一种异丙托溴铵中杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种异丙托溴铵中杂质的检测方法。

背景技术

异丙托溴铵为抗胆碱类药，对支气管平滑肌具有较好的平滑作用，对慢性阻塞性肺部疾病具有平喘作用，异丙托溴铵起效快，药效持续时间长。异丙托溴铵具有控制黏液腺体的分泌及改善纤毛运动的作用，可减少痰液阻塞以改善通气，痰液的减少还减轻了由于支气管的刺激所引起的支气管痉挛。异丙托溴铵还可用于防治支气管哮喘和哮喘型慢性支气管炎，尤适用于因用β受体激动剂产生肌肉震颤，心动过速而不能耐受此类药物的患者。

异丙托溴铵由异丙基托品醇甲磺酸盐合成。而在合成异丙基托品醇甲磺酸盐过程中，异丙基托品醇和甲磺酸会产生酯化反应，产生甲磺酸异丙基托品酯(英文名称：8-Isopropyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-yl methanesulfonate)，结构式如式I。按照ICHM7指导原则，异丙托溴铵原料中甲磺酸异丙基托品酯的可接受限度＝TTC(μg/天)×1000/MDD(mg/天)＝1.5μg/天×1000/20mg/天＝75.0ppm(ng/mg)，其中TTC表示毒理学关注阈值，MDD表示最大每日剂量。

目前，尚未发现能够满足该要求的关于异丙托溴铵原料中甲磺酸异丙基托品酯的检测方法的报道。因此，本领域需要提供一种能够准确检测异丙托溴铵原料甲磺酸异丙基托品酯的检测方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种甲磺酸异丙基托品酯的液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK MGⅡC18(4.6mm*150mm,5um)。

流动相：以含0.05％～0.20％甲酸的水溶液为流动相A，以含0.05％～0.20％甲酸的甲醇为流动相B。

总流速：0.9～1.1mL/min。

柱温：27～33℃。

进样体积：10μL。

梯度洗脱程序如表1：

表1梯度洗脱程序

质谱条件

采用ESI离子源，使用正离子扫描模式，检测模式为多反应检测(MRM)；气帘气体(CUR)为30～40；碰撞气(CAD)为Medium；去簇电压(DP)为40～60V；射入电压(EP)为5～15；碰撞室射出电压(CXP)为5～15volts；离子化电压(IS)为4500～5500；离子源气体1(GS1)为50～60psi；辅助加热气(GS2)为50～60psi离子化温度(TEM)为500～600℃，化合物的检测离子对以及最佳碰撞电压(CE)见表2：

表2检测离子对以及碰撞电压

上述色谱条件的选择能使甲磺酸异丙基托品酯更好的分离，排除其他物质的干扰。上述质谱条件的选择，尤其是离子对与碰撞电压的选择，使甲磺酸异丙基托品酯能够被精确的检测。

优选的，以含0.1％甲酸的水溶液为流动相A，以含0.1％甲酸的甲醇为流动相B。

优选的，所述总流速设置为1.0mL/min。

优选的，所述柱温设置为30℃。

优选的，所述气帘气体(CUR)为35。

优选的，所述去簇电压(DP)为50V。

优选的，所述离子化电压(IS)为5000

优选的，所述离子化温度(TEM)为550℃。

上述优选的检测条件能够使检测峰的响应强度更大，利于甲磺酸异丙基托品酯的检出，同时可有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。

本发明提供了甲磺酸异丙基托品酯的液相色谱-质谱法(HPLC-MS)检测方法。本方法专属性强，灵敏度高，准确可靠，线性关系良好，同时具有良好的精密度和耐用性，各项方法验证均能符合要求，适用于异丙托溴铵原料中甲磺酸异丙基托品酯的痕量检测，可作为其质量监控的依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中空白溶液质谱图；

图2为本发明实施例1中对照品溶液液相质谱图；

图3为本发明实施例1中供试品溶液液相质谱图；

图4为本发明实施例1中甲磺酸异丙基托品酯线性试验；

图5为本发明对比例1中更换色谱柱后对照品溶液液相质谱图；

图6为本发明对比例2种更换流动相后对照品溶液液相质谱图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

空白溶液：水。

对照品贮备液：取甲磺酸异丙基托品酯适量，精密称定，先用甲醇溶解，再用水稀释制成每1mL中约含甲磺酸异丙基托品酯150ng的溶液的对照贮备液。

对照品溶液：精密移取对照品贮备液0.5ml置10mL容量瓶，加水稀释至刻度，作为对照品溶液。

供试品溶液配制：取供试品约20mg，精密称定，置10mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，再取出0.5ml置10mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。

色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK MGⅡC18(4.6mm*150mm,5um)。

流动相：以含0.1％甲酸的水溶液为流动相A，以0.10％甲酸的甲醇为流动相B。

总流速：1.0mL/min。

柱温：30℃。

进样体积：10μL。

梯度洗脱程序如下表：

质谱条件

采用ESI离子源，使用正离子扫描模式，检测模式为多反应检测(MRM)；气帘气体(CUR)为35；碰撞气(CAD)为Medium；去簇电压(DP)为50V；射入电压(EP)为10；碰撞室射出电压(CXP)为10volts；离子化电压(IS)为5000；离子源气体1(GS1)为55psi；辅助加热气(GS2)为55psi离子化温度(TEM)为550℃，碰撞电压(CE)为20，化合物的检测离子对为248.2m/z和152.2m/z。

方法学验证：

①专属性

取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，在拟定的方法条件下，进行HPLC-MS检测，记录谱图。检测结果见质谱图见图1-3。

检测结果显示：空白溶液及供试品对甲磺酸异丙基托品酯检测无干扰，专属性良好。

②定量限、检测限

检测限：取对照品溶液，用水逐级定量稀释，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，结果见表3。

定量限：取对照品溶液，用水逐级定量稀释，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图，按信噪比不低于10:1，得到定量限，结果见表3。平行制备定量限溶液6份，进行HPLC-MS检测，记录谱图，观察定量限精密度，结果见表4。

结果显示，检测限、定量限均能满足检测要求。

表3检测限、定量限检测结果

表4定量限重复性检测结果

③线性

取甲磺酸异丙基托品酯适量，精密称定，分别配制一系列浓度的线性溶液。取各线性溶液，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图。以甲磺酸异丙基托品酯浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表5和图4。检测结果表明，甲磺酸异丙基托品酯在0.37～14.98ng/mL的浓度范围内线性关系良好。

表5甲磺酸异丙基托品酯线性试验

④重复性

取供试品溶液，重复制备6份，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图。检测结果见表6。

检测结果显示，重复测定6份供试品溶液，均未检出，本方法重复性良好。

表6甲磺酸异丙基托品酯重复性试验结果

⑤准确度

甲磺酸异丙基托品酯的准确度实验以回收率(％)表示。

80％限度回收率溶液：取供试品约20mg，精密称定，置10mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，再取出0.5ml置10mL容量瓶，加贮备液0.4ml，加水溶解并稀释至刻度，作为低回收率溶液，平行制备三份。

100％限度回收率溶液：取供试品约20mg，精密称定，置10mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，再取出0.5ml置10mL容量瓶，加贮备液0.5ml，加水溶解并稀释至刻度，作为中回收率溶液，平行制备三份。

160％限度回收率溶液：取供试品约20mg，精密称定，置10mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，再取出0.5ml置10mL容量瓶，加贮备液0.8ml，加水溶解并稀释至刻度，作为高回收率溶液，平行制备三份。

取对照品溶液和各组回收率溶液，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图。回收率结果见表7。

回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量×100％

表7甲磺酸异丙基托品酯回收率检测结果

结果显示，甲磺酸异丙基托品酯在80％-160％限度浓度范围内，回收率在91.85～94.79％之间，方法准确度良好。

⑥精密度

取对照品溶液，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，连续6次，记录谱图。检测结果见表8。

结果显示，连续检测6次，对照液甲磺酸异丙基托品酯的峰面积RSD均≤10％，本方法精密度良好。

表8精密度实验结果

⑦耐用性

取对照品溶液，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图。通过微调色谱条件：柱流量1.1mL/min和0.9mL/min，柱温33℃和27℃，梯度中B相最大值93％和87％。考察甲磺酸异丙基托品酯的耐用性，检测结果见表9。

结果显示，微调色谱条件对甲磺酸异丙基托品酯检测无影响，该方法耐用性良好。

表9甲磺酸异丙基托品酯耐用性试验结果

⑧中间精密度

取供试品溶液，重复制备6份，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图。该部分的检测与重复性检测日期不同，操作者不同。检测结果见表10。

结果显示，6份供试品溶液，均未检出，与重复性结果一致，本方法中间精密度性良好。

表10中间精密度试验结果

⑨稳定性

将对照溶液和供试品溶液在室温下静置，每隔0h、2h、4h、6h、8h后，按照上述检测条件进行HPLC-MS检测，记录谱图。检测结果见表11和12。

结果显示，对照品溶液、供试品溶液在8小时内稳定性良好。

表11对照品溶液稳定性试验结果

表12供试品溶液稳定性试验结果

对比例1

采用色谱柱waters C18(250*4.6mm,5μ)，其它仪器、检测条件和检测方法均与实施例1相同，最终检测结果如图5所示，对照品峰响应明显降低，检测精度无法达到实施例1的水平。

对比例2

更换流动相A相为水，B相为甲醇，其它仪器、检测条件和检测方法均与实施例1相同，最终检测结果如图6所示对照品峰响应明显降低，检测精度无法达到实施例1的水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。