通过靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料制备技术领域，具体提供一种通过靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗制备方法。

背景技术

随着肿瘤免疫学的发展，肿瘤免疫疗法逐渐成为一种有效肿瘤治疗方法。肿瘤免疫疗法通过调控自身免疫系统，增强机体的细胞免疫，体液免疫从而增强机体的免疫力，达到对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。其中肿瘤纳米疫苗起到桥梁作用。

肿瘤纳米疫苗能够刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，诱导特异性T细胞杀死肿瘤细胞，并产生长期的免疫记忆，防止肿瘤细胞的复发。其发挥作用的方式是通过携带抗原和佐剂，将抗原和佐剂安全的输送到抗原递呈细胞(APC)周围，降低单独使用抗原被机体降解的风险。并且纳米疫苗更容易被APC细胞摄取和内吞。围绕肿瘤纳米载体设计的疫苗特点各不相同。如环境响应性；靶向树突状细胞；能够靶向淋巴结。这些纳米疫苗最终目的都是提高机体特异性免疫能力，起到对肿瘤的预防和治疗作用。但是这些纳米疫苗会因为易脱靶导致激活机体免疫力的能力降低。能够靶向APC的纳米疫苗研究不断深入。树突状细胞(DCs)是APC主要的抗原递呈细胞，考虑到通过皮下注射的方式，释放纳米疫苗，而皮下的APC也是以树突状细胞为主，能够靶向DCs就能够更有效的促进DCs对纳米疫苗的摄取。

金属多酚网络(MPN)是通过金属离子和多酚结构配位形成的超分子网络结构。MPN能够以快速、简单的方式来构建多功能纳米平台，同时还拥有良好的生物相容性。作为一种由金属离子和多酚自组装而成的新型纳米材料，被持续深入的研究。具有pH和还原双重响应的MPN，可用于抗肿瘤免疫治疗。利用溶媒体内的酸性环境和还原性谷胱甘肽可以使金属多酚网络分解，释放携带抗原，激活机体特异性抗肿瘤免疫，展现了MPN这种纳米材料的优势。

甘露糖是一种单糖，是多种多糖的组成成分，以游离状态存在于某些植物果皮中。甘露糖在临床上的应用，广泛分布于体液和组织中，尤其在神经、皮肤被直接利用合成糖蛋白，参与免疫调节，起到调节免疫系统、靶向APC、抗发炎以及抑制肿瘤生长和转移的作用，增加癌症存活率。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种通过靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗制备方法，本发明方法通过被邻苯二酚修饰的八臂聚乙二醇与Fe离子配位，连接甘露糖的金属多酚网络包裹佐剂和抗原，使甘露糖能够靶向树突细胞上的甘露糖受体，提高树突细胞的激活率，从而提高激活T淋巴细胞的能力。

为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

一方面，本发明提供一种通过靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)做溶剂，将甘露糖聚乙二醇氨基、三乙胺和八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG)反应半小时，再和盐酸多巴胺反应，在氮气保护下搅拌反应6小时。透析后冻干得到连有甘露糖的并有邻苯二酚修饰的八臂聚乙二醇。

(2)将步骤(1)得到的连接有甘露糖并被邻苯二酚修饰的八臂聚乙二醇分散在水中，然后加入鸡卵清蛋白(OVA)溶液、FeCl

进一步的，步骤(1)中，PEG和盐酸多巴胺、甘露糖聚乙二醇氨基以及三乙胺(以PEG的量计算)的物质量比为1～2:12～14:2～3:15～16。

进一步的，所述步骤(1)中，所述溶剂为有机溶剂，例如DMF等。

进一步的，所述步骤(1)中，三乙胺、连有甘露糖聚乙二醇氨基和八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG)在气体保护下搅拌反应0.5～1h，加入盐酸多巴胺后继续在气体保护下搅拌反应6～7h。所述保护气体可以是氮气或惰性气体。

进一步的，所述步骤(1)中，所述八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG)从市场上购买得到，其中八臂PEG的分子量为10000～20000。

进一步的，步骤(1)中，反应后的产物经透析、冻干后得到连接有甘露糖并有邻苯二酚修饰的八臂PEG。采用pH为4-5的水进行透析，透析时间一般为48～60h，以除去小分子杂质，透析后进行冻干，得连接有甘露糖并被邻苯二酚修饰的八臂PEG。

进一步的，步骤(2)中，连接有甘露糖并被邻苯二酚修饰的八臂PEG、OVA、CpG和FeCl

进一步的，步骤(2)中，Tris-HCl缓冲液的pH为8.5-9，量浓度为0.20～0.25M。

进一步的，步骤(2)中，将连接有甘露糖并被邻苯二酚修饰的PEG、OVA溶液、FeCl

进一步的，步骤(2)中，反应0.5-1h。

另一方面，本发明提供一种上述方法制备的纳米疫苗。

基于MPN，多酚结构对各种表面有高亲和力，与金属离子络合后能够发挥金属和多酚的协同效应，且制作方法简单，能够大量制作，生物相容性好。加入抗原、非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)、甘露糖以后成功制备形成靶向树突状细胞的纳米疫苗。形成的纳米疫苗利于递送抗原和佐剂到APC，连接的甘露糖所起到的作用在于和APC中的树突状细胞表面甘露糖受体结合，起到靶向的作用，提高到达靶细胞的效率，同时也有利于在淋巴结的富集。树突状细胞抗原交叉递呈的机会增多，激活特异性CTLs(细胞毒性T淋巴细胞)的能力也将增强，从而对肿瘤细胞造成特异性杀伤作用。CpG能够辅助增强机体的抗肿瘤免疫力。选用鸡卵清蛋白目的是防止免疫原性低的抗原不能激发机体对其的应答。所形成的纳米疫苗不仅具有质子海绵效用同时具有靶向作用。对于增强树突状细胞的抗原交叉递呈和诱发细胞免疫有很好的作用，从而起到抗癌作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用甘露糖和树突状细胞表面甘露糖受体结合的功能，设计一款能够靶向树突状细胞的纳米疫苗。本发明所得纳米疫苗能够靶向树突细胞具有很好的体内长期稳定性和生物相容性，能够改善抗原靶向递送效率和交叉呈递效率低下的问题，能够引起机体细胞免疫的激活，提高机体抗肿瘤的能力，对肿瘤具有显著的治疗和预防效果。

本发明将甘露糖连接金属多酚网络，经过简单的络合反应将抗原和佐剂携带。溶酶体中的酸性环境会破坏稳定结构，从而释放抗原，实现抗原的递呈。同时甘露糖能够和树突细胞上的凝集素结合，从而靶向树突细胞，提高抗原靶向和递呈的能力。本发明制备所得的纳米疫苗具有良好的体内靶向性，促进树突细胞对抗原的摄取和利用，从而激活T淋巴细胞，增强机体自身细胞免疫和体液免疫，从而对肿瘤产生一个治疗和预防的效果。本发明制备方法操作简便、能耗低、环境友好、易于扩大生产。

附图说明

图1是实施例1制备的一种通过靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗的制备过程；

图2是实施例1中M-MPNs@OVA@CpG(MMOC)的透射电子显微镜图片；

图3为实施例1制备的MMOC的动态激光散射图；

图4为实施例1中MMOC负载不同浓度的OVA的结果；

图5为实施例2中不同样品的UV光谱，其中(1)甘露糖聚乙二醇氨基，(2)PEG，(3)M-MPNs@OVA(MMO，连接有甘露糖的金属多酚网络并携带抗原)，(4)MPNs@OVA@CpG(MOC，金属多酚网络携带抗原和佐剂)，(5)M-MPNs@OVA@CpG(MMOC,连接有甘露糖的金属多酚网络并携带抗原和佐剂)。

图6为实施例3制备的MMOC在PBS(pH＝7.4)、PBS(pH＝5.0)和谷胱甘肽溶液中的累积释放OVA结果；

图7为实施例4中通过CCK-8测定MOC、MMO和MMOC对DC2.4细胞的体外细胞毒性评估结果。

图8为实施例5通过流式细胞术测定OVA、MOC、MMO和MMOC对DC2.4细胞的体外细胞摄取评估结果。

图9为实施例6通过流式实验，测定OVA、MOC、MMO和MMOC对骨髓来源树突状细胞的激活结果。

图10为实施例7纳米疫苗注射进入小鼠体内，测定OVA、MOC、MMO和MMOC对小鼠的免疫激活情况。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。

实施例及对比例中所用试剂及材料，如无特殊说明，均可经过商业途径得到。其中，所用八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG)购自键凯科技有限公司(北京)，分子量为20000。

文中各缩写含义如下：MMO为M-MPNs@OVA的缩写，是连接有甘露糖的金属多酚网络并携带抗原；MOC为MPNs@OVA@CpG的缩写，是金属多酚网络携带抗原和佐剂；MMOC为M-MPNs@OVA@CpG的缩写，是连接有甘露糖的金属多酚网络并携带抗原和佐剂。

本发明提供一种基于甘露糖介导金属多酚网络靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗及制备方法。具体实施例如下。

实施例1

通过靶向树突细胞增强机体抗肿瘤免疫力的纳米疫苗制备方法如图1所示，具体步骤如下：

连接有甘露糖并被邻苯二酚修饰的八臂PEG的制备：将N,N-二甲基甲酰胺做溶剂用5mL，将甘露糖聚乙二醇氨基(15mg，0.0075mmol)、三乙胺(28μL，0.19mmol)和八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG)(100mg，0.005mmol，分子量20000)添加至溶剂中反应半小时，再添加盐酸多巴胺(11.34mg，0.006mmol)反应，在氮气的保护下反应8小时。反应后，将混合物在pH为4-5的水中透析48小时，将小分子杂质去掉，透析后冻干，获得带有甘露糖并被邻苯二酚修饰的八臂PEG。

金属酚醛网络封装MMOC的制备：将上述的连接有甘露糖并被邻苯二酚修饰的八臂PEG(20μL，50mg/mL)溶液加入5mL样品瓶中，然后加入卵清蛋白溶液(500μL，0.8mg/mL)，搅拌均匀后加入FeCl

图2为MMOC的透射电子显微镜图片，从图中可以看出，纳米疫苗MMOC的粒径约为50nm。图3为MMOC的动态激光散射结果，从图中可以看出，MMOC具有平均100nm的流体动力学粒径和相对窄的粒径分布，透射电镜结果小的原因是：颗粒在溶液里面会膨胀开，拍透射电镜会把纳米疫苗给做成干粉，所以体积会减小。所得到的纳米材料具有较小的粒径尺寸，能够被细胞摄取。图4为合成MMOC过程中，把OVA的投入量设置为100μg、200μg、300μg、400μg和500μg。合成材料以后用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，测量上清液中OVA的含量。选出最佳的负载量。从图中可以看出在投入量为400μg时，负载量是最高的。

实施例2

用傅里叶红外光谱探究不同的材料在红外中的结构。

其中，MMO的制备方法为：将Tris-HCl缓冲液溶解的非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸替换为等量的Tris-HCl缓冲液，其余条件与实施例1相同。

MOC的制备方法为：省略甘露糖聚乙二醇氨基，其余条件与实施例相同。

图5为(1)PEG，(2)甘露糖聚乙二醇氨基，(3)MOC，(4)MMO和(5)MMOC的FT-IR光谱，从图中可以看出，MOC、MMO和MMOC在1625cm

实施例3MMOC体外OVA释放行为研究

为了研究MMOC在不同介质中的OVA释放行为，取适量实施例1制备得到沉淀MMOC，将其分散到A、B、C、D四个溶液里，使每个溶液里面MMOC的浓度为1mg/ml，其中A：1000μL含有谷胱甘肽的PBS溶液(谷胱甘肽的浓度10mM，pH＝7.4)、B：1000μL PBS(pH＝7.4)、C：1000μLPBS(pH＝5)和D：1000μL含有还原性谷胱甘肽的PBS溶液(谷胱甘肽的浓度10mM，pH＝5)，并在37℃下搅拌。在不同时间点各取100μL进行离心(21000rpm，20min)，然后从这些悬浮液中提取上清液进行检测，每次离心均采用相同的操作。通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒分析不同时间段所得上清液，以对释放的OVA进行定量。

图6为MMOC在PBS(pH＝7.4)、PBS(pH＝5.0)和谷胱甘肽溶液中的体外累积释放OVA能力图。如图6所示，相比pH＝5.0和pH＝7.4体外环境下，pH＝5+谷胱甘肽释放OVA的速度最快，原因是还原性谷胱甘肽能够破坏MMOC的金属多酚网络结构，使其包裹的OVA暴露出来。另外，相比pH＝7.4，MMOC在pH＝5.0的PBS中释放OVA速度更快，原因是酸性条件可以打破铁离子和多酚形成的配位键的平衡。以上结果表明，MMOC具有在还原性胞质溶胶或酸性溶酶体中释放OVA的能力。

实施例4MMOC体外细胞毒性评估

首先，将DC2.4细胞以每孔6000个细胞的密度在96孔板中孵育24小时。然后MMOC，MOC，MMO按照(31.25、62.5、125、250、500μg/mL)5种材料浓度，分散在1640基础培养基中，然后添加到对应的96孔板中，形成浓度梯度。将96孔板在细胞培养箱中放置24小时后，使用标准CCK-8分析法测定细胞活力。

图7为通过CCK-8分析法测定的MMOC、MOC和MMO对DC2.4细胞的体外细胞毒性评估结果。如图7所示，在31.25～250μg/mL浓度下，MMOC、MOC和MMO对DC2.4细胞没有表现出明显的细胞毒性，当浓度为500μg/mL时，MOC则表现出明显的死亡率，可能的原因是材料浓度过高引起的渗透压变化，这表明MMOC、MOC、MMO在一定浓度下对细胞的安全性良好。证明MMOC具有良好的生物相容性和生物安全性。

实施例5MMOC、MOC、MMO体外细胞摄取

取生长状态好的DC2.4细胞，消化重悬并计数，然后以2×10

其中，M-MPNs@OVA-FITC@CpG、MPNs@OVA-FITC@CpG和M-MPNs@OVA-FITC的制备是将OVA替换为等量的OVA-FITC得到的。

图8为通过流式细胞术测定PBS(pH＝7.4，0.01M)、OVA-FITC、M-MPNs@OVA-FITC@CpG、MPNs@OVA-FITC@CpG、M-MPNs@OVA-FITC。从图中可知，OVA-FITC组比PBS组的相对摄取率高22.03％，MPNs@OVA-FITC@CpG、M-MPNs@OVA-FITC组比PBS组高45.96％和59.9％。M-MPNs@OVA-FITC@CpG相比较PBS组，呈现最高的摄取率，为63.16％。这体现出这种材料更利于细胞的摄取，原因可能是M-MPNs@OVA-FITC@CpG的靶向作用和更小的粒径大小增加了DC2.4对的摄取率，APC对抗原的递呈是免疫应答中非常重要的过程，APC对纳米材料的摄取是免疫应答的前提，树突状细胞作为主要的APC，摄取程度的大小也正面反应了免疫应答水平的高低。

实施例6MMOC、MOC、MMO体外树突细胞激活

把6～8周的小鼠，取一只安乐死，解剖取其胫骨和股骨，收集细胞。加入8ml的PBS(pH＝7.4，0.01M)缓冲溶液，离心1200rpm，4分钟。将细胞吹匀，将细胞铺入24孔板，每个孔80万个细胞，补足每个孔1640完全培养基1ml，含有GM-CSF(集落生长因子20ng/ml)和IL-4(白细胞介素410ng/ml)。铺板记为第0天。第2天吸取500μL的上清液，再补足培养液。第4天吸出3/4的上清液，补足含有集落生长因子和白细胞介素的1640完全培养基。第6天吸取贴壁疏松的未成熟的树突细胞，在1500rpm，5分钟离心。按照浓度每个孔20万细胞，铺在12孔板上培养。准备5个组：PBS、OVA、MOC、MMO和MMOC。按照每个组含有10μg/ml的OVA量来加入材料，一个组做三个孔，纳米疫苗用1640完全培养基来溶解。孵育16个小时。

收集细胞测量BMDC的激活情况：收集到细胞用PBS(pH＝7.4，0.01M)缓冲溶液清洗一次，依次用CD11C-FITC(带绿色荧光的抗体)、CD86-APC(标记红色的抗体)、CD80-Cy5.5(标记黄色的抗体)进行浸染30分钟。避光，4℃进行。染好以后1200rpm，5分钟离心，去除上清液，再加700μl的PBS重悬，用于流式测定。

图9可以看出与PBS组、OVA、MOC、MMO相比，MMOC组表现出显著的差异，说明制备的MMOC材料能够很好刺激未成熟的树突状细胞转变为成熟树突状细胞。侧面反应了制备的纳米疫苗能够很好的刺激机体产生细胞免疫。

实施例7MMOC、MOC、MMO小鼠免疫实验

把6～8周，重量为18g左右的C57雌鼠，分成5个组，分别用PBS、OVA、MOC、MMO、MMOC处理。具体的：每个组5只老鼠，老鼠先喂养一周。把小鼠右后侧背部的毛给剃掉，给小鼠注射疫苗，MOC组注射合成好的MOC纳米疫苗，制备好的MOC纳米疫苗携带有OVA和CpG，按照每只老鼠30μg的OVA和6μg的CpG的量来注射MOC纳米疫苗。MMOC组注射合成好的MMOC纳米疫苗，制备好的MMOC纳米疫苗携带有OVA和CpG，按照每只老鼠30μg的OVA和6μg的CpG的量来注射MMOC纳米疫苗。MMO组注射合成好的MMO纳米疫苗，制备好的MMO纳米疫苗只携带有OVA，按照每只老鼠30μg的OVA量来注射MMO纳米疫苗。OVA组的老鼠直接注射OVA，按照每只老鼠30μg OVA的量来计算，PBS组的老鼠不做任何处理。疫苗连续打3次，每次间隔7天。在纳米疫苗最后一次注射的7天后停止实验。取小鼠的脾，研磨收取细胞。收集到细胞用PBS缓冲溶液清洗一次，依次用CD3-Cy5.5(带黄色荧光的抗体)、CD8-PE(标记红色的抗体)、Tetramer-FITC(标记绿色的抗体)进行浸染30分钟。避光，4℃进行。染好以后1200rpm，5分钟离心，去除上清液，再加700μl的PBS重悬，用于流式测定。

图10可以看出MOC、MMO、MMOC组和PBS组相比，都表现出了显著的差异，体现制备的材料能够在小鼠体内更好的激活细胞毒性T细胞，增加对肿瘤的杀伤。同时，MMOC组与MOC组和MMO组相比，也表现出了显著差异，证明我们所制备的这款纳米疫苗能够很好的靶向树突细胞，从而激活细胞毒性T细胞，增强细胞免疫的能力。

综上可知，本发明通过八臂聚乙二醇多酚与Fe离子配位，连接甘露糖的金属多酚网络包裹佐剂和抗原，使甘露糖能够靶向树突细胞上的甘露糖受体，提高树突细胞的激活率，从而提高激活T淋巴细胞的能力，且制作方法简单，生物相容性好。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。