羧酯酶突变体及其在(S)-3-环己烯-1-甲酸合成中的应用

技术领域

本发明涉及一种羧酯酶突变体及其在(S)-3-环己烯-1-甲酸合成中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

具有光学活性的3-环己烯-1-甲酸(CHCA)及其衍生物含有一个环己烯环，区别于环己烷、环己二烯和苯的衍生物，并显示出独特的生物活性。CHCA衍生物已被广泛地用作制药和精细化工行业的手性砌块，例如，(S)-CHCA可以用于生成(S)-3,4-二氨基环己烷羧酸，这是凝血因子Xa(fXa)抑制剂(即依度沙班)的关键手性砌块，用于治疗癌症相关的静脉血栓栓塞症，与其他抗凝剂相比具有更强的口腔吸附力和更低的出血风险。(R)-CHCA可以应用于免疫抑制剂他克莫司、神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦和抗肿瘤药(+)-叶兰霉素等的合成。因此，手性CHCA的高效和对映选择性合成具有特殊的意义。

目前手性3-环己烯-1-甲酸的合成方法主要有狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应，化学法外消旋酸拆分法和酶法不对称水解拆分3-环己烯-1-甲酸酯。其中Diels-Alder反应是目前合成手性3-环己烯-1-甲酸的主要方法，然而由于丁二烯为气体且产物为不易于分离，反应步骤繁琐，收率较低，仍然需要进一步改进(Synlett,1990,1,38–390)。化学拆分过程需要在丙酮中进行至少六次重结晶才可分离出光学纯的对映异构体，导致丙酮的大量使用，拆分收率仅20–30％，原子经济性低(Drugs&Clinic,2013,28,126–128)。由此可见，化学法合成手性3-环己烯-1-甲酸面临操作繁琐、收率较低和丙酮的大量使用等诸多问题。生物催化法合成手性化合物具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好、操作简便等优势，使其成为可持续发展过程中替代或拓展传统化学合成的重要方法。

2004年，Cihangir T等考察了猪肝酯酶PLE，马肝酯酶HLE和猪胰脂肪酶PPL水解外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的效果，PLE和HLE的水解产物为(S)-3-环己烯-1-甲酸，ee值分别为>99％和97％；PPL的水解产物为(R)-3-环己烯-1-甲酸，ee值为91％(TetrahedronAsymmetry,2004,15,2057–2060)。然而，上述酶为动物来源的商品酶，其实际应用的过程中存在：价格昂贵、同工酶干扰、批次间差异较大和引入病毒的风险等。2019年，Xiafen Wu等对大肠杆菌来源的羧酯酶BioH进行分子改造以提高其对(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2019,83,1263–1269)。通过降低空间位阻和芳香堆积作用的组合突变，获得了具有较高(S)-选择性的突变体Mu3(L24A/W81A/L209A)，其水解外消旋-3-环己烯-1-羧酸甲酯的ee值由32.3％至70.9％。进一步优化反应条件，在30℃和含有2.5％吐温80的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，Mu3可水解40mM底物，转化率是优化前的2倍。重组酶BioH虽然具有水解3-环己烯-1-甲酸甲酯的活性，但对映选择性较低。2019年，窦哲等以3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物进行野生菌的筛选，发现Acinetobacter sp.JNU9335能够选择性地水解底物生成(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，通过在碱性条件下水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。其中在50mL反应中添加了3.50g外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯，反应12h后，最终产物的收率为40％，ee

与传统化学合成法相比，生物催化制备手性环己烯甲酸的方法具有环境友好、反应条件温和、操作简单等优点，但是目前以上关于(S)-3-环己烯-1-甲酸制备方法仅限于实验室规模，且存在酶选择性较低导致产品收率低等缺陷，不适合工业化生产，并且缺乏关于重组酶合成(R)-3-环己烯-1-甲酸的报道。因此，需要筛选具有高催化效率的对映选择性互补酶，以满足工业化生产手性CHCA的需求。

发明内容

本发明针对现有技术中羧酯酶对映选择性的不足，本发明提供选择性改善和逆转的羧酯酶突变体，羧酯酶突变体基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，羧酯酶突变体的制备方法，以及羧酯酶突变体在手性3-环己烯-1-甲酸合成中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种羧酯酶突变体，所述羧酯酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶亲本的第82位异亮氨酸替换为蛋氨酸，第133位缬氨酸替换为丝氨酸，第228位酪氨酸替换为蛋氨酸，第230位缬氨酸替换为色氨酸，第253位天冬氨酸替换为丙氨酸，第257位缬氨酸替换为蛋氨酸，以及将第297位亮氨酸替换为异亮氨酸。

在本发明中，编码羧酯酶亲本的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述羧酯酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种包含所述基因的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述羧酯酶突变体的重组表达转化体。

进一步地，所述重组表达转化体是以大肠杆菌为表达宿主。

本发明的第五个目的是提供所述羧酯酶突变体或所述重组表达转化体在催化3-环己烯-1-甲酸酯不对称拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。

进一步地，催化反应体系中，3-环己烯-1-甲酸酯的浓度为150-500g/L。

进一步地，催化反应体系中，所述羧酯酶突变体或所述重组表达转化体的用量为1-20g/L。

进一步地，催化反应的温度为20-40℃。

进一步地，所述3-环己烯-1-甲酸酯为如下化合物中的一种：

本发明的有益效果是：

与其他制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的生物催化剂相比，本发明提供的羧酯酶突变体具有催化活性高、底物特异性强、催化底物范围广、立体选择性高的优点，并能够实现(S)-3-环己烯-1-甲酸的高效制备，产品收率显著高于报道水平，在工业应用中显示出广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(S)-3-环己烯-1-甲酸[(S)-3-cyclohexene-1-carboxylic acid，(S)-CHCA]，分子式：C

(R)-3-环己烯-1-甲酸[(R)-3-cyclohexene-1-carboxylic acid，(R)-CHCA]，分子式：C

实施例1：羧酯酶AcEst1的随机突变

利用易错PCR技术向羧酯酶AcEst1基因序列中引入随机碱基突变，其中所用引物如下：

上游引物(如SEQ ID No.3所示)：

5'-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGGCGTGTTGAATCAAACTT-3'

下游引物(如SEQ ID No.4所示)：

5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCATTTGGCATTCTTATCCCAAA-3'

其中模板为羧酯酶AcEst1的重组质粒pET28a-Acest1。

PCR反应的体系如下：模板0.5ng，一对突变引物(10μM)各1.5μL，8.75μL MnCl

易错PCR扩增的程序如下：(1)95℃变性3min，(2)95℃变性30s，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸1min,步骤(2)-(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，16℃保藏产物。

PCR扩增产物纯化之后，用限制性内切酶BamH I和Xho I分别对PCR扩增产物和载体质粒pET-28a于37℃双酶切12h，回收酶切产物，用T4 DNA连接酶于16℃下过夜连接，然后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50ng/mL卡那霉素的LB琼脂培养基平板上，37℃培养过夜，构建随机突变体文库。挑选单克隆至深孔板进行培养，一级板每孔中含有300μL LB培养基(含50ng/mL卡那霉素)，37℃、220rpm下培养过夜，吸取5 0μL一级种子液转接至每孔含600μL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的二级板中，37℃、220rpm培养3h，至OD600约1.0时，加入终浓度0.2mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养24h，3500rpm离心10min，弃上清，每孔加入200μL裂解液(含750mg/L溶菌酶和12mg/L DNA酶)，振荡使细胞充分悬浮，37℃保温1h，再次3500rpm离心10min，分别吸取50μL上清液至96孔酶标板，加入含5mM(R)-3-环己烯-1-甲酸乙酯或(S)-3-环己烯-1-甲酸乙酯、Tris-HCl缓冲液(100mM，pH9.0)，5mM NADP

实施例2：羧酯酶AcEst1突变体的制备

将实施例1中所筛得的重组表达转化体接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃摇床中培养12h，然后以1％(v/v)的接种量接种至装有100mL LB培养基的摇瓶中，放入37℃和180rpm摇床中培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于16℃下诱导培养16h。培养结束后，将培养液在8000rpm转速下离心收集细胞，将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述羧酯酶突变体的冻干细胞，用于环己烯甲酸酯的不对称拆分反应。

实施例3：羧酯酶突变体转化3-环己烯-1-甲酸酯的反应

反应液中包含50mM外消旋3-环己烯-1-甲酸酯、PBS(100mM，pH 8.0)和适量的各突变体冻干细胞，反应在30℃和180rpm下进行，每隔一段时间取样，手性气相色谱分析底物和产物的选择性及转化率，直至底物e.e.大于99％。

表1羧酯酶AcEst1及其突变体转化3-环己烯-1-甲酸酯的反应

其中，AcEst1

实施例4：(S)-3-环己烯-1-甲酸的酶法克级制备

将包含100mL PBS(pH 8.0，200mM)、适量的AcEst1

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。