍。虽然胸膜肺炎放线杆菌（杭8）对恩诺沙星较为敏感，但添加硫酸多黏菌素后，其MIC值仍下降了16倍。且作为革兰氏阳性菌的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（T144）对恩诺沙星的敏感性也显著降低。此外，在两者联用时，以上菌株对硫酸多黏菌素的敏感性菌也显著降低，最高可达16倍。以上结果表明，恩诺沙星与硫酸多黏菌素联用可显著增加两者的抗菌活性，尤其是对耐药菌的抗菌活性，证明本发明所提供复方配伍的合理性。

实施例8 恩诺沙星与硫酸黏菌素联用对肺炎克雷伯菌滞留菌亚群的抑制作用

1.材料与方法

药物浓度设置：恩诺沙星及硫酸多黏菌素的10倍及1倍MIC的浓度，以及同时含有两药物0.5倍MIC的浓度。

菌液制备：挑取细菌单菌落，接种于1ml LB肉汤中利用麦氏比浊仪调至0.5麦氏浊度，加入含有不同药物浓度的培养基中，初始菌浓度为10

试验操作：将菌液加入含有不同浓度药物的培养基中，在0、2、4、6、12 h时取100 µL菌液，经PBS进行稀释，至合适稀释倍数时取100 µL液体涂布于BHA平板中，置于37℃培养箱中过夜培养，进行菌落计数。

2.试验结果

本试验结果如说明书图4所示。WNX-1菌株为恩诺沙星耐药菌株（MIC值为256 µg/mL），其在2560 µg/mL恩诺沙星（10×MIC）的处理4-6 h时出现了明显的滞留菌特点，即在前4 h快速杀菌而后曲线出现了较为平缓的趋势，并于6 h后细菌开始逐渐繁殖增长。相较于恩诺沙星，10×MIC的硫酸多黏菌素可在4 h将细菌完全杀死，而单独1倍MIC浓度作用下，无论恩诺沙星还是硫酸多黏菌素都无法将细菌完全杀死，在经历药物作用4-6 h后，滞留菌对硫酸多黏菌素也产生短暂耐受并开始繁殖生长，这提示着肺炎克雷伯菌滞留菌亚群对抗生素特别是繁殖期杀菌剂（恩诺沙星）具有极强的抵抗能力。基于滞留菌亚群背景下的重新生长预示着肺炎克雷伯菌复发感染的风险以及该亚群高的耐药突变概率。

如图3A-图3F所示，联合用药组则表现出了明显的优势。联用时，两种药物在0.5倍MIC时，均对耐药克雷伯菌表现出优越的杀菌效力，12 h的杀菌效力与10×MIC的硫酸多黏菌素效力相当，且杀菌过程中未出现平台期，消除了滞留菌亚群带来复发感染的风险。并且联合使用时，硫酸多黏菌素的杀菌速度也得到了显著提升; 具体结果分别为图3A为WNX-1菌株，图3B 沙门氏菌80048, 图3C 肺炎克雷伯菌25-2, 图3D 肺炎克雷伯菌 29-1, 图3E肺炎克雷伯菌37-1, 图3F MRSA T144。以上结果表明，恩诺沙星与硫酸多黏菌素的联合使用是减少用量，延缓耐药性发展的良好策略。

实施例9 复方注射液的加速稳定性与低温稳定性

根据本专利所述制备工艺制备注射用复方溶液，分装至棕色中硼硅瓶中，每瓶约20 mL。

加速稳定性试验：将已分装的复方溶液置于30℃，于第1、2、3、6月取出少量液体测定其pH，并使用高效液相色谱（HPLC）检测溶液中有效成分含量及相关物质（环丙沙星）含量。同时眼观其可见异物、析晶情况、外观颜色等，判断本发明复方制剂的稳定性。

低温稳定性试验：将已分装的复方溶液置于4℃，于第1、2、3、6月主要考察所制复方溶液析晶情况，以评估复方溶液的低温稳定性。

试验结果

如下表所示为30℃加速稳定性试验组析晶情况，可见组别1、6，具有长期稳定性，6个月未见晶体析出。而1组在4℃加速稳定性试验中30天可见中等晶体析出，综合来看，正交试验6组稳定性最强。

表7 30℃加速稳定性试验析晶情况及pH变化

注：－：未见晶体析出；＋：少量晶体析出；＋＋：中度晶体析出；＋＋＋：大量晶体析出

表8 30℃加速稳定性试验恩诺沙星相对含量（%）

表9 4℃加速稳定性试验析晶情况

实施例10 复方注射液的皮肤刺激性与安全性考察

根据本专利所述制备工艺制备注射用复方溶液，在按照上述实施例组别6，贮存6个月的复方注射制剂进行实验。以2倍推荐剂量对成年公兔肌肉注射连续7d，于第1 d至第7d，每日对兔右侧后腿肌肉注射复方溶液，左侧后腿肌肉注射同体积生理盐水，恢复一周后于第14 d再次进行采样观察。于第0、7、14 d对实验兔进行耳缘静脉采血，EDTA抗凝管中加入0.5 mL血液进行血常规检测，并另取1 mL血液室温静置20-30 min，2000-3000 rpm离心10 min，分离上层血清进行肝功能（血清谷丙转氨酶ALT、血清谷草转氨酶AST、总蛋白TP、白蛋白ALB）、肾功能（尿素UREA、肌酐CREA）等血生化指标检测。并于第7 d进行注射部位皮肤刺激性与注射部位刺激性考察，于第14 d取兔肝脏、肾脏、注射部位肌肉组织于4%多聚甲醛中固定，并进行HE染色，观察组织学变化。

如图5所示，A、C、E为兔左侧后腿（生理盐水）注射部位，B、D、F为兔右侧后腿（复方注射液）注射部位在连续注射第7 d时皮肤状态，均未见异常变化。如图6所示，血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）等肝功能指标以及尿素（UREA）、肌酐（CREA）等肾功能指标在连续注射7 d后未发生显著变化，对红细胞数（RBC）、白细胞数(WBC)及血小板(PLT)数量也未产生显著影响。如图7所示，处理组和空白对照组肌肉组织未见明显病理变化，因此，复方注射剂不会对注射部位造成病理损伤。另外处理组和空白组肝脏组织未见明显炎性细胞浸润和肝细胞坏死，肾组织中未见炎症细胞浸润、组织间隙水肿、淤血、微血栓以及肾小管坏死等病理变化。因此，本发明复方注射液无皮肤刺激性和注射部位刺激性，2倍推荐剂量下连续给7 d不影响兔的基本生理状态以及肝功能和肾功能，有较好的安全性。

实施例11 复方注射液对小鼠多杀性巴氏杆菌感染模型的治疗效果

1.建立多杀性巴氏杆菌呼吸系统感染模型

根据本专利所述制备工艺制备注射用复方溶液，在按照上述实施例组别6，贮存6个月的复方注射制剂进行实验。

选用20-25g雌性ICR小白鼠进行实验，在实验开始前，每只小鼠腹腔注射 100 μL浓度为 1%戊巴比妥钠进行麻醉，将小鼠竖直悬挂，捏住鼻子并用镊子拉出小鼠舌头，使用移液枪向小鼠气管中灌入75 μL菌液（该菌对恩诺沙星、硫酸多黏菌素的MIC分别为：16 µg/mL和1 µg/mL），菌液浓度为~6× 10

感染后每6 h观察小鼠状态，在小鼠死亡后，取肺部组织研磨，用PBS以10倍梯度稀释研磨液，并涂布于含1/4 MIC恩诺沙星的绵羊血平板上，于37℃培养箱中24 h后计算平板上菌落数量。并于感染后120 h处死所有小鼠，取肺部组织研磨涂平板计数。

2.试验结果

感染120 h内，PBS组与复方注射液治疗组的小鼠生存曲线如图8A所示，结果证明复方注射液能有效减缓小鼠感染程度，并有效提高存活率。如图8B所示，存活小鼠肺部载菌量有显著下降。总之，本发明所提供的复方注射液对多重耐药多杀性巴氏杆菌感染有着优越的治疗效果，其对畜禽临床常见细菌及支原体感染疾病将有显著治疗效果。

以上实施例是本发明的最优选的方式，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。