一种检测啶氧菌酯的试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，具体地，涉及一种检测啶氧菌酯的试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

啶氧菌酯(Picoxystrobin)，化学名称为(E)-3-甲氧基-2-{2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基}丙烯酸甲酯，分子式：C

目前检测啶氧菌酯的主要检测方法为LC、GC和GC-MS等色谱检测法，这些方法设备昂贵，需要专业人员进行操作，虽然精准度高，但是检测繁琐，成本偏高，难以进行现场检测，无法适应当今追求简便、快速的市场需求；酶联免疫分析方法虽然灵敏度高、通量大，但也需专业人员操作，且检测时间较长，同样也无法满足现场快速筛查的需求；胶体金法具备高通量、操作简单、检测时间短和无需专业技术人员操作等优点，但由于难以进行定量分析，无法满足愈来愈繁重的突发事件和应急监控工作的需要。因此迫切需要一种操作简便、高灵敏度、高通量、快速且能定量的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测啶氧菌酯的试剂盒及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供式Ⅱ所述化合物作为啶氧菌酯半抗原的应用，式Ⅱ结构式如下所示：

本发明的第二个目的是提供式Ⅱ所示的啶氧菌酯半抗原在制备啶氧菌酯人工抗原中的应用，式Ⅱ结构式如下所示：

本发明的第三个目的是提供一种啶氧菌酯人工抗原。

本发明的第四个目的是提供所述啶氧菌酯人工抗原在制备啶氧菌酯人工抗体中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种啶氧菌酯单克隆抗体。

本发明的第六个目的是提供一种酶联免疫检测啶氧菌酯的免疫原与包被原的组合物。

本发明的第七个目的是提供所述啶氧菌酯人工抗原或所述啶氧菌酯单克隆抗体在制备检测啶氧菌酯产品中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种检测啶氧菌酯的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

式Ⅱ所述化合物作为啶氧菌酯半抗原的应用，式Ⅱ结构式如下所示：

式Ⅱ所示的啶氧菌酯半抗原在制备啶氧菌酯人工抗原中的应用，式Ⅱ结构式如下所示：

一种啶氧菌酯人工抗原，为式Ⅱ所示的啶氧菌酯半抗原与载体蛋白偶联所得，载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白的任意一种，啶氧菌酯人工抗原的结构式如式Ⅲ所示：

所述啶氧菌酯人工抗原在制备啶氧菌酯人工抗体中的应用。

一种啶氧菌酯单克隆抗体，是以所述啶氧菌酯人工抗原为免疫原制备得到。

优选地，制备啶氧菌酯单克隆抗体的啶氧菌酯人工抗原为啶氧菌酯半抗原与血蓝蛋白偶联所得。

一种酶联免疫检测啶氧菌酯的免疫原与包被原的组合物，所述免疫原和包被原为所述人工抗原；所述免疫原上的载体蛋白为血蓝蛋白，所述包被原上的载体蛋白为牛血清白蛋白。

所述啶氧菌酯人工抗原或所述啶氧菌酯单克隆抗体在制备检测啶氧菌酯产品中的应用。

一种检测啶氧菌酯的试剂盒，所述试剂盒中含有啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条和检测液，所述啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条包括层析膜、样品垫、吸水垫和PVC板；所述层析膜的检测区包被有所述啶氧菌酯人工抗原，作为T线，所述层析膜的质控区包被有羊抗兔IgG，作为C线；所述检测液中含有荧光微球标记的抗体，所述抗体为所述啶氧菌酯单克隆抗体。

优选地，所述啶氧菌酯人工抗原的包被浓度为0.2～0.8mg/mL，羊抗兔IgG的包被浓度为0.1～0.5mg/mL，所述检测液中荧光微球标记的抗体的稀释倍数为80～200倍。

优选地，所述样品垫的处理液中含有质量浓度0.48～0.52％BSA、2.8～3.2％蔗糖、0.05～0.10％Triton 100的0.01～0.05MPBS缓冲液。

优选地，所述层析膜的检测区包被的啶氧菌酯人工抗原，为啶氧菌酯半抗原与牛血清白蛋白偶联所得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

荧光定量免疫层析技术是基于免疫学原理和胶体金免疫层析技术发展起来的快速检测定量方法，该技术具有ELISA法的高灵敏度和胶体金法的快速的特点，检测时间只需10～15min，而灵敏度是胶体金法的3～5倍，具有操作简便、高灵敏度、高通量和快速的特点。

(1)本发明制备的啶氧菌酯半抗原最大程度保留了啶氧菌酯的特征结构，使得啶氧菌酯半抗原的免疫原性明显增强；所述啶氧菌酯半抗原具有能与载体蛋白偶联的羧基，用啶氧菌酯半抗原与载体蛋白偶联后得到的啶氧菌酯人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答，产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。

(2)本发明公开的啶氧菌酯半抗原的制备方法，原料易得，反应操作简单，反应条件易控制，制备的啶氧菌酯半抗原的纯度和收率较高。

(3)用本发明的啶氧菌酯人工抗原免疫动物，得到的啶氧菌酯单克隆抗体灵敏度高，通过ELISA检测技术，对啶氧菌酯的最低检测限为0.5μg/L。

(4)将本发明的啶氧菌酯人工抗原用于荧光定量免疫层析技术，可快速、方便地实现啶氧菌酯的检测，本发明中制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条对啶氧菌酯的检测灵敏度可达1μg/L，另外该试纸条精密度高，在室温下能稳定保存一年以上，利于保存和运输，能够实现啶氧菌酯的快速定量检测。

附图说明

图1为啶氧菌酯半抗原的合成线路图。

图2为啶氧菌酯半抗原的质谱图。

图3为啶氧菌酯半抗原、免疫原和载体蛋白紫外吸收光谱，其中A为KLH、啶氧菌酯半抗原、啶氧菌酯人工抗原-KLH紫外光谱；B为BSA、啶氧菌酯半抗原、啶氧菌酯人工抗原-BSA紫外光谱。

图4为啶氧菌酯ELISA检测结果标准曲线。

图5为啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条定量检测标准曲线。

图6为荧光定量免疫层析试纸条的稳定性测试结果，其中A为试纸条4℃稳定性情况，B为试纸条45℃稳定性情况。

图7为EDC用量对荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的影响，其中A为不同EDC用量紫外灯检测结果，B为不同EDC用量荧光仪检测结果。

图8为活化时间对荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的影响，其中A为不同活化时间紫外灯检测结果，B为不同活化时间荧光仪检测结果。

图9为紫外灯下不同抗原抗体浓度下试纸条的抑制检测结果，其中A为抗原浓度1mg/mL时不同抗体稀释倍数的检测结果；B为抗原浓度0.8mg/mL时不同抗体稀释倍数的检测结果；C为抗原浓度0.4mg/mL时不同抗体浓度稀释倍数的检测结果；D为抗原浓度0.2mg/mL时不同抗体稀释倍数的检测结果；(-)表示啶氧菌酯标准溶液浓度为0μg/L；(+)表示啶氧菌酯标准溶液浓度为20μg/L。

图10为不同样品垫紫外灯检测结果，其中(-)表示阴性样本L，(+)表示加标样本浓度为100μg/kg。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1啶氧菌酯半抗原制备方法

啶氧菌酯半抗原的合成线路图见图1，具体制备方法如下：

1.(1)取1.0g(2.72mmol)结构式如式Ⅰ所示的啶氧菌酯，于50mL圆底烧瓶中，加入8mL甲醇，在室温下搅拌溶解后，再加入4mL氢氧化锂(1mol/L)室温(20℃～30℃)下反应72h；

(2)加热蒸干步骤1的溶剂后，得到的残留物直接加入10mL纯水溶解，用乙酸乙酯萃取除杂2次，用盐酸调节pH为3～5，大量白色沉淀产生，过滤，烘干得到产物0.53g，即为结构式如式Ⅱ所示的啶氧菌酯半抗原。

2.(1)取1.0g(2.72mmol)结构式如式Ⅰ所示的啶氧菌酯，于50mL圆底烧瓶中，加入10mL甲醇，在20℃～30℃下搅拌溶解后，再加入6mL氢氧化锂(1mol/L)室温(20℃～30℃)下反应72h；

(2)加热蒸干步骤1的溶剂后，得到的残留物直接加入10mL纯水溶解，用二氯甲烷萃取除杂2次，用盐酸调节pH为3～5，大量白色沉淀产生，过滤，烘干得到产物0.53g，即为结构式如式Ⅱ所示的啶氧菌酯半抗原。

3.(1)取1.0g(2.72mmol)结构式如式Ⅰ所示的啶氧菌酯，于50mL圆底烧瓶中，加入10mL甲醇，在20℃～30℃下搅拌溶解后，再加入4mL氢氧化锂(1mol/L)室温(20℃～30℃)下反应48h；

(2)加热蒸干步骤1的溶剂后，得到的残留物直接加入8mL纯水溶解，用二氯甲烷萃取除杂2次，用盐酸调节pH为3～5，大量白色沉淀产生，过滤，烘干得到产物0.48g，即为结构式如式Ⅱ所示的啶氧菌酯半抗原。

所述式Ⅰ和式Ⅱ的结构式如下所示：

所得啶氧菌酯半抗原的质谱图如图2所示，从质谱图结果来看，杂峰比较少，目前1g原料可获得半抗原0.53g，纯度和收率较高。

实施例2啶氧菌酯人工抗原的合成

1.载体蛋白为牛血清蛋白的啶氧菌酯人工抗原的合成方法

(1)取5mg实施例1中的啶氧菌酯半抗原，溶解于0.25mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌充分后，加入5mg碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和4mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温(20℃～30℃)搅拌5h，即可得到啶氧菌酯半抗原活化酯；

(2)称取24mg牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解在2.5mL的浓度为0.01mol/L的PBS溶液中，形成载体蛋白溶液，在搅拌下将步骤1制备的啶氧菌酯半抗原活化酯逐滴缓慢滴加至所述载体蛋白溶液中，室温(20℃～30℃)搅拌16～24h；

(3)步骤(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS，室温(20℃～30℃)透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到载体蛋白为牛血清蛋白的啶氧菌酯人工抗原，命名为啶氧菌酯人工抗原-BSA；

(4)分装，于4℃保存备用。

2.载体蛋白为血蓝蛋白的啶氧菌酯人工抗原的合成方法

载体蛋白选用5mg血蓝蛋白(KLH)，其他制备方法与啶氧菌酯人工抗原-BSA的合成方法相同，得到载体蛋白为血蓝蛋白的啶氧菌酯人工抗原，命名为啶氧菌酯人工抗原-KLH。

3.人工抗原合成结果鉴定

如图3所示，图3A显示半抗原在260nm处有强的特征吸收，包被原啶氧菌酯人工抗原-BSA在273nm处有强的特征吸收峰，相对于半抗原吸收峰有明显的迁移，图3B显示免疫原啶氧菌酯人工抗原-KLH在265nm左右出现一个宽的吸收峰，相对于半抗原吸收峰有明显的迁移，因此可以说包被原啶氧菌酯人工抗原-BSA及免疫原啶氧菌酯人工抗原-KLH均被成功合成。

实施例3啶氧菌酯单克隆抗体的制备

以实施例2制备的啶氧菌酯人工抗原-KLH为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫剂量为50～100μg，免疫间隔2周，第2次加强免疫后7天，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100μg全抗原进行皮下加强免疫，3天后取小鼠脾细胞与SP20细胞融合。融合后的细胞在HAT培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成HAT培养基进行培养。用ELISA对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的啶氧菌酯单克隆抗体。

实施例4啶氧菌酯人工抗原在ELISA中的应用与效果评价

1.ELISA检测中使用的啶氧菌酯人工抗原为实施例2制备的啶氧菌酯人工抗原-BSA。

用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将啶氧菌酯人工抗原-BSA稀释至0.5μg/mL，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250μL/孔加入1％BSA，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存，得到包被有啶氧菌酯人工抗原-BSA的微孔酶标板。

2.向步骤1包被有啶氧菌酯人工抗原-BSA的微孔酶标板中加入啶氧菌酯系列标准溶液50μL/孔，再加入0.2μg/mL实施例3制备的啶氧菌酯单克隆抗体溶液50μL/孔，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液300μL/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，分别加入50μL/孔的显色液A和显色液B，37℃反应15min；加入2M硫酸50μL/孔终止，用酶标仪在450nm波长测定每孔的OD值，并分别计算与阴性对照的OD值的比值B/B0。所述阴性对照设置为啶氧菌酯标准溶液的浓度为0mg/L，其他步骤条件不变。所述洗液为含0.05％吐温-20的PBS溶液(pH7.4，0.02M)；所述显色液A制备方法为：取3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)10mg，溶于5mL无水乙醇，双蒸水定容至50mL；所述显色液B制备方法为：磷酸氢二钠1.46g，柠檬酸0.93g，过氧化氢尿素(0.75％)0.64mL，双蒸水定容至100mL，pH调至5.0～5.4。

结果如表1所示。

表1 icELISA法测试不同浓度啶氧菌酯标准品的OD值及B/B0值

由表1可知，当啶氧菌酯浓度为0.5μg/L时，其B/B0值为73.19％，说明该浓度下的OD值与0μg/L浓度的啶氧菌酯的OD值有明显差异。

通过表1数据，利用ELISA Calc软件进行Logistic曲线拟合绘制标准曲线(图4)，得到线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r2＝0.99944，A＝1.92316，B＝0.72878，C＝1.74497，D＝0.06780，x表示待测物浓度，y表示OD值，计算得到IC50值为1.94μg/L，在0.5μg/L～40.5μg/L呈线性关系。

实施例5荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的制备方法

1.取500μL荧光微球溶液(荧光微球固含量1％，即含荧光微球5mg)；冰浴搅拌下分别加入5mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和5mg碳化二亚胺盐酸盐(EDC)，控制荧光微球溶液的温度为4℃，并在此温度下活化20min，得到活化的荧光微球溶液。

2.步骤1活化完后，用0.1M碳酸钾溶液调活化的荧光微球溶液pH为9，控制荧光微球溶液的温度为4℃；加入0.4mg实施例3制备得到的啶氧菌酯单克隆抗体，搅拌均匀后，移去冰浴，让其自然升至室温(20℃～30℃)，并在室温(20℃～30℃)下搅拌4h，偶联荧光微球和啶氧菌酯单克隆抗体。

3.步骤2偶联完成后，偶联荧光微球和啶氧菌酯单克隆抗体的反应液在10000rpm条件下离心10min，除去上清，加入1mL荧光缓冲液，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入0.5mL荧光缓冲液超声重悬荧光微球，2～8℃冰箱保存备用，即得荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体，所用荧光缓冲液为含有质量浓度0.5％PVP、3％蔗糖、2％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。

实施例6检测啶氧菌酯的试剂盒

一、制备方法

1.啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的制备方法

(1)制备包被有人工抗原和羊抗兔IgG的层析膜：

以硝酸纤维素膜(NC膜)为层析膜，将实施例2制备的啶氧菌酯人工抗原-BSA用包被缓冲液稀释至0.4mg/mL，并将羊抗兔IgG用包被缓冲液稀释浓度至0.2mg/mL，所述包被缓冲液含2％蔗糖的PBS(pH7.4)，按照1μL/cm的喷膜量，将抗原和羊抗兔IgG分别喷到反应膜对应的检测区和控制区，检测区和控制区之间间隔为4mm，放置45℃烘箱处理24h，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有质量浓度0.5％蔗糖、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠的0.01M PBS缓冲液。

(2)样品垫的制备：

将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品垫处理液中，浸泡5min后，取出在37℃干燥16h，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.05％Triton100、3％蔗糖、0.5％BSA的0.05M PBS缓冲液，pH为7.4。

(3)荧光定量免疫层析试纸条的组装：

在PVC板背衬中部叠置步骤1制得的层析膜，两端分别叠置步骤2制得的样品垫和吸水垫，层析膜与吸水垫和样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，控制区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得荧光定量免疫层析试纸条。

2.荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体检测液的制备方法：

将步骤1制备的荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体取出放置至室温(20℃～30℃)，用荧光缓冲液稀释100倍，得到荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体检测液，荧光缓冲液组分与步骤1相同，然后置于2～8℃冰箱保存备用。

二、检测啶氧菌酯的试剂盒的组成

由上述检测啶氧菌酯的试剂盒的制备方法制备得到检测啶氧菌酯的试剂盒。

实施例7啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的灵敏度

一、实验方法

用含有0.01M磷酸盐缓冲液PBS配制一系列不同浓度的啶氧菌酯的标准溶液，分别为0、1、3、9、27和81μg/L。然后取实施例6制备的荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体检测液50μL，与分别与50μL配制好的系列标准品溶液混合1min后，得到荧光样本待测液。取80μL荧光样本待测液分别加到实施例5制备的荧光定量免疫层析试纸条的样品区，15min后，用荧光定量检测仪读取T/C的荧光信号值比值，检测试验设置3组重复。再通过系列标品浓度对应的T/C值建立四参数Logistic曲线，曲线所得的4个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，即可实现荧光定量免疫层析试纸条在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测。

二、实验结果

表2试纸条测试不同浓度啶氧菌酯标准品的T/C值及B/B0值

测定结果如表2所示，采用啶氧菌酯荧光定量试纸条测试不同浓度的啶氧菌酯标准品的T/C值，并分别计算与阴性对照的T/C值的比值B/B0，由表2可以看出，当啶氧菌酯含量1μg/L时，其B/B0值为73.93％，说明在此浓度点时，与阴性对照的检测结果有明显的差异，可以设定啶氧菌酯的荧光定量免疫层析试纸条对啶氧菌酯的检测灵敏度可以达到1μg/L。

根据表2数据，利用ELISA Calc软件进行Logistic曲线拟合绘制标准曲线(图5)，得到线性方程为：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，r

实施例8实际样品添加回收实验

1.前处理方法

(1)蔬菜、水果：选取代表性蔬果样品，剪成1cm见方左右碎片，称取2.0g于15mL离心管中，加入4mL样本提取液，上下翻转振荡摇匀50次以上，上清液即为待测液，所述样本提取液为pH7.2的PBS缓冲液；

(2)乳制品：吸取500μL牛奶样品加入2mL离心管中，加入500μL样本提取液，混匀即为待测液，所述样本提取液为pH7.2的PBS缓冲液；

(3)粮食、谷物：将粮食样品粉碎均质后，称取0.5g于15mL离心管中，加入2.5mL样本提取液(正己烷：丙酮＝1:2)，振荡摇匀1min，4000r/min离心2min，移取500μL上清液至2mL离心管冷风吹干(吹干温度45℃以内)，吹干后取200μL样本提取液复溶，涡旋30s混合均匀，复溶液即为待测液，所述样本提取液为pH7.2的PBS缓冲液；

2.回收率实验

选取经过验证为阴性的样品，对蔬菜、水果、粮食3大类样品进行回收率试验，具体样本为：蔬菜(黄瓜、娃娃菜、辣椒和上海青)，水果(葡萄、西瓜、草莓和香梨)，粮食(大米、小麦、玉米和大豆)；配制一定浓度啶氧菌酯标准液进行样本加标；蔬菜、水果样本的啶氧菌酯加标浓度分别为0μg/kg、5μg/kg、10μg/kg和20μg/kg；粮食样本的加标浓度分别为0μg/kg、10μg/kg、20μg/kg和50μg/kg。

按步骤1的方法进行样本前处理后，得到待测液。取1.5mL离心管，加入50μL实施例6制备的检测液及50μL不同样本待测液混合1min，得到荧光样本待测液。分别吸取80μL不同浓度的荧光样本待测液，滴加在实施例5制备的荧光定量免疫层析试纸条上，15min以后，用已经录入了标准曲线的荧光定量免疫层析分析仪(见实施例7)进行测试，读取T/C的荧光信号值比值，记录结果。其中蔬菜类样品、水果类样品添加回收率为80.2％～120.1％；粮食类样品添加回收率为70.1％～120.9％。

实施例9啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的稳定性

一、实验方法

为了确保实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验。将实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条在4℃、45℃条件下连续放置60天，并在第1天、2天、4天、7天、14天、30天和60天分别检测荧光信号值，检测方法见实施例8，T值为检测区荧光信号值，C值为控制区荧光信号值。

二、实验结果

由图6A和图6B可知，在4℃及45℃温度环境下，实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条在放置60天后，其T线荧光信号值、C线荧光信号值及T/C的值均无发生明显的变化，在加速稳定性试验45℃下，至少可以稳定地保存60天，说明实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条可以在室温条件下保存一年以上。

实施例10荧光定量免疫层析试纸条的精密度

一、实验方法

以实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的检测区、控制区和T/C值的批内误差和批间误差来表示该方法的精密度，并分别以批内变异系数和批间变异系数来体现批内误差和批间误差。

测定同一批次的10条实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的检测区、控制区信号值和T/C值的数据，并对这些数据进行离散程度分析，得到批内变异系数。

测定不同批次的10条实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的检测区、控制区信号值和T/C值的数据，并对这些数据进行离散程度分析，得到批间变异系数。

按变异系数公式CV％＝[标准偏差SD值/平均值]×100％，分别计算实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的批内变异系数和批间变异系数。

检测方法见实施例8。

二、实验结果

由表3可知，批内变异系数测定时，其C线荧光信号值测试均值为3480.56，变异系数CV值为1.46％；T线荧光信号值测试均值为12092，变异系数CV值为2.67％；T/C的值测试均值为3.47，变异系数CV值为2.61％，说明实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的批内的变异系数小，精密度高。

由表4可知，批间变异系数测定时，其C线荧光信号值测试均值为3481.33，变异系数CV值为1.82％；T线荧光信号值测试均值为12070.89，变异系数CV值为2.56％；T/C的值测试均值为3.47，变异系数CV值为3.06％，说明实施例5制备的啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条的批间的变异系数小，精密度高。

表3荧光定量免疫层析试纸条的批内精密度和变异系数(n＝10)

表4荧光定量免疫层析试纸条的批间精密度和变异系数(n＝10)

实施例11 EDC用量对荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体标记的的影响

一、实验方法

在荧光微球中分别加入1mg、3mg、5mg、7mg、9mg和12mg EDC，其他荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的制备方法与实施例5相同，检测方法见实施例8。

二、实验结果

在紫外灯下的检测结果如图7A所示，用荧光定量免疫分析仪检测其荧光信号值如图7B所示，由图7A可知，EDC的加入量过低或过高，荧光强度均减弱，由图7B曲线图可看出，当EDC的量为4mg～10mg时，荧光信号值均超过10000，其中以EDC的加入量为5mg时，达到最大值，因此EDC的量可以确定为5mg。

实施例12活化时间对荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的影响

一、实验方法

控制荧光微球的活化时间分别为5min、10min、20min、30min、40min、60min、90min和120min，其他荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的制备方法与实施例5相同，检测方法见实施例8。

二、实验结果

在紫外灯下的检测结果如图8A所示，用荧光定量免疫分析仪检测其荧光信号值如图8B所示，由图8A和B可知，在活化时间5min～20min时，荧光信号值快速增大，当活化时间达到20min～120min之间时，荧光信号值较为稳定，荧光仪检测的信号值均在11000以上，当活化时间达到20min以上时，荧光微球的活化处于饱和状态，因此活化时间可以确定为20min。

实施例13免疫层析试纸条的包被原浓度和检测液中荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的稀释倍数对检测效果的影响

一、实验方法

按照实施例5的方法，用抗原包被缓冲液将包被原(实施例2制备的啶氧菌酯人工抗原-BSA)分别稀释成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL和1mg/mL 4个浓度，制备啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条。用荧光缓冲液稀释将实施例5制备的荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体分别稀释50、80、100、200和300倍，制备荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体检测液。啶氧菌酯标准溶液浓度为20μg/L，测试不同抗原抗体组合条件对啶氧菌酯标准溶液的抑制率，确定最佳的抗原抗体组合，用荧光定量免疫分析仪进行检测，并计算其T/C值，检测方法见实施例8。

二、实验结果

在紫外灯下的检测结果如图9所示，其中A为抗原浓度1mg/mL时不同抗体稀释倍数的检测结果；B为抗原浓度0.8mg/mL时不同抗体稀释倍数的检测结果；C为抗原浓度0.4mg/mL时不同抗体浓度稀释倍数的检测结果；D为抗原浓度0.2mg/mL时不同抗体稀释倍数的检测结果；(-)表示啶氧菌酯标准溶液浓度为0μg/L；(+)表示啶氧菌酯标准溶液浓度为20μg/L。试纸条的荧光强度与包被浓度成正相关，与荧光微球的稀释倍数成正相关，需要结合仪器检测数据计算抑制率进行综合筛选。抑制检测结果如表5所示。

当包被原的包被浓度为0.4mg/mL，荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体检测液稀释倍数为100倍时，啶氧菌酯标准液浓度为20μg/L的抑制率可以达到67.94％。因此包被原的包被浓度为0.4mg/mL，荧光微球标记的啶氧菌酯单克隆抗体的最佳稀释倍数为100倍。

表5不同抗原抗体浓度下试纸条的抑制检测结果

实施例14样品垫处理液对检测效果的影响

一、实验方法

根据样品垫的离子强度和表面活性剂的浓度的不同设计了4种样品垫处理液配方，配方如表2所示，按照实施例5的方法，分别制作样品垫，得到啶氧菌酯荧光定量免疫层析试纸条。选用番茄作为样本，加标啶氧菌酯标准溶液至样品终浓度为100μg/kg，用荧光定量免疫分析仪进行检测，检测方法见实施例8。

二、实验结果

结果如图10所示，样品垫B、C和D三组阴性样本的荧光信号最强，阳性样本结果以AC两组荧光信号微弱，因此从抑制效果来看，以C组为较佳。用荧光定量免疫分析仪进行检测，并根据T/C值计算抑制率，结果如表6所示。

以C组样品垫的抑制效果为最佳，可作为样品垫配方的最佳方案，即样品垫处理液为含质量浓度0.5％BSA、3.0％蔗糖、0.05％Triton 100的PBS缓冲液(pH＝7.4，0.05M)。

表6不同样品垫配方抑制率检测结果

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。