一种减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因及其载体、重组菌和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因及其载体、重组菌和应用。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum)，属于茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)作物，是世界第三大粮食作物。

马铃薯种质资源丰富，其中，彩色马铃薯色泽鲜艳、营养丰富，具有较高的附加值和一定的市场发展潜力。彩色马铃薯富含花色素苷，具有抗氧化能力，在提高人体免疫力、抑制炎症反应和提高抗癌能力等方面具有重要作用。

据此，可对马铃薯块茎花青素调控因子进行研究鉴定及功能分析，以深入了解花青素的生物合成机制，为彩色马铃薯品种的创制提供理论基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因及其载体、重组菌和应用。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因，所述StMYB_36基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的优选方式之一，所述StMYB_36基因的克隆步骤如下：提取彩色马铃薯总RNA并反转录为cDNA；设计特异性扩增引物StMYB 36-F和StMYB_36-R；以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因StMYB_36；其中，特异性扩增引物StMYB_36-F和StMYB_36-R的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

一种重组载体，包括上述减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因。

作为本发明的优选方式之一，所述重组载体具体为pRI101-35S-StMYB_36-GFP。

作为本发明的优选方式之一，所述重组载体pRI101-35S-StMYB_36-GFP的构建方法如下：利用同源重组法将StMYB_36基因序列插入到载体pRI101-35S-GFP的Sal I、BamH I酶切位点之间。

一种重组菌，包括上述减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因。

作为本发明的优选方式之一，所述重组菌的构建方法如下：将所述StMYB_36基因构建的重组载体pRI101-35S-StMYB_36-GFP导入菌体。

所述重组载体pRI101-35S-StMYB_36-GFP及对应构建的重组菌，用于验证StMYB_36基因与马铃薯块茎花青素累积之间的具体关系；经验证，本发明StMYB_36基因可以有效减少马铃薯块茎花青素累积。

对应地，本发明同时提供一种上述减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因的应用，即，可通过抑制StMYB_36基因的表达提升马铃薯花青素含量，为培育高花青素含量的马铃薯品种提供理论依据。

本发明相比现有技术的优点在于：本发明提供的StMYB_36基因可有效减少花青素累积，可通过抑制此基因表达来提升花青素含量，为培育高花青素含量的马铃薯品种提供理论依据。

附图说明

图1是实施例1中StMYB_36基因克隆凝胶电泳图；

图2是实施例2中pRI101-35S-GFP载体酶切电泳图；

图3是试验例1中的EV、StMYB_36、EV+StMYB_243以及StMYB_243+StMYB_36重组载体瞬时转化植株的表型图；

图4是试验例1中的EV、StMYB_36、EV+StMYB_243以及StMYB_243+StMYB_36重组载体瞬时转化植株的花青素含量测定结果图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。同时，以下实施例中所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。

实施例1

本实施例的一种减少马铃薯块茎花青素累积的StMYB_36基因：

StMYB_36基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

StMYB_36基因的克隆步骤为：

(1)将彩色马铃薯‘K149-12’材料进行试管苗继代，于玻璃温室中正常生长。结薯期进行收薯，并取块茎样本，立即放入液氮中，于-80℃保存。

(2)采用相应试剂盒提取上述彩色马铃薯块茎的总RNA，并反转录为cDNA。

(3)根据StMYB_36基因的序列，设计特异性扩增引物StMYB_36-F和StMYB_36-R；特异性扩增引物StMYB_36-F和StMYB_36-R的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

(4)以cDNA为模板，利用高保酶进行PCR扩增；其中，PCR扩增体系为：cDNA 1μL，2XHigh-Fidelity Master Mix 25μL，特异性引物StMYB_36-F和StMYB_36-R各1μL，ddH

(5)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收，获得StMYB_36基因片段；电泳结果如图1所示。

(6)将目的片段构建至pMD19载体，转化大肠杆菌，经公司测序后获得目的基因序列。

实施例2

本实施例的一种重组载体pRI101-35S-StMYB_36-GFP的构建：

(1)根据pRI101-35S-GFP载体序列及酶切位点设计加接头引物StMYB_36-GF和StMYB_36-GR，序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；利用高保酶进行“加接头StMYB_36目的片段”扩增，扩增体系及程序同实施例1基因克隆。

(2)利用限制性内切酶Sal I和BamH I对pRI101-35S-GFP载体进行双酶切，获得“线性化载体”；图2为pRI101-35S-GFP载体酶切电泳图。

(3)利用胶回收试剂盒分别对“加接头StMYB_36目的片段”和“线性化载体片段”进行回收，并通过同源重组试剂盒(购自汉恒生物公司)进行目的片段与pRI101-35S-GFP载体连接。其中，连接体系为：StMYB36接头引物扩增片段2μL，线性化pRI101-35S-GFP载体1μL，2X HB-infusion MIX 10μL，ddH

实施例3

本实施例的一种重组菌的构建：

将实施例2构建的重组载体pRI101-35S-StMYB_36-GFP导入大肠杆菌DH5α中，具体方法为：

(1)将感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。

(2)吸取5μL连接产物至50μL感受态中，轻柔吸打混匀。

(3)冰浴30min，然后42℃热激45s，再冰浴3min。

(4)于超净台加入700μL LB液体培养基，37℃培养箱，200r/min震荡培养1h。

(5)5000rpm离心5min，去除500μL上清。

(6)利用剩余上清液将菌块吸打混匀，涂布于含卡那的固体LB培养基上过夜培养。

实施例4

本实施例的一种StMYB_36烟草瞬时转化植株的获得：

(1)利用质粒提取试剂盒对实施例3获得的重组菌进行重组质粒提取，并转化农杆菌GV3101。

(2)利用农杆菌注射法进行烟草叶片侵染，获得目标所需的“pRI101-35S-StMYB_36-GFP瞬时转化烟草材料”。

试验例1

本试验例用于验证本发明StMYB_36基因与马铃薯花青素含量之间的关系：

利用上述实施例方法构建四组瞬时转化烟草材料：

第一组：利用pRI101-35S-GFP空载质粒进行烟草叶片侵染转化的烟草材料，以下简称为“EV”。

第二组：本发明实施例4对应的pRI101-35S-StMYB_36-GFP瞬时转化烟草材料，以下简称为“StMYB_36”。

第三组：利用“pRI101-35S-GFP空载质粒”和“pRI101-35S-StMYB_243-GFP质粒”同时对烟草叶片进行侵染转化的烟草材料，以下简称为“EV+StMYB_243”；其中，StMYB_243基因即为本领域马铃薯StAN1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，该基因编码的StMYB_243为目前已得到证实的花青素生物合成促进因子。

第四组：利用“pRI101-35S-StMYB_36-GFP”和“pRI101-35S-StMYB_243-GFP质粒”同时对烟草叶片进行侵染转化的烟草材料，以下简称为“StMYB_243+StMYB_36”。

图3是EV、StMYB_36、EV+StMYB_243及StMYB_243+StMYB_36重组载体瞬时转化植株的表型图。由图3可知：“EV”和“StMYB_36”表型无明显变化，“EV+StMYB_243”叶片具有明显的色素累积，“StMYB_243+StMYB_36”叶片中色素累积减少。

同时，对注射的各组烟草叶片进行取样，并测定花青素含量。

图4为EV、StMYB_36、EV+StMYB_243及StMYB_243+StMYB_36重组载体瞬时转化植株的花青素含量测定结果图。由图4可知：“EV”和“StMYB_36”瞬时转化植株叶片中几乎无花青素累积，“EV+StMYB_243”叶片中具有显著的花青素累积，而“StMYB_243+StMYB_36”重组载体瞬时转化植株中花青素含量相较于“EV+StMYB_243”转化植株叶片中花青素累积显著减少。

综上，本发明StMYB_36基因可有效减少马铃薯块茎花青素累积，后续，可通过抑制StMYB_36基因的表达提升马铃薯花青素含量，为培育高花青素含量的马铃薯品种提供理论依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。