基于多巴胺聚合的活细胞表面功能化及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用化学材料或生物膜对细胞表面进行修饰的方法、其制备的细胞及应用，特别地，是涉及一种基于多巴胺聚合的活细胞表面功能化和应用。

背景技术

细胞生物学和微生物学方面的最新发现突出了基于细胞的疗法的重要性，这种疗法提供了改变和治疗现有药物无法充分解决的疾病进程的潜力。活细胞的使用包括造血干细胞的输血，嵌合抗原受体T细胞疗法和粪便微生物群移植，已经成功地治疗了许多顽固性疾病，例如先天性缺陷，癌症和炎性肠病。不幸的是，细胞在处理过程中易受到不良环境的影响，例如在操作过程中遇到的大幅度温度波动和离心力作用，以及移植后遭受的宿主免疫系统和代谢微环境的损害，从而导致细胞死亡和治疗效果下降。此外，单形式的疗法易导致治疗效果不足，这主要是由于复杂的细胞相互作用的特性和细胞靶标的多样性。因此，迫切需要一种能够同时具有细胞保护作用并赋予细胞多种功能的策略来工程化改造预想的细胞来增强细胞疗法的疗效。

活细胞的表面修饰是将功能性基团附加到细胞表面，这样是提供了一种独特的工具，能够以可编辑的方式生成工程细胞，使细胞具有本身所不具有的外源特性。目前，已经开发出多种方法来用化学合成细胞保护涂层来包被细胞，形成核壳结构。例如，给哺乳动物细胞包被一层聚合物、二氧化硅或磷酸钙的外衣，保护细胞在操作、处理和储存过程中免受外部侵害，从而增强存活率。作为真菌的代表，给酵母细胞穿上一层Fe(III)-鞣酸的复合物外衣来保护其免受有害环境的侵害。最近，申请人用生物膜包被了益生菌，以保护细菌免受现实环境中的致死因素的影响。例如，经红细胞膜伪装的益细菌具有免疫原性屏蔽作用，可减少巨噬细胞对它们的清除。然而，传统的表面修饰涉及复杂而繁琐的制造过程，并且对各种细胞的可及性和通用性有限。更重要的是，大多数已报道的方法都涉及单一的细胞保护功能，缺乏多功能性，而这对于增强细胞疗法的疗效至关重要。

聚多巴胺(PDA)是一种受贻贝中的粘附蛋白启发的合成材料，由于其邻苯二酚基团具有很强的粘附性，因此已被广泛用作各种表面的包被层。多巴胺的聚合反应是在细胞相容性条件下发生的，由此产生的PDA表现出微不足道的细胞毒性。由于细胞膜上存在胺基、硫醇和羟基，PDA可以通过形成共价键或氢键沉积在细胞表面。据此，通过多巴胺和功能性分子共沉积的方法有望在细胞表面形成多功能化包被层。

发明内容

本发明涉及了一种利用多巴胺的聚合改性或修饰的细胞，具体地，本发明涉及了多巴胺聚合介导的活细胞表面多功能化修饰方法以及多巴胺壳聚糖共修饰的益生菌制剂用于肠炎的治疗。所述的聚多巴胺多功能化细胞外衣或包被层是在细胞相容条件下制得，该细胞外衣依据共沉积的分子种类能够赋予活细胞额外的功能。

优选地，所述多巴胺在细胞相容性的条件下聚合时，加入功能性分子以使得细胞表面同时包被多巴胺聚合物和功能性分子。

优选地，多巴胺和氨基末端的聚环氧乙烷和/或壳聚糖共沉积在细胞表面，以形成包含氨基末端的聚环氧乙烷和/或壳聚糖的多巴胺聚合物；优选地，所述壳聚糖为脱乙酰壳聚糖。

所述多巴胺与荧光素共沉积在细胞表面。

优选地，所述细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

本发明另一方面涉及一种基于多巴胺聚合的表面功能化细胞，细胞表面包被有壳聚糖与多巴胺反应形成的包被层；所述包被层通过壳聚糖与多巴胺共沉淀形成；优选地，所述壳聚糖为脱乙酰壳聚糖。

本发明还涉及基于多巴胺聚合对活细胞表面功能化的方法，在细胞相容性条件下，多巴胺和功能性分子通过共价键、氢键或π-π堆积共沉积到细胞表面，以在细胞表面聚合形成功能化聚多巴胺包被层。

所述多巴胺与氨基末端的聚环氧乙烷和/或荧光素共沉积，和/或多巴胺与壳聚糖共沉积。

本发明涉及改善胃肠道功能和/或治疗结肠炎的药物，包括如上所述的基于多巴胺聚合的表面功能化的细胞。

附图说明

图1是本发明涉及包被的活细菌细胞的实施例；图1a是用多巴胺辅助共沉积功能性小分子和聚合物制备包被的EcN的示意图；图1b是天然和PDA包被EcN的代表性TEM图像，比例尺：400nm；图1c是EcN@PE的TEM观察图(左)和横切面照片(右)；图1d是UV-Vis光谱显示天然和包被的细胞；图1e，1f为FIFC(e)和罗丹明B(f)共沉积的EcN的代表性共聚焦照片；图1g，1h为修饰有P/FITC(g)和P/罗丹明B(h)的EcN的流式细胞分析。红色和蓝色曲线分别表示天然细胞和被膜细胞，比例尺：10μm；图1i为Rho-PEO共沉积到表达pBBR1MCS2-Tac-eGFP的EcN的共聚焦图像，比例尺：10μm；图1j为玻璃片上未包被和包被的EcN压片的水接触角；图1k为共沉积Rho-PEO的EcN的流式细胞分析。红色和蓝色曲线分别显示天然和包被细胞；图1l为基于平板计数的未包被和包被的EcN的细菌存活率。下标表示在制备过程中总浓度设定为0.5或1.0mg/ml；制备包被的EcN之后，将稀释后的100μl细胞悬浮液铺在LB琼脂平板上，于37℃孵育24小时后计数；图1m为天然和包被EcN的生长曲线，将细菌在LB培养基中于37℃下培养，并在指定的时间点测量OD600。误差条代表标准偏差(n＝3)。

图2是EcN@P/FITC和EcN@P/罗丹明B的典型TEM图像。比例尺：1μm。

图3a基于平板细胞计数的未包被和包被的EcN的细菌生存率；图3b是未包被和包被的EcN的培养皿。

图4是包被的酵母的制备和表征。图4a为通过多巴胺辅助共沉积使活酵母多功能化的示意图；图4b为天然和包被的酵母细胞的共聚焦图像。比例尺：50μm。插图突出显示了单独包被的细胞。比例尺：5μm；图4c为天然和包被酵母细胞的代表性TEM图像。比例尺：1μm；图4d为天然酵母和包膜酵母细胞的UV-Vis吸收光谱；Rho-PEO用于制备EcN@PE；图4e，f为FITC(e)和罗丹明B(f)共沉积的酵母细胞的荧光图，比例尺：50μm。插图为包被的细胞。比例尺：5μm；图4g为Yeast@PE的代表性平面和z-stack共聚焦图像。绿色通道表示PDA外壳，红色通道表示Rho-PEO共沉积的PDA外壳，合并通道显示荧光信号的重叠。比例尺：5μm。图4h-j为与FITC(h)、罗丹明B(i)和Rho-PEO(j)共沉积的酵母细胞的流式细胞仪分析。红色和蓝色轮廓分别表示天然酵母和带包被层酵母。图4k为天然和包被酵母细胞的细胞活力测定。包被后，将100μl每种稀释的样品铺展到YPD琼脂平板上，并在37℃下孵育48小时，然后计数。图4l为天然和包被酵母细胞的生长曲线。酵母在YPD培养基中于37℃培养，并在指定的时间点测量OD600。图4m天然和包膜酵母细胞的水接触角。误差条代表标准偏差(n＝3)。

图5是Yeast@P/FITC和Yeast@P/罗丹明B的代表性TEM图像。比例尺：1μm。

图6是天然酵母和Yeast@P的代表性共聚焦图像。蓝色通道显示酵母被DAPI染色，绿色通道显示PDA包被层，红色通道显示罗丹明B发出的荧光。

图7a是基于平板细胞计数的天然酵母和包被酵母的活力测定；图7b为未包被和包被酵母的培养皿；将每份含酵母的稀释液100μl铺在含抗生素的琼脂平板上，在37℃下孵育48小时。

图8包被哺乳动物细胞。图8a是通过多功能PDA包被来修饰哺乳动物细胞。图8b是天然(左)和包被(右)Hela细胞。比例尺：1μm。图8c是与多巴胺和Rho-PEO共沉积的HeLa细胞的代表性平面和z-stack共聚焦图像；绿色通道表示Rho-PEO共沉积壳。

图9Rho-PEO和PDA共沉淀包被HeLa细胞的共聚焦图像。

图10天然HeLa细胞和被包被的HeLa细胞的共聚焦图像。蓝色通道表示DAPI染色的细胞，红色通道显示PI染色的细胞，和绿色通道为PDA包被的细胞。比例尺(Scale bar)：100μm。

图11功能化聚多巴胺外衣包被益生菌提供保护细胞作用。图11a壳聚糖和多巴胺共沉积到益生菌表面示意图；图11b为悬浮在PBS中的天然和包被EcN的电子照片；图11c为EcN@P和EcN@PCS的典型TEM图像；图11d为EcN@PCS的共聚焦图像；红色通道显示能够生成pBBR1MCS2-Tac-mCherry的EcN，绿色通道显示FITC-标记的壳聚糖；重叠通道(橙色)显示荧光信号的重叠。比例尺：5μm；图11e为EcN(红色)和Ecn@PCS(蓝色)的流式分析；图11f为在PBS中天然和包被的EcN的Zeta电位；g-i天然和包被EcN暴露在37℃的(g)0.3mg/ml胆汁酸，(h)含有胃蛋白酶的SGF(pH 2)，(i)含有胰蛋白酶的SIF中特定的时间间隔后，取出100微升样品用PBS洗涤两次后，平铺在LB琼脂板上，于37℃孵育24小时后计数。通过单因素方差分析ANOVA与Tukey事后检验评估显着性，显示p值，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。

图12为EcN@PCS的典型TEM图像。比例尺为1μm。

图13为能够产生pBBR1MCS2-Tac-mCherry的EcN和EcN@P的共聚焦图像。

图14为分别暴露于含有胃蛋白酶的SGF(pH 2)和0.3mg/ml的胆汁酸1h后的EcN，EcN@P和EcN@PCS的TEM图像。

图15为多巴胺与壳聚糖共沉积外衣提高益生菌的口服利用率和结肠部位的靶向性。图15a为分散到PBS中相同数量的天然和包被EcN的IVIS图像；图15b-e为健康小鼠肠道内天然和包被EcN的存活效果。通过灌胃法给每只小鼠喂食活的2×10

图16为EcN，EcN@P和EcN@PCS灌胃后4小时，正常小鼠的肠道中的细菌计数。

图17多巴胺与壳聚糖共沉积外衣提高小鼠DSS诱导的结肠炎的治疗效果。图17a，为治疗的实验设计。用4％DSS喂养小鼠7天以发展成结肠炎小鼠，然后每天口服2×10

图18是，利用EcN、EcN@P和EcN@PCS处理4小时后的DSS小鼠的胃肠道的细菌数量。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处描述的具体实施方式仅用于解释本发明的技术方案、发明构思，而非对本发明所做的限制性说明。

生物膜修饰的细胞或经生物膜修饰的细胞，是利用分隔细胞器或外界的膜系统，隔绝外界周围环境，能够让细胞独立于外部环境而存在。一般的生物膜由脂质组成，或者具有生物相容性的化合物聚合形成等。

本申请涉及的PDA包被层，其多巴胺在细胞相容性条件下简单共沉积形成，同时可以包含各种功能性小分子，从而在细胞表面形成多功能包被层。申请人证明了这种方法可以包被各种细胞(包括细菌、真菌和哺乳动物细胞)的可及性和多功能性。借助氢键、π-π堆积、迈克尔加成和席夫碱反应，可以简单地将各种功能性小分子和多巴胺共聚合以形成多形态PDA包被层。多功能PDA可以包被在微生物和哺乳动物细胞(包括细菌，真菌和人类哺乳动物细胞)的表面，并且包被的细胞在活力和生物活性方面的变化可忽略不计。

本发明的具体实施例中，基于多巴胺聚合物的表面功能化的细胞，其细胞表面包被多巴胺聚合物；参照如上所述，多巴胺聚合物，是通过多巴胺在细胞相容性条件下形成并聚合在细胞表面，或沉积到细胞表面而形成。本发明的某些实施例中，将其他功能性分子和多巴胺共沉淀到细胞表面，例如聚环氧乙烷(例如经过修饰)，荧光素等。

本发明的其他实施例中，本发明涉及的多巴胺聚合的表面功能化的细胞，多巴胺和壳聚糖共沉积在细胞表面；申请人发现与氨基末端的聚环氧乙烷、壳聚糖共沉积的细胞，相对于单多巴胺聚合，进一步增强细胞对胃肠道应激源的存活率，提高其体内存活率。

包被后的细胞，例如与配体共沉积的肠道菌群，作为靶向治疗结肠炎的口服疗法。由于包被层增加了对胃酸和胆汁盐的耐受性，与未包被的细菌相比，修饰的细胞在小鼠胃中的存活率高出6倍，在肠道中的保留率高出30倍以上。通过对发炎的结肠粘膜的靶向能力，被包被的细胞在病理组织中进一步显示出4倍更高的积累。值得注意的是，与一线药物氨基水杨酸(ASA)相比，这些多形态细胞在硫酸葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型中显示出极大的治疗功效。

实验材料和准备

EcN菌株购自中国普通微生物培养物收集中心(GMCC，中国)，并在37℃的含有抗生素的Luria Bertani(LB)培养基培养。

HeLa细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640培养基(美国Sigma)中培养，其培养基添加了10％(v/v)灭活的FBS(美国Sigma)和1％的抗生素/抗真菌溶液(v/v)，在37℃，5％CO

PEO-NH

实施例1表面修饰的大肠杆菌

选取大肠杆菌的一个菌落(EcN)置于含有适当抗生素的LB培养基中于37℃孵育5小时。通过在4200×g下离心5分钟收集细菌，并将其重悬于冰冷的PBS中。然后将EcN添加到1ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，10mM Tris-HCl缓冲液中包含1mg/ml的多巴胺和3.0×10

本实施例中，氨基末端的聚环氧乙烷(PEO-NH

然后，申请人测试了包被细胞的活力和生长状况。如图1l所示，当多巴胺和PEO-NH

实施例2表面修饰的酵母

从酵母提取蛋白胨-葡萄糖(YPD)肉汤琼脂平板中选出一个酿酒酵母菌落，置于在YPD肉汤中后，将酵母在37℃的振荡培养箱中培养24小时。通过以4000×g离心5分钟收集细胞，并通过用PBS洗涤3次来纯化。将2×10

作为真菌的代表，酵母细胞可用于评估包被层的可及性和多功能性。通过在弱碱性溶液中与多巴胺简单混合并在室温下振荡，即可制备PDA包被的酵母细胞(Yeast@P)。以同样的方法，在聚合过程中，加入功能性分子，可制得PEO-NH

实施例3表面修饰的哺乳细胞

在含有10％胎牛血清(FBS)，200U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养HeLa细胞。通过胰蛋白酶处理收集细胞，并用PBS洗涤3次。将HeLa细胞(2×10

在确认了该方法包被微生物细胞(大肠杆菌和酵母菌)的能力之后，申请人检测了包被哺乳动物细胞的可行性。将人HeLa细胞与多巴胺和PEO-NH

实施例4壳聚糖和多巴胺共沉积包被细菌

将携带pBBR1MCS2-Tac-mCherry的EcN(卡那霉素抗性)置于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。将过夜培养液在新鲜的LB培养基中按1:50稀释，并在37℃下孵育5小时。通过以4000×g离心5分钟来收集细菌。然后将EcN添加到15ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，该缓冲液含有0.5mg/ml的多巴胺和2×10

通过PDA与壳聚糖上的氨基之间的迈克尔加成反应以及席夫碱反应，壳聚糖可成功掺入包被层中(图11a)。如图11b所示，用PDA和脱乙酰壳多糖共沉积聚多巴胺(EcN@PCS)装饰后的EcN悬浮液分别呈现出浅灰色和深灰色。与PDA包被的EcN相比，EcN@PCS具有较为光滑外壳，该外壳由许多均匀而紧凑的纳米颗粒组成(图11c和图12)。这是由于壳聚糖上存在的大量氨基与PDA之间可发生交联作用。通过与FITC标记的壳聚糖(FITC-CS)共沉积可标记PCS外壳，并在共聚焦成像下显示绿色荧光(图11d和图13)。细胞流式图显示出荧光强度明显增强，进一步证实了壳聚糖成功掺入到包被层中(图11e)。Zeta电势测量显示分别用PDA和PCS包被后，细胞表面电位从-24mV升高到-21和-16mV(图11f)。EcN@PCS的Zeta电位的增加主要归因于包被层中存在带正电荷的壳聚糖。

实施例5益生菌口服利用率的提高

申请人进一步研究了包被层保护细菌抵抗胃肠道(GI)环境损害的作用。PDA包被层增加了EcN在含有胃蛋白酶的模拟胃液(SGF，pH 2)中的存活率(图11g)。值得注意的是，与壳聚糖的共沉积进一步增强了它们对SGF的抵抗力，这归因于共沉淀后能够在EcN表面形成紧密而均匀的外壳。与SGF接触3小时后，EcN@P的存活率是未包被的EcN的2.5倍，EcN@PCS的存活率是未包被的EcN的15倍。图11h显示了在0.3mg/ml胆汁酸中EcN存活率，存活的细菌数量随时间的增加而减少，与未包被的EcN和EcN@P相比，EcN@PCS保持最高的存活率。TEM图像从视觉上证明PCS包被层在胃液和胆汁酸中依然能够保持其完整性(图14)。在含有胰蛋白酶的模拟肠液(SIF，pH 6.8)中的生长情况表明，用PDA或PCS包被后，细菌保留了其增殖能力(图11i)。综上，PCS包被层极大地提高了细菌在胃肠道中的存活率，并且对其生物活性的影响有限。

为了检查PCS包被层是否可以提高小鼠体内EcN存活率，口服给药后评估了EcN在胃肠道中的保留情况。值得注意的是，用PDA或PCS包被层对携带pBBR1MCS2-Tac-mCherry的EcN的荧光强度的影响微不足道(图15a)。在给小鼠灌胃2×10

实施例6靶向传输到病理组织

考虑到壳聚糖靶向结肠的能力，申请人研究了PCS包被层是否可以增强DSS诱导的小鼠结肠炎模型中EcN在炎症性结肠组织中的积累。根据IVIS分析显示，与未包被的EcN和EcN@P相比，在2×10

实施例7增强结肠炎的治疗功效

申请人研究了EcN@PCS对治疗DSS诱导的小鼠结肠炎的功效。给小鼠喂食4％DSS，持续7天以产生炎症，然后每天给小鼠灌胃EcN@PCS,并持续五天(图17a)。用PBS、未包被的EcN和ASA灌胃的炎症性老鼠组以及健康的小鼠组作对照组。用DSS喂养可引起小鼠体重持续下降，而用EcN@PCS治疗可有效恢复体重(图17c)。在治疗5天后，测量肠道的长度，在所有治疗组中，EcN@PCS治疗的小鼠显示出最大的平均长度，这近似于健康小鼠的平均长度(图17b和17d)。此外，进行了双盲酶联免疫吸附测定(ELISA)和组织病理学分析以评估结肠的炎症。与PBS，未包被的EcN和ASA组相比，EcN@PCS处理的小鼠可显着减轻炎症，血清中白介素6(IL-6)处于最低水平，该水平与健康的小鼠接近(图17e)。组织病理学分析结果显示，与PBS(平均评分8.7)，未包被的EcN(平均评分6.3)和ASA(平均评分7.0)组的小鼠相比，从接受EcN@PCS处理的小鼠中收获的结肠组织的病理评分显着下降(平均评分3.0)(图17f)。图17h中的苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像显示，与健康结肠相似，从用EcN@PCS处理的小鼠中采样的结肠组织中未观察到明显的组织学损伤和炎症区域。另外，髓过氧化物酶(MPO)染色表明用EcN@PCS处理的小鼠的MPO阳性细胞平均数最低。如图17g和17i所示，在炎症性结肠中EcN的积累明显增加。增加的EcN能够通过调节菌群平衡和抑制促炎细胞因子和趋化因子的表达来改善结肠炎的治疗效果。

本申请中，通过在细胞相容性条件下与多巴胺简单混合，已将各种功能性小分子和聚合物合并到包被层中。细胞表面的物理化学性质和相关功能都可以通过调节包被层的结构组成来调控。申请人已经证明了这种策略装饰多种细胞(包括细菌，真菌和人类哺乳动物细胞)的多功能性和可行性。同时，申请人设计并制备了多巴胺与壳聚糖共沉积包被的益生菌，作为增强结肠炎治疗的口服药剂。由于包被层具有双重的细胞保护和结肠炎部位靶向作用，与未包被的细菌相比，经修饰的细菌表现出明显提高的口服生物利用度和在发炎组织中的靶向积累。临床前研究已经证实，即使在结肠炎的小鼠模型中，与现有药物相比，治疗效果也大大提高。