一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒的β属。新型冠状病毒是一种包膜的正链RNA病毒，基因组大小29903nt，主要有表面蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)四种结构蛋白。其中，表面蛋白(S)主要功能以及研究意义如下：1)承担病毒与宿主细胞膜受体(ACE-2)结合及膜融合功能；2)决定病毒的宿主范围和特异性；3)通过受体结合区(RBD)的基因重组或突变可以实现不同宿主间传播，并导致较高致死率；4)宿主中和抗体的重要作用位点；5)疫苗设计的关键靶点。目前，表面蛋白(S)的受体结合区(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域，能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。

SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区作为关键免疫原，采用真核细胞分泌表达具有显著优势：1)分泌表达上清蛋白背景低，纯化工艺简单；2)可溶性表达，避免形成包涵体；3)信号肽酶精准切割，N端无冗余Met残基，产生符合预期的蛋白序列。分泌表达通常需要在目标蛋白N端融合信号肽序列，引导外源蛋白定位分泌到特定膜系统。信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由15-30个氨基酸组成，包括三个区：1)带正电的N末端，称为碱性氨基末端；2)中间疏水序列，以中性氨基酸为主，能够形成α螺旋结构，也是信号肽的主要功能区；3)带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法。

本发明发现一种人工合成信号肽(信号肽H，SEQ ID No.1)，引导SARS-CoV-2的S表面蛋白受体结合区(RBD)分泌至培养上清，经过镍柱纯化即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于S蛋白天然信号肽(信号肽S)。

第一方面，本发明要求保护SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用。

SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：

P1、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达产量；

P2、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达效率；

P3、制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白制品。

所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。

进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。

在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。

其中，所述编码基因可为如下任一：

(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.5所示DNA片段(SEQID No.5的第1-57位为信号肽H的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如Hind III和Pac I)后得到的重组质粒。

第二方面，本发明要求保护一种融合蛋白。

本发明所要求保护的融合蛋白，为将SEQ ID No.1所示多肽融合于SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的N端后所得。

进一步地，所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第20-242位所示。

更进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-242位或第1-247位所示或如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.4的第1-19位为信号肽H(即SEQ ID No.1)，第20-242位为所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区，第243-247位为Linker接头，第248-253位为组氨酸标签。

第三方面，本发明要求保护编码第二方面中所述融合蛋白的核酸分子。

进一步地，所述核酸分子自5’端到3’端依次包括SEQ ID No.1所示多肽的编码基因和SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因。

更进一步地，所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因可为如下任一：

(a1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示多肽的DNA分子。

更进一步地，所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因可为如下任一：

(b1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b 1)限定的DNA分子杂交且相同蛋白质的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。

更加具体地，所述核酸分子为SEQ ID No.5的第1-726位或第1-741位所示DNA分子或SEQ ID No.5所示DNA分子。SEQ ID No.5的第1-57位为所述SEQ ID No.1所示多肽的编码基因(即SEQ ID No.2)，第58-726位为所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因(即SEQ ID No.3)，第727-741位为Linker接头的编码基因，第742-759位为组氨酸标签的编码基因。

上述核酸分子或编码基因中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子或编码基因中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述核酸分子或编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na

第四方面，本发明要求保护含有第三方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第二方面中所述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.5所示DNA片段(SEQID No.5的第1-57位为信号肽H的编码基因，即SEQ ID No.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如Hind III和Pac I)后得到的重组质粒。相应地，所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到Expi293F细胞后所得。

第五方面，本发明要求保护前文第二方面中所述融合蛋白或前文第三方面中所述的核酸分子或前文第四方面中所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：

P1、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达产量；

P2、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达效率；

P3、制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白制品。

其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。

进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。

在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。

第六方面，本发明要求保护一种制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白的方法。

本发明要求保护的制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白的方法，可包括如下步骤：

(A1)将前文第三方面中所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；

(A2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白。

其中，所述核酸分子可通过前文所述重组载体导入所述宿主细胞。

步骤(A1)中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。

进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。

在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。

步骤(A2)中，所述培养为培养至细胞活率降至65％～75％时终止培养。

步骤(A2)中，是按照包括如下步骤的方法从所述培养上清中获得SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白的：收集培养物于3500g离心30min，收集上清进行超滤浓缩和镍柱纯化。

第七方面，本发明要求保护SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：

Q1、提高目的蛋白在宿主细胞中的分泌表达产量；

Q2、提高目的蛋白在宿主细胞中的分泌表达效率；

Q3、制备分泌表达的目的蛋白。

所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

所述目的蛋白为冠状病毒结构蛋白。

进一步地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

更进一步地，所述冠状病毒结构蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白全长、S1蛋白、S2蛋白、N蛋白，M蛋白，E蛋白或者上述各蛋白中的任意两者或两者以上融合而成的融合蛋白。

本发明采用S蛋白天然信号肽S(理论保证受体结合区信号肽酶酶切位点正确，维持天然空间构象)和家鼠抗体κ链信号肽改造的人工设计信号肽H(SEQ ID No.1)，用于引导新冠病毒表面蛋白受体结合区(RBD)真核细胞分泌表达。实验证明：人工合成信号肽H分泌表达水平显著优于天然信号肽S，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

附图说明

图1为天然信号肽S和人工合成信号肽H表达质粒构建酶切鉴定图。其中，1-3为天然信号肽S，4-6为人工设计信号肽H。

图2为新冠病毒表面蛋白受体结合区(RBD)细胞分泌上清SDS-PAGE鉴定图。其中，1为天然信号肽S，2为人工设计信号肽H，3为无转染表达质粒的阴性组。

图3为新冠病毒表面蛋白受体结合区(RBD)细胞分泌上清灰度分析图。其中，S为天然信号肽S分泌上清，H为人工设计信号肽H分泌上清。

图4为新冠病毒表面蛋白受体结合区(RBD)蛋白纯化SDS-PAGE纯化鉴定。其中，1为S信号肽表达分泌上清，2为S信号肽分泌表达纯化样品；3为H信号肽表达分泌上清，4为H信号肽分泌表达纯化样品。

图5为新冠病毒表面蛋白受体结合区(RBD)纯化样品灰度分析图。其中，S为天然信号肽S纯化样品，H为人工设计信号肽H纯化样品。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：

SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD Gene：北京义翘神州科技股份有限公司；

Expi293F

pCGS3表达载体：Merck公司；

Expi293TMExpression Medium：Thermo公司；

ExpiFectamineTM293Transfection Kit：Thermo公司；

Opti-MEMTMI Reduced Serum Medium：Thermo公司；

蛋白marker：金斯瑞；

即用型无缝克隆试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Ni-NTA蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Centrifugal Filters Ultracel-10K：Millipore公司；

Centrifugal Filters 0.5ml 10K Ultracel：Millipore公司；

PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；

凝胶成像系统：ProteinSimple公司

细胞计数仪：Roche公司；

超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；

电热恒温水浴锅：Fisher Scientific公司；

CO

HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；

DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；

DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；

微量移液器：Eppendorf公司。

实施例1、表达质粒构建

本实施例采用SARS-CoV-2(2019-nCoV)S蛋白的天然信号肽S和家鼠抗体κ链信号肽改造的人工合成信号肽H(SEQ ID No.1)的编码基因分别融合到SARS-CoV-2S蛋白RBD蛋白的编码基因5’端，构建真核重组表达载体。

使用SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD Gene(SEQ ID No.5的第58-726位，SEQID No.6的第46-714位)为首轮模板扩增目的片段。

引物1和引物5第一轮扩增；扩增片段作为第二轮模板，使用引物2和引物5进行第二轮扩增获得H-RBD目标片段。

引物3和引物5第一轮扩增；扩增片段作为第二轮模板，使用引物4和引物5进行第二轮扩增获得S-RBD目标片段。

采用即用型无缝克隆试剂盒重组连接：pCGS3经HindIII和PacI双酶切线性化，扩增目标片段S-RBD和H-RBD经重组克隆至pCGS3表达载体。

引物1：5’-TGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTGCTAGATCTAGGGTCCAACCAACAGAGAG-3’；

引物2：5’-CACCGTCCTTGACACG

引物3：5’-TGCTGCTGCCCCTGGTGAGCAGCCAGTGCAGGGTCCAACCAACAGAGAG-3’；

引物4：5’-CACCGTCCTTGACACG

引物5：5’-CAGTTAGCCTCCCCC

所得两种重组表达载体的酶切鉴定结果如图1所示。由图可见，第1-3泳道为pCGS3-S-RBD表达质粒，酶切后载体7120bp，目标基因759bp；第4-6泳道为pCGS3-H-RBD载体为7120bp，目标基因为771bp，酶切条带大小符合预期。

重组表达载体pCGS3-S-RBD的结构描述：在pCGS3载体的酶切位点HindIII和PacI之间插入SEQ ID No.6所示DNA片段后得到的重组载体(SEQ ID No.6的5’增加Kozak序列优化表达，3’端增加终止密码)。SEQ ID No.6的第1-45位为天然S信号肽的编码基因，第46-714位为RBD编码基因，715-729为Linker接头，730-747为组氨酸标签。

重组表达载体pCGS3-H-RBD的结构描述：在pCGS3载体的酶切位点HindIII和PacI之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组载体(SEQ ID No.5的5’增加Kozak序列优化表达，3’端增加终止密码)。SEQ ID No.5的第1-57位为人工信号肽H的编码基因，第58-726位为RBD编码基因，727-741为Linker接头，742-759为组氨酸标签。

SEQ ID No.5编码SEQ ID No.4所示蛋白质。SEQ ID No.4的第1-19位为人工信号肽H，第20-242位为RBD，第243-247位为Linker接头，第248-253位为组氨酸标签。

实施例2、SDS蛋白电泳图灰度分析

SDS蛋白电泳图灰度分析采用Image J软件。操作步骤为Image→Type→32-Bit转化为灰度图；Process→Subtract Background→OK去除背景色；矩形工具选择泳道→Analyze→Gel→Select First Lane确定分析泳道，重复选择多条泳道同时分析；Analyze→Gel→Plot Lane生成峰面积；线性工具选择目标条带对应峰图，Wand工具计算对应峰图面积，即可求得表达量占总蛋白百分比。

实施例3、RBD蛋白瞬转表达

一、宿主细胞

从液氮罐中取宿主细胞Expi293F的种子库细胞，于37℃水浴迅速解冻，将解冻后的细胞悬液无菌转移至装有30ml预热的完全生长培养基的125ml药瓶中，摇床培养条件：37℃，8％CO

待细胞活率恢复90％以上，细胞密度达3～5×10

二、细胞转染

将实施例1构建的pCGS3-S-RBD和pCGS3-H-RBD分别转染宿主细胞。

1、转染前一天

转染前24h将细胞以2.5～3×10

2、转染当天

(1)细胞密度应达到4.5～5.5×10

(2)准备转染试剂和DNA复合物

1)DNA稀释

用无菌水将质粒(实施例1构建的pCGS3-S-RBD和pCGS3-H-RBD)稀释至1μg/μl，按照1ml细胞转染1μg质粒的量，取转染50ml细胞所需质粒的量，即50μl质粒加入3ml Opti-MEM

2)转染试剂稀释

使用前将转染试剂ExpiFectamine293

3)将稀释好的转染试剂加入质粒中轻轻上下颠倒混匀，室温反应10～20min。将混合好的转染试剂和DNA复合物缓慢加入细胞培养物中。37℃，8％CO

3、转染后第一天

在转染后18～22h，按照转染50ml细胞的量添加增强剂。即，取300μlExpiFectamine

4、培养上清收集

转染后每天监测细胞活率，当活率降至65％～75％时终止培养4天。收集培养物于3500g离心30min，收集上清并用0.22μm滤膜过滤，SDS-PAGE鉴定及灰度分析证明信号肽H组RBD蛋白的表达量比信号肽S组增加24.99％(图2和图3)。可见与天然信号肽相比，本发明的人工信号肽H具有更高的新冠病毒RBD蛋白的分泌表达量产量。

实施例4、RBD蛋白纯化

一、超滤浓缩

收样上清(即实施例3步骤4中“收集培养物于3500g离心30min”后所得上清)进行4℃，10KD超滤膜6000g离心20min超滤浓缩，最终细胞上清浓缩至20-30ml，留样10μl用于SDS-PAGE蛋白电泳检测。

二、镍柱纯化

(1)超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育，待上柱纯化；

(2)用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱；

(3)将超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱。如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中，留样10μl用于SDS-PAGE蛋白电泳检测；

(4)用两倍柱体积的Binding/wash buffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；

(5)用两倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白。重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线，收集洗脱液待纯化，留样10μl用于蛋白浓度测定和SDS-PAGE蛋白电泳检测；

(6)采用A280(nm)紫外光吸收法，确定洗脱液中蛋白浓度。

三、超滤置换

(1)镍柱纯化后的蛋白溶液加入Millipore(UFC5010BK，0.5ml，10K)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μl。

(2)轻轻加入300μl PBS(pH7.4)，10000g离心至剩余150μl，重复三次。

(3)PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约1-2ml，留样5μl用于蛋白浓度测定和SDS-PAGE蛋白电泳检测。

(4)A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度，SDS-PAGE检测纯化样品纯度均大于95％(图4和图5)，采用铝盐；或CpG：或脂质体；或油性佐剂即可产生新型冠状病毒免疫组合物，用于预防新型肺炎。

综合以上各实施例的结果，可见，本发明采用S蛋白天然信号肽S和人工设计信号肽H(SEQ ID No.1)，用于引导新冠病毒表面蛋白受体结合区(RBD)真核细胞分泌表达。本发明人工合成信号肽H分泌表达水平显著由于天然信号肽S，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 华兰基因工程有限公司

<120> 一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法

<130> GNCLN202119

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Trp Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ala Arg Ser

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggccttgc ctgtttggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctgc tagatct 57

<210> 3

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

agggtccaac caacagagag cattgtgagg tttccaaaca tcaccaacct gtgtccattt 60

ggagaggtgt tcaatgccac caggtttgcc tctgtctatg cctggaacag gaagaggatt 120

agcaactgtg tggctgacta ctctgtgctc tacaactctg cctccttcag caccttcaag 180

tgttatggag tgagcccaac caaactgaat gacctgtgtt tcaccaatgt ctatgctgac 240

tcctttgtga ttaggggaga tgaggtgaga cagattgccc ctggacaaac aggcaagatt 300

gctgactaca actacaaact gcctgatgac ttcacaggct gtgtgattgc ctggaacagc 360

aacaacctgg acagcaaggt gggaggcaac tacaactacc tctacagact gttcaggaag 420

agcaacctga aaccatttga gagggacatc agcacagaga tttaccaggc tggcagcaca 480

ccatgtaatg gagtggaggg cttcaactgt tactttccac tccaatccta tggcttccaa 540

ccaaccaatg gagtgggcta ccaaccatac agggtggtgg tgctgtcctt tgaactgctc 600

catgcccctg ccacagtgtg tggaccaaag aagagcacca acctggtgaa gaacaagtgt 660

gtgaacttc 669

<210> 4

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Trp Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ala Arg Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn

20 25 30

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

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Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

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Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

65 70 75 80

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

85 90 95

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

100 105 110

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

115 120 125

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

130 135 140

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

145 150 155 160

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

165 170 175

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

180 185 190

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

210 215 220

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val

225 230 235 240

Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

245 250

<210> 5

<211> 759

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atggccttgc ctgtttggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctgc tagatctagg 60

gtccaaccaa cagagagcat tgtgaggttt ccaaacatca ccaacctgtg tccatttgga 120

gaggtgttca atgccaccag gtttgcctct gtctatgcct ggaacaggaa gaggattagc 180

aactgtgtgg ctgactactc tgtgctctac aactctgcct ccttcagcac cttcaagtgt 240

tatggagtga gcccaaccaa actgaatgac ctgtgtttca ccaatgtcta tgctgactcc 300

tttgtgatta ggggagatga ggtgagacag attgcccctg gacaaacagg caagattgct 360

gactacaact acaaactgcc tgatgacttc acaggctgtg tgattgcctg gaacagcaac 420

aacctggaca gcaaggtggg aggcaactac aactacctct acagactgtt caggaagagc 480

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tgtaatggag tggagggctt caactgttac tttccactcc aatcctatgg cttccaacca 600

accaatggag tgggctacca accatacagg gtggtggtgc tgtcctttga actgctccat 660

gcccctgcca cagtgtgtgg accaaagaag agcaccaacc tggtgaagaa caagtgtgtg 720

aacttcgggg gtggaggctc tcaccatcac caccatcat 759

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc agtgcagggt ccaaccaaca 60

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