苯酚及间苯二酚的二烯及三烯农药组合物

技术领域

本发明总体涉及一种具有杀真菌和杀细菌特性的农用化合物。

背景技术

植物害虫及植物病是现代农业生产力面临的主要挑战。土传植物病原体会对农作物造成严重损害。

植物害虫及植物病是现代农业生产力面临的主要挑战。土传植物病原体会对农作物造成严重损害。丝核菌属(Rhizoctonia)植物病原真菌属于担子菌门(Basidiomycetes)系统发育谱系，会造成一大系列在商业上具有显著影响的植物病，如褐斑病、秧苗立枯病、蔬菜作物的根腐病及腹腐病以及水稻纹枯病。植物发生的所有丝核菌病以及随后的继发感染均难以控制(埃拉赫尔(Erlacher)等人，2014年)。

腐霉属(Pythium)为植物病原真菌样生物，属于称作卵菌纲(Oomycetes)的真核微生物的系统发育谱系，其会导致大面积的烟草、番茄、芥菜、辣椒及水芹秧苗立枯病(马丁(Martin)及洛珀(Loper)，2010年)。

假单胞菌属(Pseudomonas)为一类植物病原细菌，对多种作物具有毒性，会导致严重的叶部和茎部病变。假单胞菌属会使具有重要经济价值的作物和果树发生疾病，如欧防风及番茄的髓部坏死病、水稻的褐斑病及叶鞘褐腐病、杏树的细菌性溃疡病以及橄榄树的橄榄结病(摩尔(Moore)·L·W，1988；霍夫特(Hofte)·M及德(De)·沃斯(Vos)·P，2006年)。目前为止，人们已经试验了各种控制作物体内假单胞菌属的方法，包括培养控制法、宿主抗性法、微生物拮抗剂生物控制法以及化学控制法。所有这些方法均不能实现完全控制。

由于害虫抗药性逐渐增强，气候状况变化无常以及监管压力的逐渐增大，针对上述疾病为作物提供保护的可用活性成分的种类逐年减少。为了开发在环境方面具有可持续性的新型作物保护方案，急需新的活性成分。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及一种包括至少一种式(I)所示化合物的农药组合物：

其中，

在一种实施方式中，将化合物5-8Z,11Z,14-十五碳三烯-1-基-1,3-苯二酚(强心酚三烯，CAS登录号：79473-24-8)或其农业上可接受的盐用作本发明农药组合物的活性农药成分。强心酚三烯为5位具有8-顺,11-顺-十五碳-8,11,14-三烯-1-基这一取代基的间苯二酚衍生物，分子式为下式(IA)：

在另一实施方式中，本发明涉及一种包括作为活性农药成分的化合物3-[(8Z,11Z)-十五碳-8,11,14-三烯-1-基]苯酚(腰果酚三烯，CAS登录号79353-39-2)或其农业上可接受的盐的农药组合物。腰果酚三烯为具有式(IB)所示的苯酚三烯衍生物：

在又一种实施方式中，本发明涉及一种包括作为活性农药成分的化合物5-[(8Z,11Z)-十五碳-8,11-二烯-1-基]苯-1,3-二酚(强心酚二烯，CAS登录号79473-25-9)或其农业上可接受的盐的农药组合物。强心酚二烯为5位具有8-顺,11-顺-十五碳-8,11-二烯-1-基这一取代基的间苯二酚衍生物，分子式为下式(IC)：

在另一方面中，本发明提供一种控制、预防、减少或根除在植物、植物器官、植物部位或植物繁殖材料上的植物病原体侵染症状的方法，该方法包括向植物、植物器官或植物繁殖材料，或者向所述植物周围的土壤，施用农药有效量的活性剂，该活性剂包括至少一种式(I)所示化合物，如强心酚三烯、腰果酚三烯及强心酚二烯；或包括下述实施方式当中任何一种的农药制剂，其中，所述植物病原体选自：腐霉科中的一种；伞菌纲中的一种；以及假单胞菌目中的一种。

附图说明

图1至图9所示为9项独立实验中强心酚三烯(CART)预防法对黄瓜秧苗存活状况的影响，存活状况确定为接种瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)7天后的疾病严重程度百分比。图10至图18所示为9项独立实验中强心酚三烯(CART)预防法对黄瓜秧苗存活状况的影响，存活状况测定为接种立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)7天后的疾病严重程度。其中，*表示p值<0.05，**表示p值<0.01，#表示p值<0.1。关于所使用的强心酚三烯配方的描述，见实施例5。强心酚三烯在预防瓜果腐霉感染后的植物死亡方面具有优异的功效：100ppm下高达97.6％；200ppm下高达100％；400ppm下高达71.4％。强心酚三烯在预防立枯丝核菌感染后的植物死亡方面具有优异的功效：100ppm下高达81.2％；200ppm下高达100％；400ppm下高达98.4％。

具体实施方式

根据本发明发现，对于腐霉科(Pythiaceae)下的瓜果腐霉、伞菌纲(Agaricomycetes)下的立枯丝核菌以及假单胞菌目(Pseudomonadales)下的丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)，式(I)所示化合物为强效农药。

在一个方面中，本发明涉及包括至少一种式(I)所示化合物的农药组合物：

其中，

在一种实施方式中，化合物5-8Z,11Z,14-十五碳三烯-1-基-1,3-苯二酚(强心酚三烯(Cardol triene)，CAS登录号：79473-24-8)或其农业上可接受的盐用作本发明农药组合物中的活性农药成分。强心酚三烯为5位具有8-顺,11-顺-十五碳-8,11,14-三烯-1-基这一取代基的间苯二酚衍生物，分子式为下式(IA)：

在另一实施方式中，本发明涉及一种包含化合物3-[(8Z,11Z)-十五碳-8,11,14-三烯-1-基]苯酚(腰果酚三烯(Cardanol triene)，CAS登录号：79353-39-2)或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。腰果酚三烯为具有式(IB)所示的苯酚三烯衍生物：

在又一实施方式中，本发明涉及一种包含化合物5-[(8Z,11Z)-十五碳-8,11-二烯-1-基]苯-1,3-二酚(强心酚二烯(Cardol diene)，CAS登录号：79473-25-9)或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。强心酚二烯为5位具有8-顺,11-顺-十五碳-8,11-二烯-1-基这一取代基的间苯二酚衍生物，分子式为下式(IC)：

在某些实施方式中，所述农药组合物进一步包括农业上合适的或农业上可接受的溶剂或增溶剂。

在某些实施方式中，所述农业上可接受的溶剂或增溶剂为能够溶解或增溶式(I)所示化合物的水混溶性溶剂。

在某些实施方式中，能够溶解或增溶式(I)所示化合物的所述水混溶性溶剂为极性溶剂，如醇、酮、内酯、酮醇、乙二醇、乙二醇醚、酰胺、烷醇胺、亚砜及吡咯烷酮。

在具体实施方式中，所述组合物包括选自二甲基亚砜或乙醇的溶剂以及作为聚山梨酯类非离子表面活性剂的聚山梨酯20。

在另一方面，本发明提供一种控制、预防、减少或根除在植物、植物器官、植物部位或植物繁殖材料上的植物病原体侵染或其症状的方法，该方法包括：向植物、植物器官或植物繁殖材料，或者向所述植物周围的土壤，施用农药有效量的包含至少一种式(I)所示化合物或其具有农药活性的盐作为活性农药成分的活性剂或上述任一实施方式的农药组合物，其中，所述植物病原体为选自以下当中的一种：腐霉科中的一种；伞菌纲中的一种；以及假单胞菌目中的一种。

本发明的治疗方法可例如用于以下疾病：丝核菌属引起的褐斑病、秧苗立枯病、蔬菜的根腐病及腹腐病及水稻纹枯病；腐霉属引起的烟草、番茄、黄瓜、芥菜、辣椒及水芹秧苗立枯病；假单胞菌属引起的欧防风及番茄的髓部坏死病、水稻的褐斑病及叶鞘褐腐病、杏树的细菌性溃疡病及橄榄树的橄榄结病。

在某些实施方式中，所述植物病原体为腐霉科中的一种。

在某些实施方式中，所述腐霉科植物病原体为腐霉属中的一种，如瓜果腐霉及终极腐霉(Pythium ultimum)。

在某些实施方式中，所述植物病原体为瓜果腐霉。

在某些实施方式中，所述植物病原体为伞菌纲中的一种。

在某些实施方式中，所述伞菌纲植物病原体为鸡油菌目(Cantharellales)中的一种。

在某些实施方式中，所述鸡油菌目植物病原体为角担菌科(Ceratobasidiaceae)中的一种。

在某些实施方式中，所述角担菌科植物病原体为丝核菌属中的一种，如立枯丝核菌、甘薯丝核菌(Rhizoctonia bataticola，也称菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina))、胡萝卜丝核菌(Rhizoctonia carotae，也称扣状胡萝卜丝核菌(Fibulorhizoctonia carotae))、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis，禾谷角担菌(Ceratobasidium cereale)的无性态)、紫纹羽丝核菌(Rhizoctonia crocorum，或Thanatophytum crocorum，紫纹羽病菌(Helicobasidium purpureum)的无性态)、草莓丝核菌(Rhizoctonia fragariae，喙角担菌(Ceratobasidium cornigerum)的无性态)、斑叶兰丝核菌(Rhizoctonia goodyerae-repentis，也称喙角担菌)、稻丝核菌(Rhizoctoniaoryzae，也称旋卷似串担革菌(Waitea circinate)以及多枝丝核菌(Rhizoctoniaramicola，也称多枝角菌根菌(Ceratorhiza ramicola)，多枝角担菌(Ceratobasidiumramicola)的无性态)。

在某些实施方式中，所述植物病原体为立枯丝核菌。

在某些实施方式中，所述植物病原体为假单胞菌目中的一种。

在某些实施方式中，所述假单胞菌目植物病原体为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)中的一种。

在某些实施方式中，所述假单胞菌科植物病原体为假单胞菌属中的一种，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)及丁香假单胞菌。

在某些实施方式中，所述植物病原体为丁香假单胞菌。

本发明农药组合物可配制成用于有助于所述活性农药成分的施用的制剂。

所述制剂可以为水混溶性制剂，如悬浮剂(SC)、微囊悬浮剂(CS)、水分散粒剂(WG)、乳油(EC)、可湿性粉剂(WP)、可溶(液)剂及可溶粉剂(SP)。

该制剂可进一步包括至少一种溶剂或增溶剂、佐剂、载体、稀释剂及/或表面活性剂。

佐剂例如但不限于为活化剂佐剂，如阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，油剂，以及能够提高所述农药产品活性的氮基肥料。油剂可以为作物油，如基于石蜡或石脑油的石油类油剂，基于可乳化石油类油剂的作物油浓缩物，以及从种子油(通常为棉花籽油、亚麻籽油、大豆油或葵花籽油)获得的蔬菜油浓缩物，用于抑制禾本科杂草。氮基肥料可以为硫酸铵或尿素硝酸铵。

增溶剂或溶剂例如但不限于为石油类溶剂，上述油剂，以及脂肪酸、乙醇、甘油及二甲基亚砜的液体混合物。所述农业上可接受的溶剂或增溶剂可以为例如极性溶剂之类能够溶解或增溶式(I)所示化合物的水混溶性溶剂，所述极性溶剂例如为醇、酮、内酯、酮醇、乙二醇、乙二醇醚、酰胺、烷醇胺、亚砜及吡咯烷酮。

载体例如但不限于为沉淀二氧化硅、胶态二氧化硅、绿坡缕石、瓷土、滑石、高岭土及其组合。

所述农药制剂可进一步包括稀释剂，如乳糖、淀粉、尿素、水溶性无机盐及其组合。

所述农药制剂可进一步包括一种或多种表面活性剂，如聚山梨酯类非离子表面活性剂、苯乙烯丙烯酸分散剂聚合物、基于酸性树脂共聚物的分散剂、聚羧酸钾、烷基萘磺酸钠混合物、二异丙基萘磺酸钠、萘磺酸缩合物钠盐、木质素磺酸盐及其组合。

在上述任一实施方式的方法中，所述活性剂、组合物或将其含于其内的制剂通过喷洒、浸没、掺拌、包衣、丸粒化、滴灌或浸泡，施用至所述植物、部位、器官、植物周围土壤或其植物繁殖材料。

定义

式(I)所示化合物包括中性形式的碱性化合物及其农业上可接受的盐。

本文中，“植物器官”一词是指叶、茎、根及生殖结构。

本文中，“植物部位”一词是指与营养繁殖相关的植物材料，如插条或块茎、叶、花、树皮或茎。

本文中，“植物繁殖材料”一词是指植物的种子、根、果实、块茎、球茎、根茎或植物的一部分。

本文中，“农药有效量”一词是指能够导致至少一种害虫死亡或显著减少害虫生长、摄食、侵染或正常生理发育的农药量。

本文中，“纲”、“目”、“科”、“属”、“种”各词的用法遵循《国际藻类、真菌及植物命名法规》的第3.1条。

权利要求书中使用的“包括”一词为“开放”性词语，不但指所列出的元素或其结构或功能上的等同物，而且指未列出的任何其他一个或多个元素。该词不应解释为仅限于其后所列出的事物，也不排除其他元素或步骤。该词需解释为指明存在所提及的特征、整体、步骤或部件，但不排除存在或加入一个或多个其他特征、整体、步骤、部件或其组成的组。因此，“一种组合物，包括x和z”这一表述的范围不应限制于仅由化合物x和z组成的组合物。同样地，“一种方法，包括步骤x和步骤z”这一表述不应限制于仅由此两步骤组成的方法。

本文中，“和/或”一词包括一个或多个相关列举事项的任何和所有组合。除非另有定义，本文中的所有词语(包括科技术语)与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的含义相同。还应理解的是，词语(如常用词典中定义的词语)应解释为具有与其在本说明书上下文及相关技术领域背景中的含义相一致的含义，而且除非本文中明确指出，否则不应按照理想化或过于正式的方式进行理解。出于简洁和/或清楚起见，众所周知的功能或结构可能不会进行详细描述。

除非另有说明，否则本说明书中使用的所有数字均应理解为在所有情况下均以“约”一词修饰。除非特别指出，否则本文中的“约”一词均应理解为处于本技术领域的正常公差范围内，例如处于平均值的两个标准偏差范围内。在一种实施方式中，“约”一词表示处于其所修饰的数字所给出的数值的10％的偏差以内，优选处于所给出的数值的5％的偏差以内。例如，“约”一词可直观地理解为处于所列值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的偏差以内。在其他实施方式中，取决于所使用的实验技术等，“约”一词可表示更大的偏差容限。本领域技术人员应理解与给定值存在偏差的情况，而且此类情况处于本发明框架之内。作为一种说明示例，“约1至约5”这一数值范围应解释为不仅包括“约1至约5”中明确列出的值，而且包括所给范围中的单独值以及子范围。因此，这一数值范围包括2、3、4之类的单独值，以及各个子范围，例如，1～3，2～4，2～4，以及1、2、3、4、5或6。这一原则同样适用于仅给出一个作为最小值或最大值的数值的范围。除非根据上下文明确可知，否则本文给出的所有数值均以“约”一词修饰。“基本上”、“总体上”、“以内”等其他类似词语应解释为以使得所修饰的词语或数值变得不绝对的方式修饰该词语或数值。此类词语随具体情况以及其所修饰的词语而定，这与本领域技术人员对这些词语的理解方式一致。这方面至少包括具体实验、技术或用于测量某值的仪器的预期实验误差、技术误差以及仪器误差。

以下，通过非限制性实施例，对本发明进行说明。

实施例

RPM–每分钟转数

RCF–相对离心力

CFU–菌落形成单位

PDBC–含20μg/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖肉汤

PDAC–含20μg/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂

PDAT–含12μg/ml四环素的马铃薯葡萄糖琼脂

DMSO–二甲基亚砜

LB–LB肉汤

LBA–LB琼脂

SCH–施密特纳(Schmittner)培养基

2倍稀释PDBC–以无菌蒸馏水2倍稀释的PDBC

PDA–马铃薯葡萄糖琼脂

PDBT–含12μg/ml四环素的马铃薯葡萄糖肉汤

概要：将以DMSO稀释的强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯加入微孔板的板孔内，并与50μl菌丝悬浮液混合。通过读板仪和目视检验，观察以混合菌丝为起始物的真菌生长情况。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：PDAC，PDBC，DMSO

设备:读板仪，离心机，摇床，培养箱

方法：

在盛有PDAC的90mm培养皿内培养该丝核菌，以获得生长时间为1～4天以内的菌丝。

在250ml无菌锥形瓶内加入50ml的PDBC培养基。

以手术刀将固体培养基切成数个小块，放入锥形瓶中。

在27℃和150RPM下，在摇床上培养2～4天。

丢弃液体部分，将菌丝倒入空的培养皿中。

以手术刀从菌丝上切下多个小条，将其放入盛有50ml的PDBC培养基的250ml无菌锥形瓶内。

制备4瓶培养物，在27℃和150RPM下摇动培养3天。

将培养物在冰箱中冷藏1小时。

将低温培养物倒入250ml烧杯中。

加入20ml低温PDBC，以使得混合物覆盖搅拌器叶片。

利用搅拌器，将培养物在冰上以最大速度搅拌2分钟，并将搅拌器上下提动若干次。

将混合物保持于冰上。

将约5ml搅拌后的混合物移入置于冰上的15ml试管中。

将15ml试管内的培养物在冰上匀浆2分钟，根据需要上下提动试管。

按照上述方式，进行若干批的5ml匀浆，以制备所需的量(以5ml匀浆的培养物制备约100ml的接种物)。

将匀浆液的一部分稀释10倍，以确定匀浆液浓度。该悬浮液浓度应为4×10

按1：20的比例，将接种物母液稀释于PDBC中(1ml前者稀释于20ml的后者内)，或者计算所需的稀释倍数，以制备2000CFU/ml的最终浓度。每一板孔内的量应为约100CFU。

1)从-20℃的冷柜中取出经纯化的1％强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯母液(溶于DMSO溶液)，将其在工作台上解冻。

2)取1μl的1％强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

3)以多通道移液器取10μl的稀释(250ppm)强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯溶液，将其移入微孔板的板孔中。

4)以多通道移液器在微孔板的板孔中加入40μl剧烈混合后的孢子悬浮液接种物。

5)以透明密封物密封孔板。

6)将孔板在2000RPM下摇动10分钟，以将强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯与菌丝悬浮液混合。

7)将孔板在1000RCF下离心1秒后停止离心，并收集孔板底部的液体。

8)将微孔板保持于工作台上，直至以读板仪读板。

9)以读板仪读板。

10)收集工作台上的孔板。

11)将收集的孔板放入带有布盖的塑料盒中，并将该盒放入27℃的培养箱中。

1)除测定开始当天之外，还在另外3天内筛查孔板，即分别在第3天、第7天、第14天及第21天筛查。

2)计算每次筛查时的吸光度与初始吸光度之间的差异。

3)计算每一时间点下每一板孔的生长抑制百分比，其中，将以DMSO处理的对照孔板的结果作为100％生长量。

概要：将以DMSO稀释的强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯加入微孔板的板孔内，并与50μl的游动孢子PDBC悬浮液混合。通过读板仪和目视检验，观察以游动孢子为起始物的真菌生长情况。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：SCH，PDBC，DMSO

设备：读板仪，离心机，摇床，培养箱

方法：

在盛有SCH的90mm培养皿内培养瓜果腐霉，以获得能够生产孢子的菌丝。每一培养皿生产50ml的游动孢子悬浮液，足以供十个96孔板进行生物活性筛查。

在250ml无菌锥形瓶中加入60ml的无菌水。

以手术刀将两个培养皿中的固体培养基切成12小块(每一培养皿12小块)，并将其放入锥形瓶(固体小块应被水没过)。

将菌丝在17℃下静置过夜，令其生产孢子。

以手摇动锥形瓶，以使游动孢子悬浮。

将悬浮液经16层纱布滤入50ml试管。

将悬浮液移入500ml无菌试剂瓶中。

丢弃固体部分，并以次氯酸盐将锥形瓶消毒。

将游动孢子悬浮液在冰上冷却。

测定悬浮液的游动孢子浓度(该浓度应为1000～4000个孢子/ml)。

以经冰箱冷藏的无菌蒸馏水，将悬浮液稀释于500ml无菌试剂瓶中。

加入相同体积的(与悬浮液体积相同)经冰箱冷藏且无菌的2倍稀释PDBC，以获得500～2000个孢子/ml的接种物。稀释后，每一板孔内的游动孢子量为25～100个。

将游动孢子悬浮液接种物保持于冰上。

1)从-20℃的冷柜中取出经纯化的1％强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯母液(溶于DMSO溶液)，将其在工作台上解冻。

2)取1μl的1％强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

3)以多通道移液器取10μl的稀释(250ppm)强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯溶液，将其移入微孔板的板孔中。

4)以多通道移液器在微孔板的板孔中加入40μl剧烈混合后的孢子悬浮液接种物。

5)以透明密封物密封孔板。

6)将孔板在2000RPM下摇动10分钟，以将强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯与菌丝悬浮液混合。

7)将孔板在1000RCF下离心1秒后停止离心，并收集孔板底部的液体。

8)将微孔板保持于工作台上，直至以读板仪读板。

9)以读板仪读板。

10)收集工作台上的孔板。

11)将收集的孔板放入带有布盖的塑料盒中，并将该盒放入27℃的培养箱中。

1)除测定开始当天之外，还在另外3天内筛查孔板，即分别在第3天、第7天、第14天及第21天筛查。

2)计算每次读板时的吸光度与初始吸光度之间的差异。

3)计算每一时间点下每一板孔的生长抑制百分比，其中，将以DMSO处理的对照孔板的结果作为100％生长量。

背景：假单胞菌为一种杆状的革兰氏阴性细菌。本生物活性筛查实验以配制于60％甘油内的冷冻细菌母液为接种物。

概要：将以DMSO稀释的强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯加入微孔板的板孔内，并与100μl冷冻细菌悬浮液混合。通过目视检验，观察假单胞菌的生长情况。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：LB，LBA，DMSO

设备:离心机，摇床，培养箱

方法：

1)将假单胞菌在LBA培养板上28℃培养2天，以获得单个菌落。

2)以无菌牙签将单个菌落移入盛有5ml LB的50ml无菌试管内，并在28℃和150RPM下培养24小时。

3)将试管在冰箱内冷藏1小时。

4)向试管内加入7.5ml经冰箱冷藏的无菌甘油溶液，以获得60％甘油溶液。

5)通过1000RPM涡旋进行均匀轻柔混合，以达到完全混合效果。

6)将60％甘油细菌悬浮液等分为100μl每份并将其放置于1.5ml试管中，每一等份足以供10个微孔板进行筛查。

7)将细菌悬浮液在-20℃的60％甘油内保存。

1)从冷柜中取出内盛100μl冷冻假单胞菌悬浮液的1.5ml试管，并将其在冰上解冻。

2)在通风橱内将40ml经冰箱冷藏的LB倒入50ml试管；

3)将40μl的细菌悬浮液与50ml试管内所盛的40ml经冰箱冷藏的LB混合，该量足以供10个微孔板的活性筛查。

4)以所得悬浮液进行生物活性筛查实验。

1)从-20℃的冷柜中取出经纯化的1％强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯母液(溶于DMSO溶液)，将其在工作台上解冻。

2)取1μl的1％强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

3)以多通道移液器取10μl的稀释(250ppm)强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯溶液，将其移入微孔板的板孔中。

4)以多通道移液器在微孔板的板孔中加入40μl剧烈混合后的细菌悬浮液接种物。

5)以透明密封物密封孔板。

6)将孔板在2000RPM下摇动10分钟，以将强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯与细菌悬浮液混合。

7)将孔板在1000RCF下离心1秒后停止离心，并收集孔板底部的液体。

8)将孔板放入带盖塑料盒中，并将该盒放入28℃的培养箱中。

1)在接种后的第3天、第5天、第7天、第14天及第21天的5天内筛查孔板。

2)在灯光下目视评估细菌生长状况。

3)筛查前的孔板准备工作：将孔板在2000RPM下摇动2分钟，以使细菌悬浮，然后将孔板在1000RCF下离心数秒钟。

4)在取下盒盖后检视孔板，如果盒盖上(内侧)有液状物，通过在60℃下加热，将该液状物蒸发。

5)将每一板孔的透明度与对照板孔(含对照杀细菌剂或0.5％DMSO溶液)的透明度相比较。

6)以具有如下含义的条项记录结果：清澈＝3(无细菌生长)；浑浊＝1(正常细菌生长)；不确定＝2(与0.5％DMSO溶液中的生长状况相比，浑浊度极低)。

体外筛查矩阵

针对选定的农业害虫(如下表所示)，对强心酚三烯、强心酚二烯或腰果酚三烯进行筛查。其中，生物活性值以百分比的形式表示，并反映了其根除目标害虫的潜力。

生物活性相对值(表示为最大值的百分比)的计算原则

1.立枯丝核菌、瓜果腐霉：活性等级(1/2/3)×重复次数×活性保持天数/252(最大值3×4×21＝252)*100

2.丁香假单胞菌：活性等级(1/2/3)×重复次数×活性保持天数/168(最大值3×4×14＝168)*100

表1：强心酚三烯对各种目标害虫的生物活性值

表2：强心酚二烯对各种目标害虫的生物活性值

表3：腰果酚三烯对各种目标害虫的生物活性值

总而言之，针对如下害虫，强心酚三烯、腰果酚三烯及强心酚二烯为有效的农药：瓜果腐霉(其有效性见下文的体内结果部分)；立枯丝核菌(其有效性见下文的体内结果部分)；以及丁香假单胞菌。

(A)0.1％的CART水+碱溶液(将CART在水中溶至0.1％并在室温下声波处理10分钟，然后加入25％的Na

(B)0.4％黄原胶(Xanthan Gum)水溶液(重量百分比)；

(C)0.6％喜威(Silwet，有机硅表面活性剂)水溶液(重量百分比)。

施用至黄瓜秧苗的最终制剂由40％的母液A、10％的母液B、10％的母液C以及40％的水组成。最终制剂3直接以400ppm施用至黄瓜秧苗，或者先稀释至所需浓度，然后施用至黄瓜秧苗。

(A)10％的CART DMSO溶液(将CART在DMSO中溶至10％(重量百分比)，并在室温下声波处理5分钟)；

(B)0.4％黄原胶水溶液(重量百分比)；

(C)0.6％喜威水溶液(重量百分比)。

施用至黄瓜秧苗的最终制剂由4％的母液A、10％的母液B、10％的母液C以及76％的水组成。最终制剂4直接以400ppm施用至黄瓜秧苗，或者先稀释至所需浓度，然后施用至黄瓜秧苗。

(A)25％的CART水+DL8/2溶液(将CART在DL8/2(非离子表面活性剂乙氧基丙氧基丁醇嵌段聚合物(block polymer of ethoxy propoxy butanol)和蓖麻油乙氧基化物(castor oil ethoxylate)的混合物)中溶至50％(重量百分比)后，通过涡旋混合均匀，并在室温下声波处理5分钟；将所得的50％ CART溶液以蒸馏水稀释(体积百分比)至25％后，通过涡旋混合均匀，并在室温下声波处理5分钟后离心1分钟)；

(B)0.4％黄原胶水溶液(重量百分比)；

(C)0.6％喜威水溶液(重量百分比)。

施用至黄瓜秧苗的最终制剂由0.16％的母液A、10％的母液B、10％的母液C以及79.84％的水组成。最终制剂10直接以400ppm施用至黄瓜秧苗，或者先稀释至所需浓度，然后施用至黄瓜秧苗。

体内验证实验的统计分析

为了在与对照植物(感染但未治疗)的对比下评价强心酚三烯对已感染植物的效果，通过学生t检验对所得数据进行分析，并计算p值。每项试验最少重复三次。如果p<0.05，则认为结果具有显著性。数据表示为平均值附加各项重复生物实验的标准差平均值的形式。其中，*表示p值<0.05，**表示p值<0.01，#表示p值<0.1，n.s.表示与对照植物无显著差异。

概述：在以强心酚三烯(CART)进行预防性治疗后，对瓜果腐霉病严重程度的发展状况进行评估。

制备腐霉接种物：

1)将10ml的藜麦种子放入100ml的瓶中。

2)加入10ml的无菌蒸馏水。

3)将种子在冰箱中放置24小时，令其吸水。

4)24小时后，在瓶顶放置透气的布，并松松地合上顶部瓶盖。

5)高压灭菌40分钟(121℃)(液体循环)

6)在通风橱内冷却，并取下瓶盖

7)以长于PDAC培养板上的小块腐霉菌接种藜麦种子。

8)再次盖上透气的布以及瓶盖。

9)将在瓶中以固态生长的腐霉放入27℃的培养箱内。

10)5天后，腐霉菌应可供接种植物。

11)将腐霉菌丝匀浆至所需体积：

A、以250ml烧杯及棒式搅拌机制备混合物。

B、加入100ml水

C、加入1g的固状腐霉菌培养物，获得1％菌丝悬浮液。

D、在冰上高速匀浆2分钟。

E、以无菌水稀释匀浆后的菌丝悬浮液，获得0.5％菌丝悬浮液。

F、稀释后，立即以匀浆后的菌丝悬浮液接种土壤，并将其保持于4℃下，以供后续使用。

秧苗发芽条件：

1)使用在育苗盘中发芽的6日龄黄瓜秧苗。使用合适的黄瓜品种，以允许疾病发展。秧苗应为6日龄。土壤种植基质的组成以优质的椰子和珍珠岩为基础(50％对50％)，并具有良好透水、通风特性以及完全的惰性。

2)秧苗在温室内于如下育苗条件发芽：40ppm的氮磷钾肥；每天浇水两次。

3)实验开始前，将秧苗子叶已完全展开但首片真叶尚未长出的育苗盘从浇水系统中取出，以允许治疗药物浸渗。

4)播种后第6天开始治疗。第7天，在每一苗穴内加入接种物。

施加治疗

1)根据实施例5配制强心酚三烯。

2)当采用淋施时，每一苗穴分别施加5～6ml强心酚三烯制剂。

3)当采用喷施时，不同治疗条件采用不同施加方式。每8株秧苗施加5ml具有相应浓度的强心酚三烯制剂。喷洒采用塑料喷雾器，直至秧苗的叶片充分吸收。

4)在小规模实验中，每一条件下测试的秧苗数为n＝8(177号、187a号、187b号、187c号、184a号、184b号及206号实验)。在大规模实验(246号及247号实验)中，每一条件下测试的秧苗数为n＝24，但未治疗组的测试苗数为n＝16。

土壤接种：

1)秧苗在以强心酚三烯治疗后的24小时接种(预防法)。

2)利用移液器，分别在每一苗穴处的土壤表面散播5～6ml的接种物。每一苗穴处的土壤应将所有的接种物完全吸收。治疗药物与接种物应会均匀分布于根围。

生长与分析：

1)在正常浇水条件下令黄瓜秧苗继续生长7天。

2)在第7天(播种后14天)，进行疾病严重程度的评价。

3)疾病症状：秧苗应因根腐病而开始倒伏，而且接地处的杆部应出现褐色。

4)接种后第7天，统计病苗和死苗。

5)计算每一治疗方案的死亡率百分比。

概述：在以强心酚三烯(CART)进行预防性治疗后，对丝核菌病严重程度进行评估。其中，以菌丝感染6日龄的黄瓜秧苗，该黄瓜秧苗已采用CART进行治疗。

1)将10ml的藜麦种子放入100ml的瓶中。

2)加入10ml的无菌蒸馏水。

3)将藜麦种子在冰箱中4℃下放置24小时，令其吸水。

4)24小时后，在瓶顶放置透气的布，并松松地合上顶部瓶盖。

5)高压灭菌40分钟(121℃)(液体循环)

6)在通风橱内冷却，并取下瓶盖

7)以长于PDAC(含20μg/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂)培养板上的小块丝核菌接种藜麦种子。

8)再次盖上透气的布以及瓶盖。

9)将在瓶中以固态生长的丝核菌放入27℃的培养箱内。

10)8～10天后，丝核菌应可供接种黄瓜秧苗。

11)将丝核菌菌丝匀浆至所需体积：

12)以250ml烧杯及棒式搅拌机制备混合物；

13)加入100ml水；

14)加入1g的固状丝核菌培养物，获得1％菌丝悬浮液；

15)在冰上高速匀浆2分钟。

16)以无菌水稀释匀浆后的菌丝悬浮液，获得0.5％菌丝悬浮液。

17)稀释后，立即以匀浆后的菌丝悬浮液接种土壤(保持于4℃下，以供后续使用)。

1)使用在育苗盘中发芽的136株6日龄黄瓜秧苗。使用合适的敏感性黄瓜品种，以允许疾病发展。秧苗应为6日龄。土壤种植基质的组成以优质的椰子和珍珠岩为基础(50％对50％)，并具有良好透水、通风特性以及完全的惰性。

2)秧苗在温室内于如下育苗条件发芽：40ppm的氮磷钾肥；每天浇水两次(夏季)。在冬季条件下，需要不同的浇水方式。

3)实验开始前，将秧苗子叶已长全但首片真叶尚未长出的育苗盘从浇水系统中取出，以允许治疗药物渗入土壤。

4)播种后第6天开始治疗。第7天，在每一苗穴内加入接种物。

施加治疗

1)根据实施例5配制强心酚三烯。

2)当采用5～6ml治疗药物淋施时，每一苗穴分别施加相应浓度的治疗药物。

3)当采用喷施时，不同治疗条件采用不同施加方式。每8株黄瓜秧苗施加5ml具有相应浓度的强心酚三烯制剂。秧苗喷洒采用简易塑料手动喷雾器，直至秧苗的叶片充分吸收。

4)在小规模实验中，每一治疗条件下测试的秧苗数为n＝8。在大规模实验中，每一治疗条件下测试的秧苗数为n＝24，但未治疗组的测试苗数为n＝16。

土壤接种：

1)在以强心酚三烯治疗后的24小时进行接种(预防法)。在治疗后及接种之前，秧苗一直不浇水，以避免强心酚三烯被洗脱。

2)利用10ml移液器，分别在每一苗穴处的土壤表面散播5～6ml的接种物。每一苗穴处的土壤应将所有的接种物完全吸收。治疗药物与接种物应会均匀分布于根围。

3)生长与分析：

4)在正常浇水条件下令黄瓜秧苗继续生长7天。

5)在第7天(播种后14天)，进行最终疾病评估。

6)疾病发展表现：秧苗应因根腐病而开始倒伏，而且接地处的杆部应出现褐色。

7)统计病苗和死苗。

8)计算每一治疗方案的死亡率百分比。

参考文献

埃拉赫尔·A，卡尔迪纳莱(Cardinale)·M，格罗什(Grosch)·R，博格(Berg)·G，病原体——立枯丝核菌及其有益对应物——解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)对本地莴苣微生物组的影响，微生物学前沿(Front Microbiol.)，2014年，5：175，在线发布日：2014年4月21日，doi:10.3389/fmicb.2014.00175。

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弗兰克(Frank)·N·马丁及乔依斯(Joyce)·E·洛珀，腐霉属引起的土传植物病：生态学、流行病学及生物防治前景，植物科学评论(Critical Reviews in PlantSciences)，1999年，18：111～181。

摩尔·L·W，丁香假单胞菌：疾病与冰核活性，西北观赏植物简报(OrnamentalsNorthwest Newsletter)，1988年，第12期：4～16。