病毒载体纯化装置及方法

背景

技术领域

一般而言，本发明的实施方案落入澄清生物过程流体的范畴，特别是从细胞培养物大量纯化病毒载体的范畴。

背景技术

病毒载体作为遗传密码修饰剂和指令的载体，在基因疗法和免疫疗法(例如嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，“CAR-T”)中起着关键作用。常见的载体可以包括，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、植物病毒和杂合载体。用于人类治疗的病毒载体通常衍生自自然感染人类或其它哺乳动物细胞的病毒。

一般而言，病毒载体的生产依赖于转染的宿主细胞培养物来产生具有包含在病毒载体内的所需遗传内容的新病毒颗粒。细胞培养物可以作为贴壁或悬浮细胞培养物维持。从广义上讲，载体生产有两种模式：稳定(连续)细胞生产线和瞬态(诱导)生产线。无论选择何种模式，可用的病毒载体一旦被生产，就必须分离并纯化成合适的最终产品。由于大量生产病毒载体的复杂性，当前的良好生产过程(“cGMP”或“GMP”)要求终末期产品至少具有在产品保质期内安全、正确身份、足够的强度/效力的属性，不含污染物，并且采用包含足够质量控制机制的受监测过程进行生产。

杂质可来源于在其中产生载体产品的宿主细胞系统或来源于下游载体纯化过程。宿主细胞相关杂质的潜在来源可包括：来源于生产细胞的残留宿主细胞蛋白和核酸。其它杂质可包括来自细胞培养基(即，牛血清白蛋白)和下游纯化过程(即，去垢剂和色谱树脂组分)的过程相关残留物。宿主细胞杂质的定量和去除很重要，因为某些宿主细胞分子可能在最终药物产品中具有毒性作用，或者可能作为佐剂刺激抗载体免疫反应。此外，残缺或不完整的病毒载体组分(例如，未填充的衣壳、未整合的病毒蛋白、病毒肽或核酸)是杂质的额外来源。

病毒载体的生产，例如在生产腺伴随病毒(AAV)时往往需要细胞裂解作为病毒载体生产的一部分。裂解过程引入超过和多于非裂解过程的杂质负载。在培养基内的细胞组分、DNA、细胞膜等的碎片，与病毒载体靶标一起，必须经过分离过程，以满足上文对于功效和纯度所述的标准。传统的分离和纯化过程对从生产过程中获得的病毒载体的总体收率产生不利影响；这导致生产复杂性增加，以及最终产品成本增加。

生物药物生产正趋向于更高的细胞密度和产品效价，使得一次性收获系统在财务和物流上变得有利。随着批量生产效价的不断增加，用于大于或等于2000L的细胞培养体积的一次性生物反应器为不锈钢基础设施提供了一种经济上具有吸引力的替代方案。许多生物药物，包括病毒载体，在通过色谱系统进行下游纯化之前，最初在粗收获步骤中与生产者细胞分离。该收获步骤的体积可扩展解决方案包括在产生蛋白质或其它产品(例如病毒)时进行离心和/或深度过滤。

深度过滤是一种示例的一次性收获方法，分别通过初级和二级澄清来去除完整的细胞和细胞碎片。随着生物反应器细胞密度逐渐增加，深度过滤过程受到细胞结块和堵塞的影响，这对于制造生产率来说是不可取的。此外，深度过滤的总过滤面积倾向于与初级收获的细胞密度成比例缩放，这对于库存占地面积是不可取的，并且在细胞密度大于3000万个细胞mL

过程杂质通常以痕量存在，但重要的是，它们满足预先设定的安全准则。示例的过程杂质可包括残留溶剂、去垢剂、缓冲剂或其它不需要的化合物，这些化合物是质谱(MS)和色谱法广泛用于鉴定载体制备中的去垢剂和有机溶剂。

因此，鉴于上述情况，需要一种在大规模生产环境中纯化病毒载体的方法，该方法增加了收率，同时将整体过程复杂性降至最低。

发明简述

在实施方案中，提供了一种用于澄清生物过程流体的装置。该装置包括可操作地偶联到辅助重力沉降器的生物反应器，该辅助重力沉降器被配置为从生物反应器接收一定体积的未澄清的生物过程流体。

在另一个实施方案中，提供了一种用于澄清包含悬浮在细胞培养液中的颗粒的生物过程流体的方法。该方法包括在生物反应器中提供悬浮在未澄清的生物过程流体中的细胞培养物。将色谱亲和树脂直接添加到未澄清的生物过程流体中。色谱亲和树脂结合生物靶标。具有树脂上结合的生物靶标的未澄清的生物过程流体被传递到辅助重力沉降器中。

在另一个实施方案中，提供了一种澄清腺伴随病毒(AAV)的方法。该方法包括提供经转染以产生腺伴随病毒(AAV)的细胞培养物，从而在生物反应器中产生含有AAV的未澄清的生物过程流体。将色谱亲和树脂直接添加到未澄清的生物过程流体中。AAV随后与色谱亲和树脂结合。具有树脂上结合的AAV的未澄清的生物过程流体被传递到辅助重力沉降器中。

在又一个实施方案中，提供了一种澄清病毒载体的方法。该方法包括提供具有细胞培养物的生物反应器，所述细胞培养物能够转染以在生物反应器的生物过程流体中生产病毒载体。然后将用于编码病毒载体的载体引入细胞培养物中。然后开始病毒载体生产。从细胞培养物取出含有病毒载体的生物过程流体。新鲜的生物过程流体在连续过程中被引入细胞培养物中。然后至少用辅助重力沉降器处理含有病毒载体的生物过程流体。

附图简述

图1是根据本发明的实施方案的过程示意图的实例。

图2是根据本发明的实施方案的方法的示意图。

发明详述

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。在不一致的情况下，以本公开内容，包括定义为准。

如上所用的，以及在整个描述中，除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：

本文所用的“约”是指在给定值或范围的10％以内，例如在5％以内，以及进一步例如在2.5％以内。当术语“约”与数值范围一起使用时，它通过在所述数值的上方和下方扩展边界来修饰该范围。术语“约”也可以表示在制造过程的情况下在制剂和组合物中反映的合理公差和变化。

本文所用的“生物反应器”是指用于常用的生物材料的生长和维持的装置。该术语包括维持材料生长所需的所有相关设备(例如，生长容器/腔室；过程变量测量和监测设备；泵；管线；等等)。“生物反应器”可能像具有细胞培养物的摇瓶一样简单，也可以像多层不锈钢大体积制造系统一样复杂。

本文所用的术语“载体”按分子生物学中的通常理解使用(例如，质粒、噬菌体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体和人类人工染色体)，并且区别于利用病毒来递送载体的“病毒载体”。从本质上讲，任何形式的“载体”都是运输生物信息/组分以导致生物系统变化的一种手段。作为非限制性实例，基于腺伴随病毒(AAV)载体的基因疗法利用AAV颗粒运输遗传物质以插入靶向的染色体中。

本文所用的术语“细胞培养物”按通常的理解使用，不仅包括细胞本身，而且包括向培养的细胞提供营养和/或支持的培养基(“细胞培养基”或“培养基”)。

还如本文所用的，术语“生物过程”是使用完整的活细胞或其组分来获得所需产物的特定过程。通常，生物过程可分为三个阶段或时期：准备、生产、纯化。同样，“生物过程流体”是用作生物过程的一部分的流体。“生物过程流体”的组成可随着时间的推移而改变。作为非限制性实例，生物过程流体可以是具有营养物、pH缓冲剂、废物和生物靶标的细胞培养基。生物过程可进一步表征为“分批”或“连续”过程。在“分批”过程中，考虑单一生产和收获。在“连续”过程中，可能发生多个生产和/或收获步骤，并且生物过程流体可从和/或向生物反应器取出和替换。

本文所用的术语“生物治疗活性”是改变细胞、组织、器官或生物体的化学或生理功能的产物。生物治疗活性产物可由以下物质形成：细胞、蛋白质、病毒、疫苗、DNA、RNA、肽、小分子或大分子，或其组合或部分。

本文所用的术语“生物靶标”是指在生物过程中产生的感兴趣的产物。作为非限制性实例，AAV颗粒可以是利用细胞培养物来产生AAV颗粒的生物过程中感兴趣的生物靶标。其它生物靶标可包括治疗性蛋白质、多糖、疫苗组分、小分子和其它生物制剂。

本文所用的术语“亲和色谱树脂”是利用分子性质(例如，电荷、氢键、离子相互作用、二硫键、疏水相互作用等)的色谱固定相。在一些情况下，色谱亲和树脂可以是具有与配体结合的多糖聚合物的交联6％琼脂糖基质。在其它情况下，色谱亲和树脂可以是AVB

本文所用的术语“辅助重力沉降器”是指一种分离设备，其被配置成从生物反应器接收生物过程流体流，并从生物过程流体分离至少一部分颗粒以产生基本澄清的生物过程流体。一个实例可以在PCT公开号WO2020/052996中找到，其整体以引用方式并入。

在一些实施方案中，辅助重力沉降器通过将未澄清的生物过程流体从流体偶联的生物反应器流经分离设备内的多个中流体通道来帮助澄清含有悬浮颗粒的生物过程流体。在某些实施方案中，中流体通道可以基本上彼此平行，并且可以在2-20mm的高度内。相对于全部或部分流体首次进入装置的时间，生物过程流体在分离设备内的停留时间范围可为10-40分钟。辅助重力沉降器可用于分批或连续过程。一种或多种额外的纯化子系统可以流体偶联到辅助重力沉降器的一个或多个出口，用于进一步处理澄清的生物过程流体。所述额外的纯化子系统可以包括色谱分离设备、二级深度过滤、精制膜或其任何组合。辅助重力沉降器可以包括一个或多个额外的入口和出口，用于根据需要引入和/或去除缓冲液、冲洗液、固定剂或其它化合物。

在某些实施方案中，辅助重力沉降器可以在相对于工作表面小于或等于15°的角度，以及小于或等于25分钟的停留时间下操作。在不脱离本发明的范围的情况下，确切的时间和角度可以由本领域技术人员调整以导致过程变量。5-45分钟的停留时间也是可能的，正如5-45°的范围内的角度。在一些实施方案中，所用的角度可以是基本上0°-30°之间的角度，或者基本上0°-10°之间的角度，例如10°、5°或约0°(例如，0°±5°)。相比之下，倾斜的沉降器依赖于Boycott效应，这可能需要大约30°或更大的操作角度来实现沉降。在一些实施方案中，设备可以在整个分离过程中以该角度定位。然而，在一些实施方案中，设备可以间歇性地或周期性地从第一角度倾斜到第二或更多角度。额外的角度可以从中流体通道抽空空气，以提高设备的分离效率。

在替代配置中，辅助重力沉降器可以包括任何合适数量的流体入口、流体入口歧管、流体出口、流体出口歧管，并且可以包括或可以不包括侧向入口通道和/或侧向出口通道。不同数量的流体入口和流体出口，以及流体入口歧管和流体出口歧管，可以允许定制或选择整个设备的压降，因此可以改变通过设备的细胞培养液的流速。这可能允许基于目标应用自定义设备。在辅助重力沉降器设备的流体入口和流体出口之间的流体路径可以是单向的，呈线性或蛇形结构。此外，包含侧向入口通道和/或侧向出口通道可以使设备的轮廓最小化，同时仍允许以特定流速通过设备的细胞培养液的基本均匀分布。

在操作中，细胞培养液可以以特定的流速提供给辅助重力沉降器。这是细胞培养液通过设备内的中流体通道的流速。细胞培养液可以进入流体入口歧管，并且可以在多个中流体通道之间基本均匀地分布。当细胞培养液穿过中流体通道时，细胞培养液中所含的颗粒(例如细胞和/或结合的病毒载体)与细胞培养液的周围流体之间的密度差可能导致颗粒沉降并聚集在每个中流体通道的下方内表面上。细胞培养液的颗粒在中流体通道的下方内表面上的沉降可能进一步由作用在细胞培养液内的较高密度颗粒上的分离力引起。分离力可以是环境引力，使得不需要单独或额外的力来引起中流体通道内的颗粒沉降。当细胞培养液流过设备时，细胞培养液的颗粒在中流体通道内的沉降可能产生细胞培养液的基本澄清的流体层(例如，>80％颗粒去除)，该流体层可以通过流体出口作为输出回收。因此，可以在细胞培养液的流体层内回收生物制药过程的产物，例如蛋白质。

在某些实施方案中，病毒载体的分离是通过将载体与色谱亲和凝胶结合来完成的。通过使用辅助重力沉降器将具有结合的试剂的凝胶从生物过程流体中沉降出来。沉降的凝胶可以洗掉碎片一次或多次，并且结合的病毒载体产物最终作为最后的步骤洗脱，或最终经洗脱用于后续处理/精制步骤。一个或多个辅助重力沉降器设备可以串联或并联布置，以适应不同的体积和/或连续与分批过程。

本文所用的“缓冲液(buffer)”或“缓冲液(buffers)”表示用作制造周期的一部分的过程液体。一种或多种流体可以组合以形成缓冲液。缓冲液不需要实际缓冲pH或其它离子，尽管这种缓冲液可落入该定义。示例的缓冲液可包括：水(注射用水(WFI)品质、细胞培养和分子生物学级)；缓冲盐水和平衡盐(DPBS、PBS、HBSS、EBSS)；色谱缓冲溶液；或清洁溶液(氢氧化钠、WFI品质水、20％乙醇)。

本发明的实施方案涉及通过首先将色谱亲和树脂直接添加到生物过程流体中，结合生物靶标，然后将生物过程流体传递到辅助重力沉降器，从生物过程流体的碎片场分离生物靶标。细胞碎片流出沉降器，并且与生物靶标结合的色谱亲和树脂在辅助重力沉降器设备中被捕获。捕获的树脂用缓冲液洗涤和生物靶标洗脱进行处理。可以对洗脱的材料进行随后的纯化和/或包装步骤。然后，可酌情对色谱亲和树脂进行清洁并重复使用或处置。

虽然澄清后纯化AAV的传统方法由于在澄清阶段生物靶标的耗竭而具有大约30-38％的收率，但可以设想，实施本发明的实施方案的本领域普通技术人员将回到高于38％的更高收率，因为在澄清之前将色谱亲和树脂直接添加到细胞培养生物过程流体中。因此，在随后澄清和纯化生物过程流体之前，生物靶标与色谱亲和树脂结合。

转到图1，示出了用于执行本发明的方法的实施方案的示意图。在任选的第一步骤A中，将细胞裂解剂或改变细胞培养物的生长的其它刺激物，例如去垢剂(离子、非离子或两性离子)和/或核酸酶(例如，Benzonase

转到图2，示出了根据本发明的实施方案的方法的示意图。在第一步骤210中，可以从生物反应器中取出含有产生生物靶标的成熟细胞培养物的未澄清的生物过程流体。在第二步骤212中，然后将如上所述的细胞裂解剂添加到取出的未澄清的生物过程流体中。在第三步骤214中，将色谱亲和树脂加入到未澄清的生物过程流体中。在第四步骤216中，未澄清的生物过程流体被送入辅助重力沉降器。在第四步骤218中，缓冲液通过辅助重力沉降器冲洗，作为流出物除去细胞碎片和其它碎屑，澄清生物过程流体。该过程的其余部分如上文对于图1所述执行。本领域普通技术人员将理解，可以在不脱离所公开的发明的更广泛范围的情况下插入额外的步骤或按操作顺序重新排列某些步骤。

在实施方案中，在将未澄清的生物过程流体流过辅助重力沉降器之前，降低生物过程流体的pH。在实施方案中，然后可在缓冲液冲洗捕获的具有结合的生物靶标的色谱亲和树脂之后，升高pH。在其它实施方案中，来自盐化合物的溶解离子的浓度可以升高或降低。

在实施方案中，洗脱的生物靶标被传递到至少一种二级纯化系统(例如，深度过滤、膜过滤、色谱和/或离心等)。

在实施方案中，在生物反应器中悬浮在生物过程流体中的细胞培养物用载体转染以产生生物靶标。在某些实施方案中，载体触发宿主细胞以产生经改变为包含用于插入到靶基因组中的遗传组分的AAV。将色谱亲和树脂(例如AVB

在仍其它实施方案中，将含有生物靶标的未澄清的生物过程流体从生物反应器中取出，并将新鲜的生物过程流体提供给生物反应器。将亲和色谱树脂加入到从生物反应器中取出的含有生物靶标的生物过程流体中，结合生物靶标。然后用辅助重力沉降器处理含有结合的生物靶标的生物过程流体。在一些实施方案中，生物靶标是病毒载体。

本文中描述的装置和方法通过消除一个或多个额外的分离和澄清步骤来简化生物学生产的生物治疗过程的制造。将色谱亲和树脂直接应用于未澄清的生物过程流体显著提高了收率，尤其是AAV的收率，因为消除了额外的处理和洗涤步骤，这些步骤否则会降解或去除生物靶标。此外，在执行本发明的实施方案时，设备使用的减少释放了制造占地面积，增加了整个制造工厂的产量。

最后，本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域技术人员能够实践本发明，包括制备和使用任何设备或系统以及执行任何并入的方法。本发明的可专利范围由权利要求书定义，并且可以包括本领域技术人员所想到的其它实例。这样的其它实例如果它们的结构要素与权利要求书的字面语言没有区别，或者如果它们包括与权利要求书的字面语言没有实质性差异的等同结构要素，则意在权利要求范围内。

如本文所用，以单数形式叙述以及前面为单词“a”或“an”的要素或步骤应理解为不排除所述要素或步骤的复数形式，除非明确说明这种排除。此外，对本发明的“一个实施方案”的提及不意图被解释为排除也包含所述特征的额外实施方案的存在。此外，除非明确说明相反，实施方案“包含”、“包括”或“具有”具有特定性质的一个或多个要素可以包括不具有该性质的额外此类要素。

由于可以在上述发明中进行某些更改而不脱离本文所涉及的本发明的精神和范围，意在附图中所示的上述描述的所有主题应仅解释为说明本文中的发明构思的实例，而不应被解释为对本发明的限制。