光可断裂的荧光标记化合物及用途

技术领域

本发明涉及化合物领域，具体地，涉及光可断裂的荧光标记化合物及用途，更具体地，涉及一种光可断裂的荧光标记化合物以及该化合物在DNA或RNA测序中的用途。

背景技术

为满足第三代测序的技术的需求，需采用循环可逆终结(cyclic reversibletermination,CRT)的办法来实现单个碱基的延伸以提高测序速度。即当某一个带有抑制基团的核苷酸/碱基加到DNA链上之后，可以阻止下一个核苷酸/碱基继续连接到该DNA链上。在温和条件下该抑制基团可以被除去从而使该DNA链得以继续延伸。每增加一个碱基，可以通过对其所带荧光的检测实现对该DNA链的序列测定。这样一个带抑制基团的核苷酸/碱基也被称作终止子(terminator)。

目前可逆的终止子大体有两种结构：一是3’-OH基团被其他基团取代，从而使3’-OH丧失进攻磷酸基团的能力而阻止下一个核苷酸/碱基的结合；第二种结构虽然没有取代3’-OH，但是在核苷位置增加了一个抑制分子/基团，由于空间位阻等作用使得3’-OH无法进攻磷酸基团。

因此，适用于边合成边测序或者边连接边测序的二代测序、单分子测序平台的测序试剂的开发仍有很大的改进空间。

发明内容

本发明的目的在于至少提供一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物及其在DNA或RNA测序中的用途。

需要说明的，下述中的“光可断裂的荧光标记化合物”、“光可断裂的荧光标记可逆终端化合物”和“光可断裂的荧光标记核苷酸”等同、可互换。

第一方面，本发明提供了一种光可断裂的荧光标记化合物，其结构式如式(I)所示：

根据本发明的实施例，上述本发明第一方面的光可断裂的荧光标记化合物还可以具有以下附加技术特征中的至少一种：

根据本发明的实施例，式(I)中的光可断裂基团选自2-硝基甲苯基、苄氧羰基、硝基苯基、苯甲酰甲酯基酯、苄胺、苄醚、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯和碳酸2-(邻硝基苯基)乙酯中的至少一种。

根据本发明的实施例，式(I)中的荧光基团选自氟硼荧染料、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、alexa系列染料、squarene染料及其衍生物中的一种或多种。

根据本发明的实施例，所述化合物为结构式如式(1)～(10)所示的化合物中的至少一种：

上述本发明第一方面任一实施例选择光可断裂基团作为抑制基团，在一定波长的照射下，抑制基团与碱基断开；该离去过程不需要特殊的催化剂或还原剂等的辅助，不会存在辅助试剂与DNA聚合酶、碱基的副反应，从而在温和的条件下实现可逆终止；该离去过程对测序过程本身没有任何干扰，有利于长片段单分子测序。上述本发明任一实施例提供的光可断裂的荧光标记核苷酸，在单个荧光分子超灵敏光学检测技术和三代测序平台具有重要应用价值。

第二方面，本发明提供了一种制备光可断裂的荧光标记化合物的方法，该方法能够用以制备上述本发明一方面或者任一实施例中的光可断裂的荧光标记化合物，该方法包括以下A和/或B步骤：

步骤A：

将化合物(a)和

步骤B：

将化合物(b)和

上述方法采用马来亚酰胺与巯基的特异性反应对核苷酸进行荧光标记。该反应条件温和、反应效率高，降低了实验难度，提高了整个反应的产率。此外，市场上已有销售数种与荧光分子相连接的马来亚酰胺，价格低廉，节约成本。

根据本发明的实施例，方法包括步骤A，步骤A中，化合物(a)与

根据本发明的实施例，方法包括步骤B，步骤B，化合物(b)与

根据本发明的实施例，当合成方法采用包括步骤A的合成方法时，连接单元包含

根据本发明的实施例，当合成方法采用包括步骤B的合成方法时，连接单元包含

根据本发明的实施例，步骤A中，所述化合物a选自下述化合物(11)-(15)中的至少一种：

根据本发明的实施例，化合物(11)-(15)中的任一种由相应的核苷酸

根据本发明的实施例，步骤B中，所述化合物(b)选自下述化合物(16)-(20)中的至少一种：

根据本发明的实施例，上述化合物(16)-(20)中的任一种通过如下步骤制备：1)核苷酸

第三方面，本发明提供了一种对核酸的测序方法，包括如下步骤：(i)利用芯片对第一核酸进行捕获，所述芯片为表面带有第二核酸的固体基底，以获得第一核酸-第二核酸复合物；(ii)混合所述第一核酸-第二核酸复合物、聚合酶以及一种或多种类型的标记的底物，以获得核酸聚合产物，所述标记的底物为上述任一实施例中的光可断裂的荧光标记化合物，不同类型的标记的底物带有不同的碱基；(iii)对所述核酸聚合产物进行成像，以确定所述核酸聚合产物中引入的标记的底物的类型；(iv)使所述核酸聚合物暴露于光源下，以使所述核酸聚合物中的引入的标记的底物中的下式部分发生断裂：

上述本发明的任一实施例中的测序方法，依据对芯片上的核苷酸序列(第二核酸，也称为探针)的设计，能够对目标区域进行测序，或者对基因组随机区域进行测序。

根据本发明的实施例，所述的聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶和DNA聚合中的至少一种。

根据本发明的实施例，在步骤ii后，清洗所述核酸聚合产物。由此，能够提高反应效率。

根据本发明的实施例，在步骤iv后，清洗所述延伸产物。由此，能够消除部分成像干扰。

根据本发明的实施例，在步骤iii前，对所述第一核酸-第二核酸加帽。由此，利于聚合反应的进行。

如本发明所述的，“第一核酸”、“第二核酸”中，“第一”和“第二”并不特指顺序或具体的核苷酸链；在本发明的实施例中，“第一核酸”和“第二核酸”能够完全或者部分互补。

在本发明一实施方式中，“第一核酸”和“第二核酸”完全互补。

在本发明另一实施方式中，“第一核酸”和/或“第二核酸”带有生物素、链霉素。

在本发明另一实施方式中，“第一核酸”和/或“第二核酸”分别为引物和待测靶核酸。

如本发明所述的，对所述第一核酸-第二核酸加帽为常规加帽修饰，比如，RNA“5’端修饰的m7G-PPNmN结构。

在基因测序领域来说，实现对于单个活体细胞的实时测序也是上述技术方案希望解决的技术问题之一；本发明第四方面采用生物正交反应(bioorthogonal chemistry)将荧光分子加到光可断裂的可逆终端化合物上；该过程对细胞基本没有危害，也不会带入对细胞有害的物质或副反应产物；同时，本发明所采用的办法避免了使用对细胞有害的金属催化剂或其他有害化合物，对细胞内的生化过程没有影响，且反应十分高效，有利于更简单、更高效率地实现单个活体细胞的实时测序。此外，市面存在有多种环辛炔标记的荧光分子，价格低廉，能够大大节约成本。

如本发明所述的，“生物正交化学反应”指可发生在活体内，对活体本身生物化学过程没有任何干扰的化学反应。生物正交反应正日益成为在活体内对生物大分子以及活性小分子进行特异标记的一种有效方法；对细胞内的生物分子实时可视化的标记方法对于理解生命的分子基础有着重要的意义。

第四方面，本发明提供了一种测序试剂盒，包括一种或多种上述本发明一方面或者任一实施例中的光可断裂的荧光标记化合物。

第五方面，本发明提供一种上述本发明一方面或者任一实施例中的光可断裂的荧光标记可逆终端化合物在作为终止核苷酸类似物中的用途。

第六方面，提供上述任一实施例中的光可断裂的荧光标记可逆终端化合物在DNA或RNA测序中的用途。

上述本发明任一实施例选择光可断裂基团作为抑制基团，在一定波长的照射下，抑制基团与碱基断开；该离去过程不需要特殊的催化剂或还原剂等的辅助，不会存在辅助试剂与DNA聚合酶、碱基的副反应，从而在温和的条件下实现可逆终止；该离去过程对测序过程本身没有任何干扰。特别地，上述本发明任一实施例提供的光可断裂的荧光标记可逆终端可高效率的服务于第三代基因测序技术。

附图说明

图1是本发明实施例中的光可断裂的荧光标记化合物的化学结构示意图；

图2是本发明实施例中的光可断裂的荧光标记化合物A.8的核磁共振H谱及C谱模拟示意图；

图3是本发明实施例中的光可断裂的荧光标记化合物A.14的核磁共振H谱及C谱模拟示意图；

图4是本发明实施例中的光可断裂的荧光标记化合物应用于测序的测序效率验证结果示意图。

具体实施方式

现通过以下实施例来进一步描述本发明，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围。

图1是实施例中的光可断裂的荧光标记化合物的化学结构示意图；结合图1，本发明实施例提供了一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成方法。

实施例1

一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成方法，包括如下路线1-5的任一种：

合成路线1：

其中，步骤(i)的反应条件为：化合物10mmol2.5gA.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g32mmol、咪唑(imidazole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的条件下，室温，过夜，然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)

上述合成步骤(i)中，加入的TBSCl可以为30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物A.2在Mg(ClO

上述合成步骤(ii)中，加入的Mg(ClO

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物A.3在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巯基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzylbromide)10mmol2.16g存在的条件下反应4h，在真空环境中除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用饱和的氯化铵溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水层，再用硫酸钠干燥合并的有机层，真空浓缩后，通过硅胶柱色谱纯化得化合物A.43.26g(90％)；

上述合成步骤(iii)中，加入的4-巯基-2-硝基苯甲溴可以为7.5～15mmol中的任意值；

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物A.4在SiO

上述合成步骤(iv)中，加入的SiO

步骤(v)的反应条件为：步骤(iv)所得的化合物A.5在n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(v)中，加入的n-氟化四丁铵可以为5～15mmol中的任意值；

步骤(vi)的反应条件为：将步骤(v)所得的化合物A.6在三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(vi)中，加入的三氯氧磷可以为15～25mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(vii)的反应条件为：将步骤(vi)所得的化合物A.7和6.5g 10mmol

上述合成步骤(vii)中，加入的

为进一步说明该化合物的特征，对产物A.8进行了核磁共振模拟分析，

式(A)、式(B)分别对应的

经核磁共振检测，所得化合物A.8的结构式与核磁共振模拟结果一致，步骤(vii)所得的化合物A.8的结构式为dATP-Cy5，结构如下：

合成路线2：

其中，步骤(i)的反应条件为：化合物10mmol 2.7g G.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g 32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的条件下，室温，过夜，然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)

上述合成步骤(i)中，加入的TBSCl可以为30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物G.2在Mg(ClO

上述合成步骤(ii)中，加入的Mg(ClO

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物G.3在NAH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巯基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzylbromide)10mmol2.16g存在的条件下反应4h，在真空环境中除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用饱和的氯化铵溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水层，再用硫酸钠干燥合并的有机层，真空浓缩后，通过硅胶柱色谱纯化得化合物G.45.6g(93％)；

上述合成步骤(iii)中，加入的4-巯基-2-硝基苯甲溴可以为7.5～15mmol中的任意值；

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物G.4在SiO

上述合成步骤(iv)中，加入的SiO

步骤(v)的反应条件为：步骤(iv)所得的化合物G.5在n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(v)中，加入的n-氟化四丁铵可以为5～15mmol中的任意值；

步骤(vi)的反应条件为：将步骤(v)所得的化合物G.6在三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(vi)中，加入的三氯氧磷可以为15～25mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(vii)的反应条件为：将步骤(vi)所得的化合物G.7和6.5g 10mmol

上述合成步骤(vii)中，加入的

合成路线3：

其中，步骤(i)的反应条件为：化合物10mmol2.3gC.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的条件下，室温，过夜，然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)

上述合成步骤(i)中，加入的TBSCl可以为30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物C.2在Mg(ClO

上述合成步骤(ii)中，加入的Mg(ClO

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物C.3在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巯基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzylbromide)10mmol2.16g存在的条件下反应4h，在真空环境中除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用饱和的氯化铵溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水层，再用硫酸钠干燥合并的有机层，真空浓缩后，通过硅胶柱色谱纯化得化合物C.45.1g(90％)；

上述合成步骤(iii)中，加入的4-巯基-2-硝基苯甲溴可以为7.5～15mmol中的任意值；

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物C.4在SiO

上述合成步骤(iv)中，加入的SiO

步骤(v)的反应条件为：步骤(iv)所得的化合物C.5在n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(v)中，加入的n-氟化四丁铵可以为5～15mmol中的任意值；

步骤(vi)的反应条件为：将步骤(v)所得的化合物C.6在三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(vi)中，加入的三氯氧磷可以为15～25mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(vii)的反应条件为：将步骤(vi)所得的化合物C.7和6.5g 10mmol

上述合成步骤(vii)中，加入的

合成路线4：

其中，步骤(i)的反应条件为：化合物10mmol2.4gT.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的条件下，室温，过夜，然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)

上述合成步骤(i)中，加入的TBSCl可以为30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物T.2在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巯基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)10mmol 2.16g存在的条件下反应4h，在真空环境中除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用饱和的氯化铵溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水层，再用硫酸钠干燥合并的有机层，真空浓缩后，通过硅胶柱色谱纯化得化合物T.36.0g(93％)；

上述合成步骤(ii)中，加入的4-巯基-2-硝基苯甲溴可以为7.5～15mmol中的任意值；

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物T.3在n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(iii)中，加入的n-氟化四丁铵可以为5～15mmol中的任意值；

步骤(ⅳ)的反应条件为：将步骤(iii)所得的化合物T.4在三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(ⅳ)中，加入的三氯氧磷可以为15～25mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(v)的反应条件为：将步骤(ⅳ)所得的化合物T.5和6.5g 10mmol

上述合成步骤(v)中，加入的

合成路线5：

其中，步骤(i)的反应条件为：化合物10mmol2.3gU.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的条件下，室温，过夜，然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)

上述合成步骤(i)中，加入的TBSCl可以为30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物U.2在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巯基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzylbromide)10mmol 2.16g存在的条件下反应4h，在真空环境中除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用饱和的氯化铵溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水层，再用硫酸钠干燥合并的有机层，真空浓缩后，通过硅胶柱色谱纯化得化合物U.35.4g(92％)；

上述合成步骤(ii)中，加入的4-巯基-2-硝基苯甲溴可以为7.5～15mmol中的任意值；

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物U.3在n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(iii)中，加入的n-氟化四丁铵可以为5～15mmol中的任意值；

步骤(ⅳ)的反应条件为：将步骤(iii)所得的化合物U.4在三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(ⅳ)中，加入的三氯氧磷可以为15～25mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(v)的反应条件为：将步骤(ⅳ)所得的化合物U.5和6.5g 10mmol

上述合成步骤(v)中，加入的

实施例11

一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成方法，包括如下路线1-5的任一种：

合成路线1：

其中，步骤(i)的反应条件为：2.9g 5mmol化合物A.3在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化苄(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下室温搅拌反应4h，用硫酸钠干燥后，真空浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得化合物A.93.5g(84％)；

上述步骤(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化苄可以为10～20mmol中的任意值；

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物A.9在NaN

上述步骤(ii)中，加入的NaN

上述合成步骤(iii)中，加入的SiO

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物A.11在5mmol 2.3g n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(v)中，加入的n-氟化四丁铵可以为2.5～7.5mmol中的任意值；

步骤(v)的反应条件为：步骤(iv)所得的化合物A.12在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(v)中，加入的三氯氧磷可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为4～8mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu

上述合成步骤(vi)中，加入的荧光分子标记的环辛炔可以为4～6mmol中的任意值。

为进一步说明该化合物的特征，对产物A.14进行了核磁共振模拟分析，

C

式(C)、式(D)分别对应的H谱和C谱图分别为图3中a图和b图所示。

经核磁共振检测，所得化合物A.14的结构式与核磁共振模拟结果一致。步骤(vii)所得的化合物A.14的结构式如下所示：

合成路线2：

其中，步骤(i)的反应条件为：5mmol 2.8g化合物C.3在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化苄(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下室温搅拌反应4h，用硫酸钠干燥后，真空浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得化合物C.93.3g 82％；

上述步骤(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化苄可以为10～20mmol中的任意值；

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物C.9在NaN

上述步骤(ii)中，加入的NaN

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物C.10在10mgSiO

上述合成步骤(iii)中，加入的SiO

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物C.11在5mmol 1.3g n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(v)中，加入的n-氟化四丁铵可以为3～6mmol中的任意值；

步骤(v)的反应条件为：步骤(iv)所得的化合物C.12在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(v)中，加入的三氯氧磷可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(vi)的反应条件为：将3.3g5mmol荧光分子标记的环辛炔与步骤(v)所得的化合物C.13在60℃条件下进行生物正交反应(bioorthogonal chemistry)反应2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化合物C.142.8g 84％。经核磁共振检测，所得化合物C.14的结构式与核磁共振模拟结果一致。

上述合成步骤(vi)中，加入的荧光分子标记的环辛炔可以为3～6mmol中的任意值。

合成路线3：

其中，步骤(i)的反应条件为：5mmol 3.0g化合物G.3在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化苄(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下室温搅拌反应4h，用硫酸钠干燥后，真空浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得化合物G.93.7g 86％；

上述步骤(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化苄可以为10～20mmol中的任意值；

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物G.9在NaN

上述步骤(ii)中，加入的NaN

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物G.10在10mgSiO

上述合成步骤(iii)中，加入的SiO

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物G.11在5mmol 1.3g n-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(v)中，加入的n-氟化四丁铵可以为3～6mmol中的任意值；

步骤(v)的反应条件为：步骤(iv)所得的化合物G.12在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(v)中，加入的三氯氧磷可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(vi)的反应条件为：将3.3g 5mmol荧光分子标记的环辛炔与步骤(v)所得的化合物G.13在60℃条件下进行生物正交反应(bioorthogonal chemistry)反应2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化合物G.142.8g 83％。经核磁共振检测，所得化合物G.14的结构式与核磁共振模拟结果一致。

上述合成步骤(vi)中，加入的荧光分子标记的环辛炔可以为3～6mmol中的任意值。

合成路线4：

其中，步骤(i)的反应条件为：2.9g 5mmol化合物T.2在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化苄(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下室温搅拌反应4h，用硫酸钠干燥后，真空浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得化合物T.73.1g 84％；

上述步骤(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化苄可以为10～20mmol中的任意值；

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物T.7在NaN

上述步骤(ii)中，加入的NaN

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物T.8的化合物T.8在5mmol 1.3gn-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(iii)中，加入的n-氟化四丁铵可以为3～6mmol中的任意值；

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物T.9在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(iv)中，加入的三氯氧磷可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(v)的反应条件为：将3.3g 5mmol荧光分子标记的环辛炔与步骤(iv)所得的化合物T.10在60℃条件下进行生物正交反应(bioorthogonal chemistry)反应2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化合物T.113.1g 82％。经核磁共振检测，所得化合物T.11的结构式与核磁共振模拟结果一致。

上述合成步骤(vi)中，加入的荧光分子标记的环辛炔可以为3～6mmol中的任意值。

合成路线5：

其中，步骤(i)的反应条件为：5mmol2.8g化合物U.2在5.1g15mmol4-碘-2-硝基溴化苄(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下室温搅拌反应4h，用硫酸钠干燥后，真空浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得化合物U.73.1g 86％；

上述步骤(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化苄可以为10～20mmol中的任意值；

步骤(ii)的反应条件为：步骤(i)所得的化合物U.7在NaN

上述步骤(ii)中，加入的NaN

步骤(iii)的反应条件为：步骤(ii)所得的化合物T.8的化合物T.8在5mmol 1.3gn-氟化四丁铵(n-Bu

上述合成步骤(iii)中，加入的n-氟化四丁铵可以为3～6mmol中的任意值；

步骤(iv)的反应条件为：步骤(iii)所得的化合物U.9在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl

上述合成步骤(iv)中，加入的三氯氧磷可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-双二甲氨基萘可以为4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以为7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu

步骤(v)的反应条件为：将3.3g 5mmol荧光分子标记的环辛炔与步骤(iv)所得的化合物U.10在60℃条件下进行生物正交反应(bioorthogonal chemistry)反应2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化合物U.113.2g 84％。经核磁共振检测，所得化合物U.11的结构式与核磁共振模拟结果一致。

上述合成步骤(vi)中，加入的荧光分子标记的环辛炔可以为3～6mmol中的任意值。

实施例111

为了检测本发明所合成的可逆终端是否可以应用于DNA/RNA测序，本实施例进一步检测了实施例1所制备的A.8、G.8、C.8、T.6、U.6，以及实施例11所制备的A.14、G.14、C.14、T.11、U.11的可逆终端化合物两个方面的特性：

1)是否可以被DNA聚合酶所识别，作为DNA聚合酶的底物参与DNA的延伸反应；

2)参与DNA链延伸后能否去掉该可逆终端所携带的荧光基团，以便下一轮的延伸反应。

这两方面是单分子高通量合成测序(SMTS)的核心。具体如下：

1)配制DNA延伸反应体系：依次将不同的可逆终端与DNA模板(序列信息已知，质量已知)、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow缓冲液充分混合，30℃静置15分钟，75℃处理10分钟以灭活klenow DNA聚合酶活性；采用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸飞行时间质谱法)检测延伸产物质荷比(m/z)，得到质谱图，计算DNA模板的延伸效率。

延伸效率计算公式：假如理论上100条DNA模板将在延伸反应中加上1个核苷酸，实际在延伸反应中加上1个核苷酸的DNA模板链只有96条，则延伸效率记为96％。

在本发明重复多次实验中，引入本发明化合物时，核酸延伸的延伸效率为约90％至约100％。

在一个实施方案中，在第10-20轮延伸反应中，实施例1提供的A.8、G.8、C.8、T.6、U.6，以及实施例11提供的A.14、G.14、C.14、T.11、U.11的可逆终端化合物的延伸效率为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

2)步骤1)质谱检测延伸效率后，采用LED灯或UV灯照射反应溶液体系，采用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸飞行时间质谱法)检测光敏感可逆终端化合物所携带的荧光基团断裂的产物的质荷比(m/z)，得到质谱图，计算本发明提供的可逆终端化合物的荧光切除效率。

在本发明重复多次实验中，当采用LED灯或UV灯照射反应溶液体系后，延伸核酸链上可逆终端化合物的荧光切除效率为约90％至约100％。

在一个实施方案中，在第10-20轮延伸反应中，实施例1提供的A.8、G.8、C.8、T.6和U.6以及实施例11提供的A.14、G.14、C.14、T.11、U.11的可逆终端化合物的荧光切除效率为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

为进一步说明该实施例提供的可逆终端化合物的有益效果，采用现有的单分子测序平台验证该是合理提供的可逆终端化合物在延伸反应中的反应效率，其中，采用本申请人提供的全内反射荧光成像系统(申请号为201510562591.6)采集荧光。延伸成功则全内反射荧光成像系统能检测到荧光信号，检测到荧光信号的点的比例代表延伸效率。荧光基团被切除后，荧光消失的点的比例代表切除效率。

共进行2次延伸反应，每次延伸反应中均共进行5轮反应，连续延伸5个碱基。结果如图4所示，表明本实施例提供的可逆终端化合物延伸及切割效果很好，延伸效率不低于70％，在第3轮之后的延伸反应中，延伸效率不低于80％。5轮延伸反应中，荧光切除效率均不低于90％。

综上，实施例1提供的A.8、G.8、C.8、T.6、U.6以及实施例11提供的A.14、G.14、C.14、T.11、U.11的可逆终端化合物可用于单分子高通量合成测序(SMTS)，优选地，该示例提供的A.8、G.8、C.8、T.6、U.6、A.14、G.14、C.14、T.11、U.11的可逆终端化合物同样适用于本申请人在申请号为201510501300.2的发明专利申请中要求保护的一种单分子靶向测序方法、装置、系统。具体地，还提供了如下一种单分子靶向测序方法，包括：

测序反应：测序前需要首先将待测序列打断成小片段，并在其末端标记荧光；同时在基底上随机固定多个靶向设计的引物；将小片段DNA模板与固定好的引物进行杂交并精确定位，通过全内反射显微镜(TIRF)采集光学图像来精确定位杂交后模板所处的位置；逐次加入带有可切除荧光标记的A.8、G.8、C.8、T.6、U.6、A.14、G.14、C.14、T.11、U.11末端终止子中的任一种及聚合酶的混合液孵育，洗涤，进行光学成像，记录本次反应的点位；之后再加入试剂以切除延伸点位的荧光分子，洗涤，加帽，准备好下一个核苷酸的延伸反应。通过延伸反应、成像检测和切除荧光分子的反复循环。

该示例测序反应中采用的是全内反射显微系统(TIRF)采集光学图像，因为单分子信号非常弱，TIRF系统能够显著降低背景噪音，从而提升信噪比。这个系统为双色激光光路系统，每次采集图像之前，需要按照化学冲洗流程对封装在微流控系统的样品进行处理，然后进行拍照，为了防止样品漂移，定位信息需要每次延伸反应之前进行拍照，然后碱基延伸后再拍照以获得测序信号。

该示例依据所需测序要求进行成像，每次碱基延伸反应所获的图像可能有几十或者上千个视野。对于图像的处理，需要精准计算出每个反应的坐标位置并记录；再之后的每次碱基延伸过程中所获的图像，要经过图像处理软件进行位置纠偏，校对所经历的化学冲洗过程以及样品移动造成的位置漂移。然后再进行图像重叠，对有测序反应的位置进行逐次叠加以获得每个位置的碱基序列。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。