一种鉴别非小细胞肺癌亚型的环状RNA组合物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医药和临床诊断技术领域，具体来说是一种鉴别非小细胞肺癌亚型的环状RNA组合物标志物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的一类重大高危疾病。肺癌的病发率和死亡率在世界范围内都居于所有恶性肿瘤的首位。肺癌是我国的第一大癌症，为癌症防治的重中之重。目前我国肺癌发病率每年增长约26％，如不及时采取有效控制措施，预计到2025年，我国肺癌病人将达到100万，成为世界第一肺癌大国。

肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)是临床中最常见的肺癌病理类型，包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。约占肺癌发病率的85％。受限于缺少高特异性及灵敏度的早期筛查手段，约75％病人确诊时已发生局部或远端转移，由于病变范围广泛，中晚期肺部肿瘤往往难以得到根治，5年生存率仍不足20％。因此，寻找和研发特异性强、灵敏度高的生物标志物对于肺癌的早期诊断具有重大意义。

在人类基因组序列中，只有不到2％是编码序列，其余全为非编码序列，因此大多数转录物是非编码RNA。越来越多的研究表明非编码RNA在生命调控过程、疾病发生发展中都扮演了重要角色。circRNA是一类以共价键结构形成，不具有3'和5'末端头尾结构的非编码RNA，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内。大多数circRNA是由外显子环化而成，也有部分circRNA是由内含子环化而成的套索结构。同时由于circRNA含有大量的miRNA应答原件(MREs)，能与AGO蛋白形成RNA诱导沉默复合体(RISC)的催化核心，最终导致circRNA降解。根据来源，circRNA可大致分为四类∶全外显子型的circRNA，内含子和外显子组合的EIcircRNA，内含子组成的套索型ciRNA，由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRNA。

circRNA的异常表达会导致包括癌症在内的多种疾病的发生。现有研究表明circRNA从表观遗传调控、增殖、凋亡、转移、DNA损伤修复、信号转导等途径参与了肿瘤发生发展的全过程，可作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物，在临床诊断和治疗方面有广阔的应用前景。

对于现有技术中，也提出了通过环状RNA进行肺癌诊断以及治疗的作用，如专利号为202010227453.3的中国专利“一种环状RNA及其应用”，给出了通过改变环状RNA circ_0058040的表达对非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡以及药物敏感性等产生影响，说明降低环状RNA circ_0058040表达能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖，增强其对靶向药物的敏感性，但是没有说明哪种基因可以对肺癌生物标志物进行准确检测检测。而专利号为CN202010654555.3的“一种检测NSCLC的诊断试剂盒及其使用方法与应用”其中虽然给出了hsa_circ_0069841基因能够检测NSCLC的生物标志物，但是没有办法对肺癌的具体类型进行分辨，而具体针对于NSCLC，鳞癌和腺癌的组织学来源、细胞生长速度、出现转移的快慢以及治疗方式均是完全不同的。因此，对于患者来说，依然缺乏一种快速有效的技术手段，来区分鳞癌和腺癌，以便医生更好的制定治疗方案。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题中现有技术的不足，提供一种能够鉴别非小细胞肺癌亚型的环状RNA组合物标志物及其应用

为了实现上述目的，本发明的第一方面，涉及hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及hsa_circ_001357与hsa_circ_0069841的组合在鉴别肺癌亚型生物标志物中的应用。

上述hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841的组合在鉴别肺癌亚型生物标志物中的应用，作为一种优选的实验方案，所述hsa_circ_001357的的基因序列如下：

TCTTCCGTGTGTGCTAAGATCGTGCAGCTCCTGGGGCAGAATGAGGTGGACTATCGCCAGAAGCAGGTGGTCATCCTGAGCCAGGATAGCTTCTACCGTGTCCTTACCTCGGAGCAGAAGGCCAAAGCCCTGAAGGGCCAGTTCAACTTTGACCACCCGGATGCCTTTGACAATGAACTCATTCTCAAAACACTCAAAGAAATCACTGAAGGGAAAACAGTCCAGATCCCCGTGTATGACTTTGTCTCCCATTCCCGGAAGGAGGAGACAGTTACTGTCTATCCCGCAGACGTGGTGCTCTTTGAAGGGATCCTGGCCTTCTACTCCCAGGAGGTACGAGACCTGTTCCAGATGAAGCTTTTTGTGGATACAGATGCGGACACCCGGCTCTCACGCAGAGTATTAAGGGACATCAGCGAGAGAGGCAGGGATCTTGAGCAGATTTTATCTCAGTACATTACGTTCGTCAAGCCTGCCTTTGAGGAATTCTGCTTGCCAACAAAGAAGTATGCTGATGTGATCATCCCTAGAGGTGCAGATAATCTGGTGGCCATCAACCTCATCGTGCAGCACATCCAGGACATCCTGAATGGAGGGCCCTCCAAACGGCAGACCAATGGCTGTCTCAACGGCTACACCCCTTCACGCAAGAGGCAGGCATCGGAGTCCAGCAGCAGGCCGCATTGACCCGTCTCCATCGGACCCCAGCCCCTATCTCCAAGAGACAGAGGAGGG。

本发明的第二方面，提供一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841组合的试剂，所述的试剂为用于扩增hsa_circ_001357的引物对、用于扩增hsa_circ_0069841的引物对和用于扩增U6基因的引物对。

根据上述一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357、及其与hsa_circ_0069841组合的试剂，进一步的，所述用于扩增hsa_circ_001357的引物对包含以下序列：

F:GCATTGACCCGTCTCCATC，

R:CCAGGAGCTGCACGATCTTA。

根据上述一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841组合的试剂，进一步的，所述用于扩增hsa_circ_0069841的引物对包含以下序列：

F:AGACACTGATGGGACTGAGG，

R:GTTGCAAAGCCTCCTCTGTT。

根据上述一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841组合的试剂，进一步的，所述用于扩增U6基因的引物对包含以下序列：

F:CTCGCTTCGGCAGCACA，

R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

本发明的第三方面，提供一种鉴别非小细胞肺癌亚型的试剂盒或基因芯片，包括如上述的一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841的组合的试剂，该试剂为用于增扩hsa_circ_001357的引物对和用于增扩U6基因的引物对。

进一步的，所述试剂还可以为用于增扩hsa_circ_001357的引物对、用于增扩hsa_circ_0069841的引物对和用于增扩U6基因的引物对。

发明的有益效果

本发明所提供的一种鉴别非小细胞肺癌亚型的环状RNA组合物标志物及其应用的优点包括：本发明发现了hsa_circ_0069841不仅可以诊断NSCLC，而且hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357还能单独或组合区分NSCLC组织内的腺癌和鳞癌，可用于鉴别诊断非小细胞肺癌中的肺腺癌与肺鳞癌，有助于对NSCLC亚型进行鉴别诊断，本发明通过设计内参和目的引物，制备成诊断芯片或试剂盒，诊断速度快、成本低、结果准确可靠，为NSCLC患者进行准确的靶向治疗提供了重要依据，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明中通过手术切除NSCLC肺癌配对组织的ROC曲线分析图(N＝100对)；

图2是本发明中通过手术切除NSCLC肺癌配对组织的ROC曲线分析图(N＝100对，其中腺癌N＝69对，鳞癌N＝31对)；

图3是本发明中通过支气管活检样本组织的ROC曲线分析图(N＝90对，其中腺癌N＝52对，鳞癌N＝38对)；

图4是本发明中通过支气管刷检脱落细胞样本的ROC曲线分析图(N＝60对，其中腺癌N＝39对，鳞癌N＝21对)；

图5为8例NSCLC组织及其配对的癌旁组织中差异circRNA热图；

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本市请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本发明的第一方面，涉及hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841的组合在鉴别非小细胞肺癌亚型生物标志物中的应用。作为一种优选的实验方案，所述hsa_circ_001357的基因序列如下：

TCTTCCGTGTGTGCTAAGATCGTGCAGCTCCTGGGGCAGAATGAGGTGGACTATCGCCAGAAGCAGGTGGTCATCCTGAGCCAGGATAGCTTCTACCGTGTCCTTACCTCGGAGCAGAAGGCCAAAGCCCTGAAGGGCCAGTTCAACTTTGACCACCCGGATGCCTTTGACAATGAACTCATTCTCAAAACACTCAAAGAAATCACTGAAGGGAAAACAGTCCAGATCCCCGTGTATGACTTTGTCTCCCATTCCCGGAAGGAGGAGACAGTTACTGTCTATCCCGCAGACGTGGTGCTCTTTGAAGGGATCCTGGCCTTCTACTCCCAGGAGGTACGAGACCTGTTCCAGATGAAGCTTTTTGTGGATACAGATGCGGACACCCGGCTCTCACGCAGAGTATTAAGGGACATCAGCGAGAGAGGCAGGGATCTTGAGCAGATTTTATCTCAGTACATTACGTTCGTCAAGCCTGCCTTTGAGGAATTCTGCTTGCCAACAAAGAAGTATGCTGATGTGATCATCCCTAGAGGTGCAGATAATCTGGTGGCCATCAACCTCATCGTGCAGCACATCCAGGACATCCTGAATGGAGGGCCCTCCAAACGGCAGACCAATGGCTGTCTCAACGGCTACACCCCTTCACGCAAGAGGCAGGCATCGGAGTCCAGCAGCAGGCCGCATTGACCCGTCTCCATCGGACCCCAGCCCCTATCTCCAAGAGACAGAGGAGGG。

本发明的第二方面，提供一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841组合的试剂，所述的试剂为用于扩增hsa_circ_001357的引物对、用于增扩hsa_circ_0069841的引物对和用于扩增U6基因的引物对。

作为优选的实施方案，所述用于扩增hsa_circ_001357的引物对包含以下序列：

F:GCATTGACCCGTCTCCATC，

R:CCAGGAGCTGCACGATCTTA。

作为进一步的优选的实施方案，所述用于扩增hsa_circ_0069841的引物对包含以下序列：

F:AGACACTGATGGGACTGAGG，

R:GTTGCAAAGCCTCCTCTGTT。

作为进一步的优选的实施方案，所述用于扩增U6基因的引物对包含以下序列：

F:CTCGCTTCGGCAGCACA，

R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。

本发明的第三方面，提供一种鉴别非小细胞肺癌亚型的试剂盒或基因芯片，包括如上述的一种检测hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357及其与hsa_circ_0069841的组合的试剂，该试剂为用于增扩hsa_circ_001357的引物对和用于增扩U6基因的引物对；所述试剂还可以为用于增扩hsa_circ_001357的引物对、用于增扩hsa_circ_0069841的引物对和用于增扩U6基因的引物对。

实施例1 circRNA基因芯片分析

收集8例NSCLC(非小细胞肺癌)患者组织及配对癌旁组织，做circRNA基因芯片分析，以log2FC≥1，P<0.05为标准，选取差异的circRNA，结果如图5所示。从图5中可以得出差异最显著的是hsa_circ_0069841，其次是hsa_circ_001357，并且hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357在NSCLC组织中均为高表达。

实施例2

采用RT-qPCR方法检测肺癌配对组织、支气管活检样本组织及支气管刷检脱落细胞中hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357的表达水平。引物序列：

其中，hsa_circ_0069841的引物序列

F:AGACACTGATGGGACTGAGG

R:GTTGCAAAGCCTCCTCTGTT

hsa_circ_001357的引物序列

F:GCATTGACCCGTCTCCATC

R:CCAGGAGCTGCACGATCTTA

U6的引物序列

F:CTCGCTTCGGCAGCACA

R:AACGCTTCACGAATTTGCGT

并绘制受试者工作曲线(ROC曲线)探讨hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357单独及联合诊断NSCLC，以及区分腺癌和鳞癌的敏感度及特异度。

具体实验如下：

手术切除NSCLC(非小细胞肺癌)配对组织的ROC曲线分析，样本数量为100对。

收集100对NSCLC患者组织及配对癌旁组织，剪取黄豆粒大小，研磨，抽提RNA，采用RT-qPCR的方法，检测NSCLC组织中hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357，以及hsa_circ_001357和hsa_circ_0069841的组合的相对表达量，并分别绘制ROC曲线并计算AUC的值，算法采用2^ΔΔct法，其中ΔΔct＝癌组织中Δct-癌旁组织中Δct，Δct＝目的基因CT-内参U6CT值，结果如图1所示。从图1中可以得出，在100对NSCLC组织及其配对的癌旁组织中发现hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357和hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357的组合在检测NSCLC组织时均具有较高的特异性和敏感性，因此hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357和hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357的组合均能够对NSCLC组织进行鉴别。

手术切除NSCLC配对组织的ROC曲线分析，样本数量为100对，其中腺癌样本为69对，鳞癌样本为31对，作为训练组。

收集100例NSCLC患者组织及配对癌旁组织，其中腺癌样本为69对，鳞癌样本为31对，剪取黄豆粒大小，研磨，抽提RNA，采用RT-qPCR的方法，检测NSCLC组织中腺癌与鳞癌的hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357以及hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357的相对表达量，并分别绘制ROC曲线并计算AUC的值，算法采用2^ΔΔct法，其中ΔΔct＝癌组织中Δct-癌旁组织中Δct，Δct＝目的基因CT-内参U6CT值，结果如图2所示。从图2中可以得出，hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357和hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357的组合均具有较好的鉴别NSCLC组织中的鳞癌和腺癌的效果。

通过上述手术切除NSCLC配对组织作为训练组建立鉴别模型，并获取鉴别方程，接下来通过验证组对鉴别模型及鉴别方程进行验证

支气管活检样本组织的ROC曲线分析，样本数量为90对，其中腺癌样本为52对，鳞癌样本为28对，作为验证组。

鉴别活检样本组织中腺癌与鳞癌的hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357以及hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357的组合的相对表达量，并通过鉴别模型及鉴别方程绘制ROC曲线，并计算AUC的值，结果如图3所示。由图3可知，本鉴别模型可以通过hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357以及hsa_circ_0069841与hsa_circ_001357的组合，来鉴别腺癌与鳞癌，且建立的鉴别模型是准确的。

支气管刷检脱落细胞样本的ROC曲线分析，样本数量为60对，其中腺癌样本为39对，鳞癌样本为N＝21对，作为测试组。

分别绘制测试组支气管刷检细胞样本中hsa_circ_0069841鉴别腺癌与鳞癌的ROC曲线、测试组支气管刷检细胞样本中hsa_circ_001357鉴别腺癌与鳞癌的ROC曲线、测试组支气管刷检细胞样本中hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357联合鉴别腺癌与鳞癌的ROC曲线、测试组支气管刷检细胞样本中hsa_circ_0058040鉴别腺癌与鳞癌的ROC曲线、测试组支气管刷检细胞样本中hsa_circ_0069841和hsa_circ_000058040联合诊断鉴别腺癌与鳞癌的ROC曲线。其中，需要通过RT-qPCR的方法，检测hsa_circ_0058040、hsa_circ_0069841和hsa_circ_000058040的组合检测活检样本组织中腺癌与鳞癌的相对表达量，hsa_circ_000058040的优选引物对为：

F:CGTGAAGCCAGGGAACAAAA；

R：TGCATGCTTTGAAGGAAGAACT。

计算AUC的算法依然采用2^ΔΔct法，其中ΔΔct＝癌组织中Δct-癌旁组织中Δct，Δct＝目的基因CT-内参U6 CT值，如图4所示，分别计算曲线下面积，可见hsa_circ_0069841、hsa_circ_001357、hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357联合鉴别的腺癌与鳞癌的效果相较于hsa_circ_0058040具有更好的鉴别能力，而且如实验数据所示，只有hsa_circ_0069841和hsa_circ_001357联合才具有对于腺癌和鳞癌的鉴别最好的特异性和敏感性。即使是现有技术中对NSCLC细胞的增殖、凋亡以及药物敏感性等产生重要的影响的hsa_circ_0058040基因也无法通过与hsa_circ_0069841联合鉴别NSCLC组织中的腺癌和鳞癌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。