冬凌草甲素在制备治疗高尿酸血症和抗痛风药物中的应用

技术领域

本发明涉及制药技术，属药物化学领域，特别涉及冬凌草甲素在制备治疗高尿酸血症和抗痛风药物中的应用。

背景技术

尿酸(uric acid)即2,6,8-三氧化嘌呤，是人类嘌呤代谢的终产物。血液中的尿酸是黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase from buttermilk，XOD)催化黄嘌呤与次黄嘌呤发生氧化作用生成的，在保护神经细胞、维持血压等方面发挥重要的生理作用。正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症(hypeiuricemia,HUA)，此时尿酸可析出结晶，在组织内沉积，引起组织学改变，导致痛风、痛风性关节炎、痛风肾病等。高尿酸血症常并发心血管疾病，并且与高血压、高脂血症、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、肥胖等密切相关。在我国HUA患病率高达13.3％，近年来，随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，高尿酸血症的患病率呈逐年上升趋势。

目前，临床常用降尿酸药物主要分为抑制尿酸生成及促进尿酸排泄两大类。抑制尿酸生成的药物主要为黄嘌呤氧化酶抑制剂(xanthine oxidase inhibitor，XOI)，主要有别嘌醇，但别嘌醇本身具有嘌呤结构，可能会影响嘌呤代谢、嘧啶代谢中其他酶的活性，并会引起肝肾损伤、过敏、骨髓移植等不良反应，在一定程度上抑制了其在临床上的使用。非布司他是选择性非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，可特异性抑制还原型及氧化型的黄嘌呤氧化酶，相较于别嘌醇，非布司他降尿酸效果更好且安全性更高，但其也被报道出具有肝功能异常、胃肠道反应、关节痛等不良反应。促进尿酸排泄的药物有丙磺舒、苯溴马隆等，作用于肾近曲小管的尿酸盐转运体，从而抑制尿酸的吸收。但是研究发现丙磺舒、苯溴马隆具有胃肠道反应、肾绞痛及激发痛风急性发作等副作用。所以，目前上市的降尿酸药物有限，且毒副作用明显，患者的依从性较差。因此，选用中药宝库中毒副作用小的成分发展新型的具有靶向作用的高效低毒的降尿酸药物具有重要作用和意义。

冬凌草属于唇形科植物，是河南的道地药材，盛产于河南太行山脉，是上个世纪八十年代初河南省从民间发掘出来的一种植物药，具有清热去火、疏通气血，缓解疼痛的功效。根据报道，在河南济源当地，民间用冬凌草煮茶用于治疗咽喉肿痛。研究表明，冬凌草具有显著的抗炎活性，而抗炎的活性主要来自于其中的二萜类化合物，特别是冬凌草甲素(Oridonin)。冬凌草甲素，是首个从冬凌草中提取得到的四环二萜类化合物，具有良好的抗炎活性和抗肿瘤活性。据报道，冬凌草甲素对二十多种常见的肿瘤细胞具有抑制作用，包括：食管癌、胰腺癌、肝癌等。目前，应用冬凌草甲素作为药效成分预防和/或治疗高尿酸血症和痛风还未见报道。

发明内容

基于发明人的偶然发现，本发明提供了冬凌草甲素作为唯一有效成分或主要有效成分用于制备治疗高尿酸血症和抗痛风药物的新用途。

为实现以上目的，本发明提供了如下技术方案：

冬凌草甲素在制备治疗高尿酸血症和抗痛风药物中的应用。冬凌草甲素的分子式C

进一步地，冬凌草甲素在制备治疗高尿酸血症和抗痛风药物中的用途，冬凌草甲素在小鼠中的应用量按10mg/kg体重量灌胃给药。

主要以雄性昆明小鼠为实验对象，通过酵母粉及氧嗪酸钾诱导高尿酸血症模型，中药提取物冬凌草甲素灌胃给药进行干预，验证冬凌草甲素在治疗高尿酸血症和抗痛风中的用途。结果表明：与模型对照组相比，冬凌草甲素给药组小鼠血清尿酸水平下降，肝脏组织中的黄嘌呤氧化酶活性降低；与生理盐水组相比，冬凌草甲素给药组小鼠的肝功能酶和肾功能酶的水平无明显变化。因此，冬凌草甲素具有治疗高尿酸血症和抗痛风的作用，对肝、肾无明显毒性，可用于制备治疗高尿酸血症和抗痛风的药物。

作为治疗高尿酸血症和抗痛风药物，其包含冬凌草甲素，可以为仅含冬凌草甲素的单一组分药物，也可以为含冬凌草甲素的药物组合物。其中，含冬凌草甲素的药物组合物包括冬凌草甲素以及与冬凌草甲素同时施用后对治疗高尿酸血症和抗痛风有积极作用的药物成分和/或使冬凌草甲素稳定性提高的药学上可接受的成分和/或制药学上可接受的辅助成分。

本发明所提供的治疗高尿酸血症和抗痛风药物，其剂型可以为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液、悬浮液或注射液等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将冬凌草甲素用于制备治疗高尿酸血症和抗痛风的药物，其可降低小鼠血清尿酸水平，抑制肝脏组织中黄嘌呤氧化酶活性，治疗高尿酸血症和抗痛风效果显著，且用量小，对肝、肾无明显毒性等优点。为冬凌草甲素开拓了新的用途，更为改善目前抗痛风病药物副作用大的现象提供了新的方向。

附图说明

图1为冬凌草甲素对小鼠血清尿酸水平的降低作用示意图。

图2为冬凌草甲素对小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的抑制作用示意图。

图3为冬凌草甲素对小鼠血清肝功能酶(AST、ALT)、肾功能酶(CRE-E、BUN)水平变化的作用示意图。其中，图A为小鼠血清中谷草转氨酶(AST)水平统计图；图B为小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)水平统计图；图C为小鼠血清中肌酐(CRE-E)水平统计图；图D为小鼠血清中尿素(BUN)水平统计图。

图4为冬凌草甲素与黄嘌呤氧化酶蛋白(2CKJ)的分子对接模拟示意图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明的目的、技术方案、优点，下面将结合具体实施方式对本发明进一步详细说明，但本发明不限于以下实施例。

下述实施方式中，未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可，百分含量没特别说明均为质量百分含量。

试验方法

药物来源：药物冬凌草甲素购自西安昊轩生物科技有限公司，纯度>98％；药物非布司他购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98％；氧嗪酸钾购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，纯度>98％；酵母粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

药物配制：冬凌草甲素使用0.5％CMC-Na配制成1mg/mL浓度的混悬液；酵母粉使用生理盐水配制成3g/mL的混悬液；氧嗪酸钾使用0.5％CMC-Na配制成25mg/mL的混悬液；非布司他(阳性保护药)使用0.5％CMC-Na配制成4mg/mL浓度的混悬液。

动物饲养：健康雄性昆明小鼠40只，体重为18-20g，由河南省动物实验中心提供，许可证号：SCXK(豫)2017-0001。饲养环境SPF级，设独立进回风净化笼具(IndividalVentilation Cages，IVC)，恒温(22±2℃)，恒湿(55±15％)，每12小时明暗交替，每5只小鼠一笼，饮用高压灭菌水，小鼠自由进食、水。

给药方式：冬凌草甲素(10mg/kg)、非布司他(40mg/kg)、酵母粉(30g/kg)、生理盐水采用灌胃的给药方式，氧嗪酸钾(250mg/kg)采用腹腔注射的给药方式。

实施例1

冬凌草甲素对酵母粉及氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症的影响。

健康雄性昆明小鼠40只，体重为18-20g，由河南省动物实验中心提供。小鼠于河南省郑州大学药学院SPF级动物房适应性饲养一周，采用随机数字表法分为4组，每组10只小鼠，具体如下：

1、正常对照组；

2、模型对照组；

3、冬凌草甲素组；

4、阳性对照药组。

适应期结束之后开始给药，每天上午灌胃两次。首先，模型对照组，冬凌草甲素组，阳性对照药组采用酵母粉灌胃(30g/kg)，正常对照组给予等量的生理盐水灌胃；1h后，冬凌草甲素组给予冬凌草甲素灌胃(10mg/kg)，阳性对照组给与非布司他灌胃(40mg/kg)，模型对照组和正常对照组给予等量的0.5％CMC-Na灌胃。连续七天，并且每天称量、记录小鼠体重。

第七天上午两次灌胃结束1h后，模型对照组，冬凌草甲素组，阳性对照药组腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/kg)，正常对照组腹腔注射等量0.5％CMC-Na。

腹腔注射1h后，进行摘眼球取血。将所得血液室温静置半小时，于3500r离心5min，保留上清液，得到血清。使用全自动生化分析仪(BX4000)测定血清尿酸水平、肝功能酶(ALT、AST)以及肾功能酶(BUN、CRE-E)的水平。摘取小鼠肝脏和肾脏，并用PBS溶液清洗，滤纸吸干水分，于-80℃冰箱保存。

称取50mg肝脏组织，并使用提前于冰箱中预冷的生理盐水(0.9％)进行匀浆，4℃，12000rpm，离心10min，保留上清液，参照试剂盒说明书(比色法，货号A002-1-1)测定黄嘌呤氧化酶的酶活力。

通过在RCSB蛋白质数据库获得黄嘌呤氧化酶的蛋白结构(2ckj)，使用CorrSite程序搜索2ckj的所有的结合位点，以预测冬凌草甲素的可能结合位点，并计算Z值和结合位点的药用性。在AutoDock-4.2软件中输入冬凌草甲素和黄嘌呤氧化酶蛋白后进行分子模拟对接。最后通过PyMol-1.6.x软件得到冬凌草甲素与黄嘌呤氧化酶结合的三维结构图像。

统计分析方法：

实验结果用均值±SE表示，两个样本平均数比较用t检验。

结果如表1及图1所示，与正常对照组相比，模型对照组中小鼠血清尿酸水平显著性升高(P＜0.05)，表明造模成功。冬凌草甲素组中小鼠血清的尿酸水平与模型对照组相比，由26.62±2.63降低至12.39±2.65(P＜0.05)，表明冬凌草甲素具有良好的降尿酸药效。

结果如表2及图2所示，与正常对照组相比，模型对照组中小鼠肝脏中XOD的活性显著性升高(P＜0.05)，冬凌草甲素组中小鼠肝脏中XOD活性与模型对照组相比，由14.37±2.11降低至10.21±2.88(P＜0.05)，表明冬凌草甲素通过抑制XOD的活性从而发挥良好的降尿酸作用。

结果如图3中A所示，与正常对照组相比，模型对照组的ALT水平显著性升高(P＜0.01)，表明高尿酸血症小鼠可能伴随着肝损伤的发生，而冬凌草甲素可显著性降低由高尿酸血症模型所引起的ALT水平的升高(P＜0.01)；如图3中B-D，正常对照组和冬凌草甲素组小鼠血清的AST、BUN、CRE-E水平均无显著性差异。表明冬凌草甲素对肝、肾功能无影响，且具有肝脏保护的潜力。

采用AutoDock-4.2软件对冬凌草甲素和黄嘌呤氧化酶蛋白进行分子模拟对接的结果显示，得分最低的结合位点为cavity 5(得分为-5.066)。结果如图4所示，冬凌草甲素结构中的酮羰基可与SER-1081和GLN-1041形成氢键，羟基可与ARG-913形成氢键，因此，冬凌草甲素可能通过氢键与蛋白质2ckj的cavity5进行结合，从而抑制XOD的酶活性。

表1冬凌草甲素对氧嗪酸钾和酵母粉诱导高尿酸血症小鼠血清中尿酸水平的影响

注：#：与正常对照组相比，P<0.05；##：与正常对照组相比，P<0.01

*：与模型对照组相比，P<0.05,**：与模型对照组相比，P<0.01。

表2冬凌草甲素对氧嗪酸钾和酵母粉联合诱导高尿酸血症小鼠肝脏XOD活性的影响

注：#：与正常对照组相比，P<0.05；##：与正常对照组相比，P<0.01

*：与模型对照组相比，P<0.05,**：与模型对照组相比，P<0.01。