一种干腌火腿源抗炎活性肽及其制备方法和鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种干腌火腿源抗炎活性肽及其制备方法和鉴定方法，特别涉及一种基于快速制备和in silico筛选的抗炎活性肽鉴定方法。

背景技术

炎症是活体组织对外源性和内源性损伤因子引起的各种各样的损伤性病变所产生的防御反应，近年来，越来越多的研究表明炎症与肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、免疫系统疾病、炎症性肠病等多种慢性非传染性疾病息息相关。这些非传染性炎症疾病的发病率逐年增加，寻求有效治疗药物和方法已经成为相关领域研究聚焦点。

目前市面上常见的消炎药有甾体类药物、非甾体类药物和抗生素。尽管这些药物具有一定的临床疗效，但长期服用后患者还可能面临伴发胰腺炎、多种感染等疾病的危险，药物的长期毒性或类固醇依赖性限制某些病人无法使用或必须停用药物，所以迫切需要无副作用的天然替代治疗方案。

多糖(LPS)是一种常见的内毒素，在体内可以通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成和释放多种细胞因子和炎性介质，进而引起机体一系列的反应。其主要作用机理已研究的较为透彻，当LPS进入机体入血后，脂多糖结合蛋白LBP可以识别LPS，与LPS单体结合运送至髓源性细胞表面。髓源性细胞表面的mCD14与之结合，形成LPS-LBP-CD14三联复合体，随后将其转运至TLR4-MD2蛋白复合体处，三联复合体在MD-2的帮助下与TLR4结合，激活TLR4，使之二聚体化。TLR4被激活后，胞内的集团构象发生变化，将信号传入胞内，从而活化胞内信号转导通路。信号传至细胞内后，下游相关通路相继被激活如NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)两条通路，生物活性因子如NO和炎症因子IL-6和TNF-α等最终被释放。

细胞炎症模型由于操作简单、成本低、周期短，一直是研究人员进行抗炎药物开发和机制研究的首选。目前常用的细胞炎症模型包括小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠小胶质细胞BV2炎症模型，常用的方法就是用LPS诱导细胞产生炎症反应。

研究表明食物蛋白源生物活性肽是调节机体代谢、促进人体健康的潜在功效因子。生物活性肽通常由2-20个氨基酸组成，具有抗炎、降压、降糖和抗氧化等功能特性。与蛋白质相比，肽具有低分子量、易被吸收、高稳定性等特点。1972年Jennifer等人首次从蜂毒中分离鉴定出抗炎肽，其效果超过部分的非甾体类药物，在这之后不断有研究人员从不同对象中分离鉴定出抗炎肽，现今，从食源性原料中分离鉴定出抗炎肽被广泛研究。

通过实验室实验逐步纯化抗炎肽具有劳动密集型、昂贵和耗时的特点，因此很难以高通量的方式应用。此外，随着新一代测序技术的快速发展和广泛应用，对快速、廉价和高效的计算方法的需求越来越大。因此，实验室实验验证和通过应用有效抗炎肽性质的数据库相结合以及分子对接模拟抗炎肽在关键通路上的作用靶点，有望实现快速且大量抗炎肽的发现过程。

干腌火腿中含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、人体必需维生素与矿物质，各类营养成分组成均衡，是一种食用价值极高的中华传统肉制品。丰富的地区水热资源为金华火腿的制作提供了有利的条件。腌制后的火腿在自然发酵过程中，其肌肉蛋白发生水解反应，生成具有不同功能特性的生物活性肽具有较高的保健作用，其中对火腿的整刀修建过程中会产生边角料，其适合作为研究提取抗炎肽的优良对象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗炎活性肽及其制备方法和鉴定方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种抗炎活性肽，氨基酸序列自C端至N端为：

Leu-Glu-Leu-Leu-Lys；

Leu-Leu-Leu-Leu-Ser；

Ile-Leu-Ile-Leu-Leu-Thr-Ile-Leu-Glu-Phe；

Gln-Phe-Ala-Glu-Glu-Asn-Gly-Leu-Leu-Phe-Leu-Glu-Ala-Ser-Ala-Lys；

Ala-Leu-Gln-Lys-Leu-Glu-Glu-Ala-Glu-Lys-Ala-Ala-Asp-Glu-Ser-Glu-Arg；

Glu-Ala-Glu-Glu-Arg-Ala-Asp-Ile-Ala-Glu-Ser-Gln-Val-Asn-Lys-Leu-Arg。

优选的技术方案为：从干腌火腿中提取出多肽粗体物，采用大孔树脂层析和弱阴离子层析纯化出具有抗炎活性的组分。

优选的技术方案为：包括下列步骤：

步骤1：去除火腿碎肉的肌肉脂肪和筋膜组织，然后加入至盐酸中，在冰上匀浆，接着离心取离心管中全部上清液采用膜分离技术进行分离，截留分子量为3kDa及其以下粗提物，干燥后得到低聚肽粉；

步骤2：将低聚肽粉复溶配置成粗肽液，用0.45μm的水相微孔滤膜进行过滤后，应用大孔树脂分离纯化，上样体积为10mL，洗脱流速5-7ml/min，洗脱组分时先用超纯水洗脱，待基线平稳时再用50％-90％乙醇洗脱，收集获得两个组分：JHP-P1和JHP-P2；应用离子交换层析将JHP-P2分离纯化为JHP-P2-P1和JHP-P2-P2；

步骤3：选取抑制炎症细胞分泌促炎因子效果最好的组分进行鉴定，所述组分的氨基酸序列如权利要求1所述。

优选的技术方案为：包括下列步骤：应用离子交换层析将JHP-P2分离纯化为JHP-P2-P1和JHP-P2-P2的具体操作：JHP-P2在10mg/mL超纯水中重新溶解，过滤，然后应用于DEAE Sepharose FF预装柱分离纯化，流速为5mL/min，上样体积2ml，在214nm波长下测量每个馏分的吸光度。采集后，对JHP-P2-P1和JHP-P2-P2进行浓缩干燥。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种抗炎活性肽的鉴定方法，应用现存多肽数据库对权利要求1所述的抗炎活性肽进行鉴定，具体包括：

(1)使用抗炎肽预测模型AIP-Stack对7肽及其以上进行抗炎或许预测；

(2)使用Pre-AIP服务器Prediction of Anti-inflammatory Peptides对7肽以下是否具有抗炎活性进行打分预测；

(3)使用细胞穿透性预测工具CPPpred筛选穿透性较好的长链肽；

(4)使用毒性预测工具https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred和溶解性计算工https://www.genscript.com/tools/peptide-molecular-weight-calculator筛选无毒性和溶解性较好的多肽；

(5)在BIOPEP数据库Katedra Biochemii

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明筛选出的低聚肽具有较强抗炎活性，具有高效、制备方法简单和重复性好的特点，在食品、医药等领域有广阔前景，可以应用于缓解炎症功能性食品。

附图说明

图1：A为金华火腿粗多肽(JHP)大孔树脂(DA201-C)分离纯化的两个组分；JHP-P1和JHP-P2；B为JHP-P2弱阴离子交换(DAEA FF)分离纯化的两个组分JHP-P2-P1和JHP-P2-P2。

图2：A为DA201-C分离纯化后各组分对照LPS阳性组减少的NO生成量；B为DAEA FF分离纯化后各组分对照LPS阳性组减少的NO生成量。

图3：A为DAEA FF分离纯化后各组分对照LPS阳性组减少的IL-6生成量；B为DAEAFF分离纯化后各组分对照LPS阳性组减少的TNF-α生成量。

图4综合评分前六的肽的一级质谱图。

图5为1-6号肽的TLR4-MD2分子对接图。

图6为LLLLS、ILILLTILEF和ALQKLEEAEKAADESER抑制LPS诱导的RAW264.7分泌NO与TNF-α效果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。

以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。

实施例1：不同疏水性多肽的制备

低聚肽的制备：去除金华火腿碎肉的肌肉脂肪和筋膜组织，然后加入质量体积4-6倍的0.01M HCl中在冰上匀浆，在22000g下共匀浆6次每次10s，接着在12000g和4℃下离心20min，取离心管中全部上清液采用膜分离技术进行分离，截留分子量为3kDa及其以下粗提物，最后将粗体物蒸发浓缩并在-40℃-50℃，冷冻干燥24h得到金华火腿源低聚肽粉(JHP)；-20℃保存，以供进一步研究。在此条件下以一年制金华火腿为例，粗提物含量(每100g碎肉)2.48±0.35g/100g，肽含量76.58±2.28％。

2、多肽分离：将粗肽粉复溶配置成250mg/mL粗肽液，用0.45μm的水相微孔滤膜进行过滤后，上样体积为10mL，洗脱流速5-7ml/min，洗脱组分时先用超纯水洗脱，待基线平稳时再用50％-90％乙醇洗脱。

收集到两个组分：JHP-P1和JHP-P2。如图1A，通过细胞实验发现JHP-P2相较于JHP-P1抗炎活性更好。

(1)细胞培养

RAW264.7小鼠巨噬细胞培养在高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)中，然后将细胞置于含5％CO

(3)NO生成量的测定

将RAW264.7细胞(5×10

空白组：正常培养2h+24h；

诱导组：正常培养2h+LPS(1μg/mL)刺激培养24h；

实验组：加样品(1mg/mL)正常培养2h+LPS(1μg/mL)刺激培养24h；

每孔设置3个重复，培养完成后，收集上清。

采用Griess法测定上清液中NO浓度，其原理为：NO在水中被氧化为亚硝酸盐，该法通过测定亚硝酸盐的含量测定NO含量。具体步骤为：将50μL细胞上清液与50μL GriessⅠ试剂及50μL GriesⅡ试剂混合，3min后于540nm处测吸光值。根据绘制的亚硝酸盐标准曲线计算各样品中测定细胞液的NO含量。

选取抑制炎症细胞分泌NO最好的组分JHP-P2继续采用离子交换(DAEA FF)分离纯化。

JHP-P2在10mg/mL超纯水中重新溶解，过滤(0.45μm)，然后应用于DEAE SepharoseFF预装柱分离纯化。流速为5mL/min，在214nm波长下测量每个馏分的吸光度。采集后，对JHP-P2-P1和JHP-P2-P2进行浓缩干燥，测定抗炎活性，具体如下。

(4)细胞因子NO、IL-6和TNF-α的测定

将RAW264.7细胞(5×10

选取抑制炎症细胞分泌促炎因子效果最好的组分JHP-P2-P1进行nano-HPLC-MS/MS鉴定肽序。

(5)Nano-HPLC-MS/MS鉴定肽序

将样品经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nano LC1200的Orbitrap fusion Lumos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)。共上样3μL样品(分析柱：Acclaim PepMap C18,75μm x 25cm)，以75min的梯度分离样品,柱流量控制在300nL/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相起始，在60min以非线性梯度升高到35％，1分钟内升高到100％，维持14min。

质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS:扫描范围(m/z):200-1500；分辨率:120,000；AGC target：4e5；最大注入时间:50ms；(2)HCD-MS/MS:分辨率:15,000；AGC target：5e4；最大注入时间:50ms；碰撞能量:30％；动态排除时间:30s。

整理质谱数据，去掉丰度为0和没有数据库蛋白来源的多肽，选取有效肽序进行下一步分析。

(6)应用现存多肽数据库对鉴定出的肽序进行in-silico分析。

使用抗炎肽预测模型AIP-Stack对7肽及其以上进行抗炎或许预测；

使用Pre-AIP服务器PredictionofAnti-inflammatoryPeptides(kyutech.ac.jp)对7肽以下是否具有抗炎活性进行打分预测；

使用细胞穿透性预测工具CPPpred(ucd.ie)筛选穿透性较好的长链肽(10肽及其以上)；

使用毒性预测工具(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred)和溶解性计算工具(https://www.genscript.com/tools/peptide-molecular-weight-calculator)筛选无毒性和溶解性较好的多肽；

在BIOPEP数据库(

(7)分子对接

①受体的处理

TLR4-MD2的x射线晶体结构(PDB ID：2Z64)从RCSB蛋白数据库下载，使用Autodocktools1.5.6软件对受体TLR4-MD2进行加氢、去除水分子等。

②受体准备

采用Chemdraw绘制鉴定出的小分子多肽结构

③对接过程

将MOE作为对接软件，将多肽分别与受体蛋白TLR4-MD2进行对接，并对配体的不同构象与TLR4-MD2的晶体结构进行契合度计算并且依次进行打分，对接能一般为负值，值越小表明对接结果得分越高，即配体与受体蛋白之间的结合越紧密，相互作用最强，越可能具有抗炎活性。最后，对单个小分子与配体之间的相互作用进行可视化分析。

以下将通过具体数据对本发明作进一步地解释说明。

分离纯化中选取的高抗炎活性组分依据

不同疏水性多肽对细胞NO分泌量的影响

DA201-C纯化出不同疏水性的两个肽组分JHP-P1和JHP-P2，我们对比了他们和未纯化的JHP抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO生成量的影响：结果如图2A，发现相比较其他组分，JHP-P2可以显著对照LPS炎症模型组减少NO的生产，减少28.48±0.84％。因此继续拿第二个组分JHP-P2进行离子交换分离纯化制备，得到第JHP-P2-P1和JHP-P2-P2，继续探究抗炎活性更好组分。

JHP-P2及其阴离子交换分离组分对NO、IL-6、TNF-α分泌量的影响

如图2B，经LPS刺激后，RAW264.7细胞产生26.86±1.19μM NO，JHP-P2对比炎症模型组在1mg/mL时NO产生18.47±0.37μM，JHP-P2-P1组NO产生22.04±0.84μM，JHP-P2-P2组NO产生19.13±0.82μM。

如图3A，经LPS刺激后，RAW264.7细胞产生707.80±132.35pg/mL IL-6，对照LPS组，JHP-P2-P1产生更少的IL-6：107.28±12.69pg/mL，显著降低了85.01％；如图3B，经LPS刺激后，RAW264.7细胞产生2199.89±178.45pg/mL TNF-α，对照LPS组，JHP-P2-P1产生更少的TNF-α：1858.68±68.96pg/mL，显著降低了15.51％。

综合以上两部纯化结果结合细胞炎症模型实验，可以得出抗炎效果较好的组分是JHP-P2-P1，这个组分可以通过高流速的大孔树脂纯化柱和高载量的弱阴离子交换柱子快速大量地纯化出来。

Nano-HPLC-MS/MS鉴定肽序

串联质谱图经过PEAKS Studio version 10.6(Bioinformatics SolutionsInc.,Waterloo,Canada)分析。PEAKS DB对uniprot-Sus scrofa(version2022,22164entries)数据库搜库，设置none酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02Da，母离子质量容许误差：7ppm，蛋白卡值为1％FDR,至少含1unique peptide；肽段卡值为1％FDR。鉴定出的多肽有3657条，其中分子量小于1kDa的肽占比50.1％，有研究表明，分子量小的肽往往更具有生物活性，因此结合现有多肽数据库作生物信息学分析，可以更好地获得潜在抗炎肽序列。

选择鉴定出的肽序应用现存多肽数据库对鉴定出的肽序进行in-silico分析。

使用高通量抗炎肽预测模型AIP-Stack和Pre-AIP对多肽(7个氨基酸序列及以上和7个以下)是否具有抗炎活性进行打分预测；

使用细胞穿透性预测工具筛选穿透性较好的长链肽(10肽及其以上)；

使用毒性预测工具和溶解性计算工具筛选无毒性和溶解性较好的多肽；

在BIOPEP数据库中对鉴定出的抗炎活性肽进行新颖性检查；最终选择综合模拟评分排名靠前的六条肽。

六条肽具体评分如表1，从表中可以看出作为7肽以下，前两条肽在Pre-AIP服务器中打分接近0.6(其余肽得分未超过)；作为7肽以上，后四条肽得分接近0.9(其余肽得分未超过)，这六条肽均无毒，作为长肽穿透性良好，溶解性包含水溶和脂溶性，可作为潜在抗炎肽继续探究是否能与炎症通路关键蛋白对接。

分子对接技术

将MOE作为对接软件，将多肽分别与受体蛋白TLR4-MD2进行对接，并对配体的不同构象与TLR4-MD2的晶体结构进行契合度计算并且依次进行打分。通常，如果配体与靶蛋白的结合能小于0，则表示配体和受体蛋白可以自发结合，如果配体与靶蛋白的结合能小于-5，则表示配体和受体蛋白之间结合稳定。对接能一般为负值，值越小表明对接结果得分越高，即配体与受体蛋白之间的结合越紧密，相互作用最强，越可能具有抗炎活性。

TLR4-MD2蛋白与1号肽链的结合能为-6.5kcal/mol，与2号肽链的结合能为-6.0kcal/mol，与3号肽链的结合能为-9.7kcal/mol，与4号肽链的结合能为-10.0kcal/mol，与5号肽链的结合能为-11.7kcal/mol，与6号肽链的结合能为-12.2kcal/mol。

细胞实验

重复(1)中的细胞实验，得出结果为LLLLS抑制NO产生效果最好，产生4.61±0.22μM照比LPS组产生5.96±0.89μM，有效减少了22.65％；TNF-α抑制实验中ILILLTILEF效果最好从1999.88±143.45pg/mL减少到1558.68±48.96pg/mL。

综上，低聚火腿抗炎肽主要通过氢键与疏水相互作用力与TLR4-MD2受体的结合，这种结合模式可能是脂多糖拮抗作用的原因。因此，本发明中鉴定出的抗炎活性较高的肽，通过阻断LPS与TLR4/MD-2复合物的结合而赋予其抗炎活性。

以上不管是湿实验数据还是计算机验证，都能说明经过本发明制备鉴定筛选出来的肽组分及其肽序都具有很高的抗炎活性。具体作用机制是与引起炎症的LPS拮抗竞争TLR4-MD2结合，抑制炎症反应。

我们的方法比单一色谱分离纯化一次性只能鉴定出两三条抗炎肽，更具高效性，也更节约成本。达到快速和高通量鉴定抗炎肽的目的。

表1

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。