一种果酒及其发酵方法

技术领域

本发明属于酒类酿造技术领域，具体涉及一种果酒及其发酵方法。

背景技术

椪柑等宽皮桔、南丰蜜桔以及脐橙等柑橘类水果营养丰富、滋味香甜的常见水果，在中国有着悠久的种植历史并且产量很高。将柑橘类水果加工成果汁和果酒，能够解决高产量导致的库存过剩和果实腐败的问题，从而达到延长保质期和增加其附加值的目的。柑橘类水果果汁是柑橘类水果榨出的原果汁。柑橘类水果果酒是一种发酵型低酒精度果汁饮料，口感清醇，富含多种维生素、氨基酸、钙、镁等营养物质以及有机酸，能帮助人体代谢，控制体内平衡，深受广大消费者喜爱。

目前，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是商业果酒发酵最常用的发酵菌株，其发酵性能稳定，但发酵产品风味单一，极大的限制了果酒的发展。

非酿酒酵母是果酒酿造过程中的重要微生物，在果酒发酵风味物质形成中起着决定性作用，近几年有研究发现，非酿酒酵母的加入可以产生多种胞外酶如果胶酶、蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶等，这些酶作用于果果汁的相关底物从而增加果酒的香气成分，使果酒风味更加丰富醇和。但非酿酒酵母单独发酵时，其发酵性能并不稳定，发酵能力低，难以完成发酵过程，很难满足实际生产需求。

发明内容

近些年，一部分技术人员发现商业酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非酿酒酵母(Hanseniaspora guilliermondii)通过顺序发酵的发酵方式，能够解决单独使用酿酒酵母和单独使用非酿酒酵母的问题；但其中维生素C、乳酸、橙皮素和川陈皮素含量较低，且口感并不如单独采用非酿酒酵母发酵得到的果酒的保健和口感；而且还有研究报道称酿酒酵母在发酵过程中会对非酿酒酵母存在抑制作用。

因此，本发明为了解决现有发酵的南丰蜜桔果酒口感单一、维生素C、乳酸、橙皮素和川陈皮素含量较低等问题，提供了一种通过两株经过筛选得到的特定非酿酒酵母菌株的混合发酵方法，包括以下步骤：由第一非酿酒酵母菌和第二非酿酒酵母菌混合接种至果汁中发酵制得所述果酒；所述第一非酿酒酵母菌的名称为Hanseniaspora guilliermondiiNF6，已于2022年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20221615；所述第二非酿酒酵母的名称为Hanseniasporathailandica YLL16，已于2018年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018140。

发明人发现这两株特定的非酿酒酵母能够相互协同配合发酵，大大提高了非酿酒酵母的发酵能力，同时相比于单独使用商业酿酒酵母或者商业酿酒酵母与非酿酒酵母的混合发酵方式得到的果酒，本发明制得的果酒口感更好，维生素C、乳酸、橙皮素和川陈皮素含量更高。在发酵技术中有关非酿酒酵母混合发酵柑橘类水果果酒的方法还尚未见报道。目前，针对于柑橘类水果果汁通过非酿酒酵母制备柑橘类水果果酒的研制和生产也较少，使用柑橘类水果果汁制备柑橘类水果果酒具有较好的前景。

本发明通过选择有效的发酵菌株和发酵方式，取得更佳的果酒感官品质和含量更高的生物活性物质，为运用非酿酒酵母发酵柑橘类水果果酒提供理论支撑和推动了柑橘类水果(椪柑等宽皮桔、南丰蜜桔以及脐橙等)果酒的实际应用，在本发明中具体以南丰蜜桔为对象。

在一些优选的实施情况中，所述第一非酿酒酵母菌和所述第二非酿酒酵母的加入量比例为(0.5-1)：(1-10)。比例过低或过高均会导致发酵进程缓慢，糖醇转化率下降。更优选为1:1，比例过低或过高均会导致发酵进程缓慢，糖醇转化率下降。更优选地，所述第一非酿酒酵母菌和所述第二非酿酒酵母的接种量均为体系总体积的7％-9％，比例过低会导致发酵进程缓慢，过高则会影响发酵产物生产，导致果酒感官品质不佳。

在一些优选的实施情况中，上述果酒发酵方法中果汁的糖度为9°Brix-21°Brix，pH为3.8-4.2。更优选地，果汁的糖度为20°Brix，pH为3.8。糖度过低会导致发酵过程缓慢，糖度过高会抑制发酵。依据所述第一非酿酒酵母菌和所述第二非酿酒酵母的最适pH，pH过低会抑制发酵，过高则会增加杂菌污染的可能和抑制发酵。糖度调整方法是通过往南丰蜜桔果汁中加可饮用水，pH调整的方法是加柠檬酸或食用小苏打进行调整。

果汁在进行接种发酵前还需进行抑菌和澄清操作，然后静置20-24h。所述抑菌操作具体为：加入食品级焦亚硫酸钠，使南丰蜜桔果汁中有效SO

在一些优选的实施情况中，上述果酒发酵方法中发酵的条件发酵的条件包括：依据所述第一非酿酒酵母菌和所述第二非酿酒酵母的最适发酵温度，选择发酵温度为27℃-29℃，通气频率为1次/d-2次/d，温度过高或过低均不利于发酵非酿酒酵母菌的生长，通气能促进菌株的生长，但频率过高会增加杂菌污染的可能。

在一些优选的实施情况中，所述第一非酿酒酵母菌和所述第二非酿酒酵母混合接种前还需要进行菌株活化，具体过程包括：将菌株1和菌株2分别接种于YPD液体培养基中，于28℃培养至对数生长后期，再将活化一代后的菌液接种于YPD液体培养基中，于28℃培养至对数生长后期即可。

YPD培养基的配制方式如下：取10g蛋白胨、5g酵母浸粉、20g葡萄糖与1L水混合均匀后，在温度为121℃下灭菌30min。YPD培养基是用于各类酵母常规生长的复合培养基，相较于其他的酵母培养基如SC、YNB等具有营养全面性价比高等优点。

在菌株活化后还需要进行离心操作来收集菌株，离心的转速为6000rpm，时间为20mi n，将离心操作得到的下层沉积物(菌种)进行接种。

待上述发酵过程结束后(糖度不再变化或者变化很小，本领域技术人员能够依据常规技术进行判定)，进行过滤除菌，得到最终成品果酒。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种通过两株经过筛选得到的特定非酿酒酵母菌株的混合发酵方法，一方面相比现有单独非酿酒酵母发酵显著提高了发酵能力，提高了酒精的产率，有利于减少发酵过程中出现染菌的概率从而降低了损失，另一方面有效避免了传统商业酿酒酵母单独发酵导致的酒体香气不足、滋味酸涩的问题，此外，也弥补了传统商业酿酒酵母与非酿酒酵母顺序发酵时存在维生素C、乳酸、橙皮素和川陈皮素含量较低的问题，进一步提高了果酒的口感和保健效果，提高了南丰蜜桔果汁的附加利用价值，改善了南丰蜜桔上市供大于求带来的滞销问题。

附图说明

图1所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中乙醇含量示意图；

图2所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒抗氧化活性示意图；

图3所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中维生素C含量示意图；

图4所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中乳酸含量示意图；

图5所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中橙皮素含量示意图；

图6所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中川陈皮素含量示意图；

图7所示为不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中挥发性香气化合物含量示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

采用两株非酿酒酵母混合发酵南丰蜜桔果汁，发酵方式分别包括：Hanseniasporaguillie rmondii-Hanseniaspora thailandica顺序发酵，Hanseniasporaguilliermondii:Candida ethanolic a(购自明舟生物科技有限公司)1:1混合发酵、Hanseniaspora guilliermondii:Hanseniaspor a thailandica1:1混合发酵和Hanseniaspora guilliermondii:Hanseniaspora thailandica1:100混合发酵，Hanseniaspora guilliermondii和Hanseniaspora thailandica工艺步骤包括：

(1)南丰蜜桔果汁配制：对南丰蜜桔果汁进行抑菌和澄清操作，抑菌操作为向南丰蜜桔果汁中添加食品级焦亚硫酸钠，使南丰蜜桔果汁中有效SO

(2)接种发酵：将活化后的两株非酿酒酵母离心后按不同混合发酵方式接种到步骤(1)得到的南丰蜜桔果汁中进行混合发酵，发酵的条件为：温度为28℃左右，通气频率为2次/d；发酵期间，每天监测糖度和酒精度；其中，菌种活化的方法为：取超低温保存的非酿酒酵母菌株分别接种于YPD液体培养基中，于28℃培养至对数生长后期，再将活化一代后的菌液接种于YPD液体培养基中于28℃培养至对数生长后期，制成种子液备用；其中，YPD培养基的配制方式如下：取10g蛋白胨、5g酵母浸粉、20g葡萄糖与1L水混合均匀后，在温度为121℃下灭菌30min；离心时，转速均为6000rpm，时间为20min；离心后，将得到的下层沉积物进行接种；

(3)成品制取：当糖度不再变化时结束发酵，过滤除菌后得到南丰蜜桔果酒，过滤除菌的方法为无菌膜过滤，测定南丰蜜桔果酒中总酸、还原糖、色度、有机酸等理化指标。

对比例1：

与实施例1不同之处在于：单独采用酿酒酵母菌株CICC 1750、单独采用非酿酒酵母(Hanseniaspora guilliermondii)、单独采用非酿酒酵母(Hanseniasporathailandica)、H.guillier mondii与商业酿酒酵母(CICC 1750，购自安琪酵母有限公司)顺序混合发酵，分别作为发酵菌种进行单菌株发酵，包括以下步骤：

(1)南丰蜜桔果汁配制：对南丰蜜桔果汁进行抑菌和澄清操作，抑菌操作为向南丰蜜桔果汁中添加食品级焦亚硫酸钠，使南丰蜜桔果汁中有效SO

(2)接种发酵：将活化后的两株非酿酒酵母离心后按不同混合发酵方式接种到步骤(1)得到的南丰蜜桔果汁中进行混合发酵，发酵的条件为：温度为28℃左右，通气频率为2次/d；发酵期间，每天监测糖度和酒精度；其中，菌种活化的方法为：取超低温保存的非酿酒酵母菌株分别接种于YPD液体培养基中，于28℃培养至对数生长后期，再将活化一代后的菌液接种于YPD液体培养基中于28℃培养至对数生长后期，制成种子液备用；其中，YPD培养基的配制方式如下：取10g蛋白胨、5g酵母浸粉、20g葡萄糖与1L水混合均匀后，在温度为121℃下灭菌30min；离心时，转速均为6000rpm，时间为20min；离心后，将得到的下层沉积物进行接种；

(3)成品制取：当糖度不再变化时结束发酵，过滤除菌后得到南丰蜜桔果酒，过滤除菌的方法为无菌膜过滤，测定南丰蜜桔果酒中总酸、还原糖、色度、有机酸等理化指标。

实施例2：

为了进一步说明本发明能够达到所述技术效果，对实施例1和对比例1方法制得的南丰蜜桔果酒进行理化指标检测，所有表和图中接种酿酒酵母或非酿酒酵母的酒样分别以Sc、Hg和Ht代称，H.guilliermondii与C.ethanolica 1:1混合发酵的酒样以Hg:Ce(1:1)代称，H.gu illiermondii与H.thailandica 1:1混合发酵的酒样以Hg:Ht(1:1)代称，H.guilliermondii与H.thailandica 1:100混合发酵的酒样以Hg:Ht(1:100)代称，H.guilliermondii与H.thailandica顺序混合发酵的酒样以Hg-Ht代称，H.guilliermondii与商业酿酒酵母顺序混合发酵的酒样以Hg-Sc代称。

一、不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒中乙醇含量：

酒精度的测定使用手持折光仪进行测定。测定结果如图1所示，实施例1最终制备的酒样的酒精度与传统的商业酿酒酵母及商业酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵类似，均显著高于非酿酒酵母单菌株发酵和非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

对比可知，本发明提供的方法，有效的促进了酒样中乙醇发酵效率，显著的提高了酒精的最终转化率，酒精浓度的最终产率高，有利于减少发酵过程中出现染菌的概率，减少了染菌造成的损失，具有一定的经济价值。

二、不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒抗氧化活性：

抗氧化活性采用ABTS自由基清除法测定。具体如下将ABTS(7.0mM，10mL)溶液与过硫酸钾(140mM，176μL)混合，室温黑暗孵育14h。用适量乙醇稀释混合后的ABT S溶液，使其在734nm处的吸光度达到0.70±0.02。使用无水乙醇将样品稀释至适宜浓度后，取200μL样品稀释液加入3.8mL混合后的ABTS溶液中，室温孵育6min后，在734nm处测定吸光度。每个样品平行测定3次。ABTS自由基的清除率计算公式为：ABTS自由基清除率(％)＝(1-AS/Ab)×100％；其中，AS为样品吸光度，Ab为空白吸光度。

结果如图2所示，对比可知，本发明提供的方法，有效的提升了果酒抗氧化活性，有利于提高果酒的保健效果，具有一定的经济价值。Hg:Ht-1:1混合发酵(60.39％±0.01)的南丰蜜桔果酒ABTS自由基的清除率最高，显著高于传统商业酿酒酵母Sc、非酿酒酵母的单发酵及非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

三、不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒维生素C含量：

采用Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)对南丰蜜桔果酒中的维生素C进行HPLC分析。以0.025％三氟乙酸溶液/甲醇(95:5，V/V)为流动相。流速为0.8mL/mi n，检测波长210nm，进样量10μL。以不同浓度梯度的维生素C标准品建立标准曲线，使用外标法对南丰蜜桔果酒中维生素C进行定量。

结果如图3所示，对比可知，本发明提供的方法，有效的提升了果酒维生素C含量，有利于提高果酒的保健效果，具有一定的经济价值。Hg:Ht-1:1混合发酵(149.36±6.50mg/L)的南丰蜜桔果酒维生素C含量最高，显著高于传统商业酿酒酵母Sc、非酿酒酵母的单发酵及非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

四、不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒乳酸含量：

采用Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)对南丰蜜桔果酒中的乳酸进行HPLC分析。以0.025％三氟乙酸溶液/甲醇(95:5，V/V)为流动相。流速为0.8mL/min，检测波长210nm，进样量10μL。以不同浓度梯度的乳酸标准品建立标准曲线，使用外标法对南丰蜜桔果酒中乳酸进行定量。

结果如图4所示，对比可知，本发明提供的方法，有效的提升了果酒乳酸含量，有利于提高果酒的口感，具有一定的经济价值。Hg:Ht-1:1混合发酵(8111.94±108.67mg/L)的南丰蜜桔果酒乳酸含量最高，显著高于传统商业酿酒酵母Sc、非酿酒酵母的单发酵及非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

五、不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒橙皮素含量：

采用Aglient Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)检测南丰蜜桔果酒中橙皮素的含量。HPLC设置流速为1.0mL/min的梯度洗脱程序。柱温30℃，定量波长为283nm和330nm，扫描波长范围为200-400nm，进样量10μL。保留时间定性，外标法定量。在283nm处分析橙皮素。

结果如图5所示，对比可知，本发明提供的方法，有效的提升了果酒橙皮素含量，有利于提高果酒的保健功效，具有一定的经济价值。Hg:Ht-1:1混合发酵(3.52±0.13mg/L)的南丰蜜桔果酒橙皮素含量最高，显著高于传统商业酿酒酵母Sc、非酿酒酵母的单发酵及非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

六、不同菌株及发酵方式发酵南丰蜜桔果酒川陈皮素含量：

采用Aglient Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)检测南丰蜜桔果酒中川陈皮素的含量。HPLC设置流速为1.0mL/min的梯度洗脱程序，柱温30℃，定量波长为283nm和330nm，扫描波长范围为200-400nm，进样量10μL。保留时间定性，外标法定量。在283nm处分析川陈皮素。

结果如图6所示，对比可知，本发明提供的方法，有效的提升了果酒川陈皮素含量，有利于提高果酒的保健功效，具有一定的经济价值。Hg:Ht-1:1混合发酵(0.98±0.02mg/L)的南丰蜜桔果酒川陈皮素含量最高，显著高于传统商业酿酒酵母Sc、非酿酒酵母的单发酵及非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

七、南丰蜜桔果酒中挥发性香气化合物含量分析：

采用HS-SPME-GC-MS分析南丰蜜桔果酒的挥发性香气成分。准确吸取5mL南丰蜜桔果酒样品于20mL顶空萃取瓶中，加入1.5g NaCl，加入5μL的10mg/mL环己酮溶液作为内标。40℃平衡20min后，将老化后的DVB/CAR/PDMS萃取头(Supelco，Bellefonte PA，SA)插入萃取瓶，推出纤维头置于样液上方2cm处，并置于40℃吸附52min，样品在平衡和吸附过程中用磁力搅拌器以750rpm轻轻涡旋，随后迅速将萃取头取出并插入气质联用仪进样口，在250℃上机解吸3min，同时启动气质联用仪采集数据。GC条件：毛细管柱为HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1.2mL/min，分流比为5:1。程序升温：40℃下保留2min，升温至180℃(4℃/min)，保留2min，升温至250℃(10℃/min)；检测器和离子源温度分别调至250℃和200℃；电子能量70eV；质量扫描范围30-500amu。

结果如图7所示，对比可知，本发明提供的方法，有效的提升了果酒挥发性香气化合物含量，有利于提高果酒的感官品质，具有一定的经济价值。Hg:Ht-1:1混合发酵(588.42±4.3mg/L)的南丰蜜桔果酒挥发性香气化合物含量最高，显著高于传统商业酿酒酵母Sc、非酿酒酵母的单发酵及非酿酒酵母其他混合方式发酵果酒样品。

综上，本发明提供的实施例1以南丰蜜桔果汁为原料，采用非酿酒酵母混合发酵方法进行南丰蜜桔果酒的酿造，得到了一种维生素C、乳酸、橙皮素、川陈皮素及挥发性香气化合物含量高的优质南丰蜜桔果酒，具有生物活性成分含量高、香气丰富突出、滋味协调醇厚特点，本发明的发酵方法简单易操作，充分发挥了非酿酒酵母降糖、转化有机酸的能力以及非酿酒酵母协同发酵的能力，一方面酒精的最终转化率高，有利于减少发酵过程中出现染菌的概率，减少了染菌造成的损失；另一方面有效避免了单株非酿酒酵母发酵带来发酵能力弱，难以用于生产；同时克服了传统商业酿酒酵母发酵导致酒体香气不足、滋味酸涩的问题；也弥补了传统商业酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵维生素C、乳酸、橙皮素和川陈皮素含量较低，影响了果酒的保健和口感的缺陷，提高了南丰蜜桔果汁的附加利用价值，改善了南丰蜜桔上市供大于求带来的滞销问题，具有一定的经济价值。

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。