基于VIGS的高效高特异性基因沉默本氏烟草方法

技术领域

本发明涉及一种基于VIGS的高效高特异性基因沉默本氏烟草方法。

背景技术

病毒介导的基因沉默技术由1997年Baulcombe等提出，之后广泛应用于植物基因功能验证，是一种重要的反向遗传学探究基因功能的技术。随着该技术的发展，利用基因重组的烟草脆裂病毒Tobacco rattle virus (TRV) 携带宿主靶标序列通过转入农杆菌侵染植株后，在宿主体内目标基因中会表现出功能丧失或表达量减少的情况，这些被敲低基因表达量的植株表型可以揭示目标基因的功能。通常，病毒载体的构建和对受感染植物症状的监测过程可以在几周内完成，因此VIGS提供了一种简单、快速和高通量的方法来分析目标基因的功能。VIGS作为植物逆转录遗传学的工具，在烟草基因功能分析中得到了广泛的应用。

VIGS技术与超表达、基因编辑、转基因相比不需要经过繁杂的组织培养、突变体筛选等动辄一年的实验操作，具有表型鉴定快，成本低廉等优势。缺点也较为明显，具有时效性，对于多年生木本植物效果较差；沉默效率受插入片段选择、环境和沉默体系配置影响较大；存在基因“脱靶”效应，特别是对同源性较强的基因家族成员进行功能分析时，易产生“脱靶”。

发明内容

对此，本发明提供了一种基于VIGS的高效高特异性基因沉默本氏烟草方法，用于克服现有技术的缺陷。

本发明的技术方案是这样实现的：一种基于VIGS的高效高特异性基因沉默本氏烟草方法，它是按照以下步骤进行的：

S1、RNA提取与cDNA合成

S2、将目的基因mRNA序列全长提交至SGN VIGS Tool在线网站，n-mer大小选择21，片段长度选择300，数据库选择Nicotiana benthamiana v1.0.1；

S3、提交序列，运行VIGS分析，得到与目标基因同源性较强的基因，并根据软件自动生成的尽可能避免同源区域的序列进行基因沉默最佳区域选择；

S4、根据SGN VIGS Tool生成的最佳基因沉默区域序列设计目的基因的基因沉默特异性引物，依据同源重组引物设计规范，使用CE Desigm V1.04软件根据TRV2载体特异性酶切位点进行具有同源臂的CE II扩增引物设计；以NtABS基因为例：基因CDS全长如下所示：

ATGGGAGGGATACTCAACCGTCGGATTCCGTTCAGAGAGGGTTAGAATTTTCTTTTTGGCACTTTACAAAATGGTAGAGGAAATTGCGGCAAAGGCGGAAACTAAGCAAGGTCGATGTGTCAAAGATCACCTTATTAACTTGTGGATTGATATGTTGAAGTGTATGCTGGTGGAATTGGACCTTTGGAAAATTAAATCAACTACCCCAAGCATAGAGGAGTACTTGTCTGTTGCATGTGTAACTATTGGTGTTCCATGTTTTGTTCTCACATCACTATATCTTCTTGGACCAAAACTGTCCAAGGATGTCATAGAAAGTTCTGAGGTCAGTGCCTTATGCAATTGTACAGCTGCTGTGGCCCGATTGATTAATGATATACACAGTTACAAGAGAGAACAAGCAGAAAGTTCAACAAATATGGTATCAATATTAATAACACAAAGTCAGGGAACTATCTCTGAAGAAGAGGCTATAAGACAGATAAAGGAAATGATGGAAAGTAAGAGAAGAGAGTTGCTAGGGATGGTTCTACAAAATAAAGAAAGCCAATTGCCACAAGTGTGCAAGGATCTTTTTTGGACGACAATCAACGCAGCTTATTCTATACATACACATGGCGATGGGTATCGCTTCCCAGAGGAATTCAAGAACCATATCAACGATGTAATTTACAAACCACTCAATCAATATTCCCCATAA；

S5、在本氏烟草cDNA中添加如下PCR扩增体系进行目的片段的扩增：PCR反应物分别为：2 × Phanta Flash Master Mix：10μL、上游引物（10 μM）：1μL、下游引物（10 μM）：1μL、cDNA：2μL以及ddH

S6、目的基因与线性化载体连接方案使用同源重组一步法克隆试剂盒的快速方案进行，采用此方案的前提是PCR产物和线性化载体酶切产物电泳条带均单一，采用此方案进行连接不需要经过胶回收步骤，可以最大程度的保证浓度，提高连接成功率；具体连接体系为：线性化载体体积3μL，目标片段体积1μL，Exnase II体积2μL，5x CE II Buffer体积4μL，ddH

S7、重组载体依次进行转化大肠杆菌、提取质粒、转化农杆菌等操作；

S8、实施烟草基因沉默高效转化；

S9、持续观察注射TRV2-PDS本氏烟草的新叶是否出现白化现象。出现白化现象，说明烟草PDS基因在本氏烟草体内表达量被成功降低，植物不能正常合成叶绿素，标志着基因沉默体系构建成功；

S10、一旦TRV2-PDS烟草出现白化现象，立即摘取TRV2-目的基因、TRV2-00和未注射农杆菌的烟草新叶进行目的基因的表达量检测，与对照组相比后计算沉默效率；

S11、对于与目的基因同源性较高的基因进行基因表达量，分析沉默目的基因对同源性较高基因的影响；基因沉默效率达到95%以上，与目的基因同源性较高的基因基因表达量未发生显著变化，说明基因沉默NtABS基因对同源性较高基因未产生影响，可以将植株的表型及生理生化变化归因于NtABS基因表达量的变化，排除了其他基因的干扰。

所述的S1中RNA的提取过程为：称取0.1g新鲜或超低温冷冻的本氏烟草幼嫩叶片于含有液氮的研钵中进行快速研磨后放入1.5mL的离心管中；cDNA的合成使用StarScriptⅡFirst-strand cDNASynthesis MixWith gDNA Remover StarScript Ⅱ试剂盒说明进行操作。

所述的S4中最佳目的片段如下所示：

ATGGGAGGGATACTCAACCGTCGGATTCCGTTCAGAGAGGGTTAGAATTTTCTTTTTGGCACTTTACAAAATGGTAGAGGAAATTGCGGCAAAGGCGGAAACTAAGCAAGGTCGATGTGTCAAAGATCACCTTATTAACTTGTGGATTGATATGTTGAAGTGTATGCTGGTGGAATTGGACCTTTGGAAAATTAAATCAACTACCCCAAGCATAGAGGAGTACTTGTCTGTTGCATGTGTAACTATTGGTGTTCCATGTTTTGTTCTCACATCACTATATCTTCTTGGACCAAAACTGTC；

NtABS-F GTGAGTAAGGTTACCGAATTCGAAGAAGAGGCTATAAGACAGATAAAGG；

NtABS-R TGGAGGCCTTCTAGAGAATTCAGAAGTACAATTCGTCCATGCATC；

NtPDS-F GTGAGTAAGGTTACCGAATTCATGCAGAACCTGTTTGGA GAACTA；

NtPDS-R TGGAGGCCTTCTAGAGAATTCGTTAAGTGCCTTTGACATGGCA；

所述的S5中扩增反应程序设置如下：反应温度95℃时反应时间10min；反应温度95℃时反应时间5sec，循环次数35次；反应温度61℃（退火温度）时反应时间15sec，循环次数35次；反应温度72℃时反应时间30sec，循环次数35次；反应温度72℃时反应时间10min，反应温度4℃时反应时间∞；

所述的S8中烟草基因沉默高效转化的具体步骤如下：

（1）配100mL 固态LB培养基，在100mL培养基中加入100μL卡那、100μL利福平，倒平板之后把TRV1、TRV2-PDS、TRV2-目的基因、TRV2-00吸2-10μL划线培养，之后放于28℃培养12-14小时；

（2）配100 mL液体LB培养基，加入100μL卡那、100μL利福平，倒入灭菌后的5mL离心管2mL培养基，把单菌落挑取出来，吹打至离心管中，每个平板挑4-6个；配置好离心管以后置于28℃ 200r/min摇床上12小时，置于4℃冰箱；

（3）配置250mL液体LB培养基，加入250μL卡雫、250μL利福平，将灭菌后的50mL锥形瓶加入18mL培养基，将摇好的菌液置于锥形瓶中；配置好以后置于28℃ 200r/min摇床上12小时，置于4℃冰箱；

（4）配置A培养基

A培养基配方：250mL AB盐配方：氯化铵（NH

475mL IM配方：MES：4.88g，葡萄糖：2.5g，磷酸二氢钠（NaH

（5）配置好的A培养基加入500μL卡雫、500μL利福平和500μL 乙酰丁香酮，在50mL离心管中加入10mL混合好的A培养基，配置好的锥形瓶中的菌液用移液枪吸出10mL加入离心管；28℃ 200r/min摇床上24小时；

（6）配置B培养基

B培养基配方：MES：1.066g，葡萄糖：2.5g，磷酸二氢钠（NaH

（7）配置好的B培养基加入乙酰丁香酮（0.0196g 乙酰丁香酮加入到500 μLDMSO）；将摇好的A混合菌液在3000g，4℃离心10min，收集菌体；将10mL混合B培养基倒入离心管中，吹打菌体至没有大面积沉淀；重复上次离心操作；离心完成后，将7.5mL的B培养基加入到离心管中，最后将TRV1与TRV2-PDS、TRV2-基因、TRV2-00混合，置于室温保存；

（8）给预备接种的烟草苗浇水，叶面喷水；

（9）将配置好的菌液打入幼苗的叶片背部，打完之后喷水，置于22摄氏度黑暗条件下1天，之后16小时光照，8小时黑暗处理。

本发明具有如下的积极效果：本发明针对VIGS在本氏烟草上应用所产生的不利因素，本发明通过优化基因沉默体系配置使沉默效率达到95%以上；针对‘脱靶’效应，使用SGNVIGS Tool在线软件对插入序列片段进行最优化选择，降低基因沉默‘脱靶’效率。提高基因沉默效率可以提高基因沉默体系的稳定性，主要体现在试验方面，例如较低的基因沉默效率可能导致大量假阳性植株的产生，为后续检测目的基因沉默效果增加工作量，浪费人力和物力。提高基因沉默效率并不能为育种带来直接影响，但在试验阶段，可以更快更高效的探索基因功能。

附图说明

图1为本发明本氏烟草的新叶是否出现白化现象的对比图。

具体实施方式

如图1所示，A和C采用本氏PDS处理，B采用本质烟TRV2-00处理。

在具体操作按照以下步骤进行的：

S1、RNA提取与cDNA合成

RNA的提取过程为：称取0.1g新鲜或超低温冷冻的本氏烟草幼嫩叶片于含有液氮的研钵中进行快速研磨后放入1.5mL的离心管中；cDNA的合成使用StarScript ⅡFirst-strand cDNASynthesis MixWith gDNA Remover StarScript Ⅱ试剂盒说明进行操作。

S2、将目的基因mRNA序列全长提交至SGN VIGS Tool在线网站，n-mer大小选择21，片段长度选择300，数据库选择Nicotiana benthamiana v1.0.1。

S3、提交序列，运行VIGS分析，得到与目标基因同源性较强的基因，并根据软件自动生成的尽可能避免同源区域的序列进行基因沉默最佳区域选择。

S4、根据SGN VIGS Tool生成的最佳基因沉默区域序列设计目的基因的基因沉默特异性引物，依据同源重组引物设计规范，使用CE Desigm V1.04软件根据TRV2载体特异性酶切位点进行具有同源臂的CE II扩增引物设计；以NtABS基因为例：基因CDS全长如下所示：

ATGGGAGGGATACTCAACCGTCGGATTCCGTTCAGAGAGGGTTAGAATTTTCTTTTTGGCACTTTACAAAATGGTAGAGGAAATTGCGGCAAAGGCGGAAACTAAGCAAGGTCGATGTGTCAAAGATCACCTTATTAACTTGTGGATTGATATGTTGAAGTGTATGCTGGTGGAATTGGACCTTTGGAAAATTAAATCAACTACCCCAAGCATAGAGGAGTACTTGTCTGTTGCATGTGTAACTATTGGTGTTCCATGTTTTGTTCTCACATCACTATATCTTCTTGGACCAAAACTGTCCAAGGATGTCATAGAAAGTTCTGAGGTCAGTGCCTTATGCAATTGTACAGCTGCTGTGGCCCGATTGATTAATGATATACACAGTTACAAGAGAGAACAAGCAGAAAGTTCAACAAATATGGTATCAATATTAATAACACAAAGTCAGGGAACTATCTCTGAAGAAGAGGCTATAAGACAGATAAAGGAAATGATGGAAAGTAAGAGAAGAGAGTTGCTAGGGATGGTTCTACAAAATAAAGAAAGCCAATTGCCACAAGTGTGCAAGGATCTTTTTTGGACGACAATCAACGCAGCTTATTCTATACATACACATGGCGATGGGTATCGCTTCCCAGAGGAATTCAAGAACCATATCAACGATGTAATTTACAAACCACTCAATCAATATTCCCCATAA；

最佳目的片段如下所示：

ATGGGAGGGATACTCAACCGTCGGATTCCGTTCAGAGAGGGTTAGAATTTTCTTTTTGGCACTTTACAAAATGGTAGAGGAAATTGCGGCAAAGGCGGAAACTAAGCAAGGTCGATGTGTCAAAGATCACCTTATTAACTTGTGGATTGATATGTTGAAGTGTATGCTGGTGGAATTGGACCTTTGGAAAATTAAATCAACTACCCCAAGCATAGAGGAGTACTTGTCTGTTGCATGTGTAACTATTGGTGTTCCATGTTTTGTTCTCACATCACTATATCTTCTTGGACCAAAACTGTC；

NtABS-F GTGAGTAAGGTTACCGAATTCGAAGAAGAGGCTATAAGACAGATAAAGG；

NtABS-R TGGAGGCCTTCTAGAGAATTCAGAAGTACAATTCGTCCATGCATC；

NtPDS-F GTGAGTAAGGTTACCGAATTCATGCAGAACCTGTTTGGA GAACTA；

NtPDS-R TGGAGGCCTTCTAGAGAATTCGTTAAGTGCCTTTGACATGGCA。

S5、在本氏烟草cDNA中添加如下PCR扩增体系进行目的片段的扩增，具体PCR扩增反应体系见表1，具体PCR扩增反应程序见表2。

表1 PCR扩增反应体系

表2 PCR扩增反应程序

S6、目的基因与线性化载体连接方案使用同源重组一步法克隆试剂盒的快速方案进行，采用此方案的前提是PCR产物和线性化载体酶切产物电泳条带均单一，采用此方案进行连接不需要经过胶回收步骤，可以最大程度的保证浓度，提高连接成功率，37℃孵育30分钟。具体目的基因与线性化载体连接体系见表3。

表3 目的基因与线性化载体连接体系

S7、重组载体依次进行转化大肠杆菌、提取质粒、转化农杆菌等操作。

S8、烟草基因沉默高效转化的具体步骤如下：

（1）配100mL 固态LB培养基，在100mL培养基中加入100μL卡那、100μL利福平，倒平板之后把TRV1、TRV2-PDS、TRV2-目的基因、TRV2-00吸2-10μL划线培养，之后放于28℃培养12-14小时；

（2）配100 mL液体LB培养基，加入100μL卡那、100μL利福平，倒入灭菌后的5mL离心管2mL培养基，把单菌落挑取出来，吹打至离心管中，每个平板挑4-6个；配置好离心管以后置于28℃ 200r/min摇床上12小时，置于4℃冰箱；

（3）配置250mL液体LB培养基，加入250μL卡雫、250μL利福平，将灭菌后的50mL锥形瓶加入18mL培养基，将摇好的菌液置于锥形瓶中；配置好以后置于28℃ 200r/min摇床上12小时，置于4℃冰箱；

（4）配置A培养基

A培养基配方：250mL AB盐配方：氯化铵（NH

475mL IM配方：MES：4.88g，葡萄糖：2.5g，磷酸二氢钠（NaH

（5）配置好的A培养基加入500μL卡雫、500μL利福平和500μL 乙酰丁香酮，在50mL离心管中加入10mL混合好的A培养基，配置好的锥形瓶中的菌液用移液枪吸出10mL加入离心管；28℃ 200r/min摇床上24小时；

（6）配置B培养基

B培养基配方：MES：1.066g，葡萄糖：2.5g，磷酸二氢钠（NaH

（7）配置好的B培养基加入乙酰丁香酮（0.0196g 乙酰丁香酮加入到500 μLDMSO）；将摇好的A混合菌液在3000g，4℃离心10min，收集菌体；将10mL混合B培养基倒入离心管中，吹打菌体至没有大面积沉淀；重复上次离心操作；离心完成后，将7.5mL的B培养基加入到离心管中，最后将TRV1与TRV2-PDS、TRV2-基因、TRV2-00混合，置于室温保存；

（8）给预备接种的烟草苗浇水，叶面喷水。

（9）将配置好的菌液打入幼苗的叶片背部，打完之后喷水，置于22摄氏度黑暗条件下1天，之后16小时光照，8小时黑暗处理。

S9、持续观察注射TRV2-PDS本氏烟草的新叶是否出现白化现象。出现白化现象，说明烟草PDS基因在本氏烟草体内表达量被成功降低，植物不能正常合成叶绿素，标志着基因沉默体系构建成功。

S10、一旦TRV2-PDS烟草出现白化现象，立即摘取TRV2-目的基因、TRV2-00和未注射农杆菌的烟草新叶进行目的基因的表达量检测，与对照组相比后计算沉默效率。

S11、对于与目的基因同源性较高的基因进行基因表达量，分析沉默目的基因对同源性较高基因的影响；基因沉默效率达到95%以上，与目的基因同源性较高的基因基因表达量未发生显著变化，说明基因沉默NtABS基因对同源性较高基因未产生影响，可以将植株的表型及生理生化变化归因于NtABS基因表达量的变化，排除了其他基因的干扰。