一种停滞棒杆菌的高效转化方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体为一种适用于停滞棒杆菌的高效转化方法。

背景技术

停滞棒杆菌是一种天然存在野生型棒杆菌属，具有直接转化很多嘌呤衍生物生成相应核苷酸的能力，而且它的各种营养缺陷性突变体能够分段合成或者接途径积累各种核苷酸衍生物，例如积累肌苷、肌苷酸、鸟苷酸、黄苷酸、ATP、 GTP以及NAD和FAD等的能力较为突出。随着多个重要的工业微生物基因组测序工作的完成以及对相关遗传信息整理、基因功能注释的不断完善，加快了基因克隆和转化的进程，也大大促进了代谢工程的应用，逐步完善传统的诱变育种，并在此基础上进一步发展多方位的核苷酸产生菌的育种手段。停滞棒杆菌是核苷酸工业化生产的优良菌株，而代谢工程改良工业生产菌株是提高核苷酸产量的有效途径，越来越多的现代生物学手段被应用于代谢工程的研究，同源重组介导的基因整合技术便是其中之一。然而，工程菌株的构建通常需要将目的基因片段整合到宿主细胞的基因组上，便于通路修饰和稳定遗传。工程菌株的构建可通过基因组编辑技术来实现，而这种这种“易操作、多位点修饰”的基因组编辑技术依赖于较高的转化效率。目前实验室常用的转化方法有化学法、热激法和电转法的转化效率较低。

发明内容

针对上述技术缺陷，本发明提供一种适用于停滞棒杆菌的高效转化方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种停滞棒杆菌的高效转化方法，步骤如下：

(1)活化菌株，制备种子液；

(2)控制起始OD

(3)将上述步骤所得菌液倒入灭菌的50mL离心管中，冰浴14～15min 2600g，3.5～4.5℃离心9～11min，弃上清液；

(4)取预冷的10％甘油45～50mL倒入步骤3的菌液，充分悬浮菌体，2600g， 3.5～4.5℃离心9～11min，弃上清液；

(5)用400～500μL预冷的10％甘油倒入步骤4的菌液重悬细胞，分装于预冷的1.5mL EP管中，每管分装90μL,用于下一步的转化；

(6)取红色荧光蛋白的启动子质粒Peftu-mcherry与上述的感受态细胞混匀，冰浴5～10min；

(7)将红色荧光蛋白的启动子质粒Peftu-mcherry与感受态细胞的混合物转移预冷的1cm电击杯中，1.8KV、5ms、连续电击5次后，转移至含无抗生素液体的恢复培养基的离心管内，45～47℃，热水浴6～8min；

(8)31～33℃，250rpm震荡培养所用的时间为2～3h；

(9)将得到的全部菌液涂布于BHISG+Kan/LBHIS+Kan的固体平板上，31～ 33℃，震荡培养5-6天获得转化细胞。

(10)随机挑选转化子进行鉴定。

进一步：在上述停滞棒杆菌的高效转化方法中，步骤(1)中用于停滞棒杆菌菌株活化的培养基(BHISG)为：脑心浸液37g/L，山梨醇9.1g/L，葡萄糖10g/L。配制好后分装5mL于50mL的三角瓶中，115℃，20min灭菌，常温保存。

所述步骤(6)所述步骤(6)中红色荧光蛋白的启动子质粒Peftu-mcherry 用量为1μg；冰浴时间为6-8min。

所述步骤(7)中电转化条件为1.8KV、5ms、连续电击3次，所用电击缓冲液为10％甘油；

所述最优恢复培养基为LBHIS，其组成为酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L， NaCl 5g/L，脑心浸液18.5g/L，山梨醇91g/L。配制好后分装5mL于50mL 的三角瓶中，115℃，20min灭菌，常温保存。

所述步骤(8)中感受态细胞恢复震荡培养所用的时间为3h；

所述步骤(9)中所述的固体平板为LBHIS+Kan：酵母粉2.5g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl5g/L，脑心浸液18.5g/L，山梨醇91g/L，卡那霉素25mg/mL。配制好后分装250mL的三角瓶中，115℃，20min灭菌，常温保存。

所述步骤(2)中所述的优化后感受态培养基为：基本培养基加入适当浓度的甘氨酸和吐温80，其中，

基本培养基所包括的组成成分及浓度分别为：一水葡萄糖粉50-70g/L，酵母膏5-8g/L，玉米浆干粉0.5-1g/L，硫酸铵2-5g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，鸟嘌呤0.1-0.5g/L，维生素B1 0.001-0.005g/L，硫酸亚铁0.01-0.03g/L，硫酸镁0.5-1g/L，生物素0.001-0.002g/L。配制好后分装5mL于50mL的三角瓶中，115℃，20min灭菌，常温保存。

所述甘氨酸和吐温80在优化后的感受态培养基的浓度分别为36-40g/L和 1-3mL/L。在微生物长到那个OD点后，需要加入这两种合适浓度的物质(类似表面活性剂的作用)来弱化细胞壁，提升电转试验成功率。

所述感受态培养基优化方法为：以基本培养基作为对照，所包括的组成成分及浓度分别为：一水葡萄糖粉50-70g/L，酵母膏5-8g/L，玉米浆干粉0.5-1g/L，硫酸铵2-5g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，鸟嘌呤0.1-0.5g/L，维生素B1 0.001-0.005g/L，硫酸亚铁0.01-0.03g/L，硫酸镁0.5-1g/L，生物素 0.001-0.002g/L。分别向基本培养基中加入不同浓度的甘氨酸、吐温80、，配制好后将其分装50mL于500mL的三角瓶中，115℃，20min灭菌，常温保存；不同浓度的感受态培养基制备完成。

分别将停滞棒杆菌种子液接种于含不同浓度的上述感受态培养基中，控制起始OD

将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，冰浴放置20min；4℃、2600g，离心10min，去上清，收集菌体；用预冷的10％甘油30mL重悬菌体，重复本步骤 2次；

用400～500μL预冷的电击缓冲液10％甘油重悬细胞，分装于预冷的1.5mL EP管中，每管分装90μL,，得到感受态细胞混悬液，用于下一步的电击转化。

所述的适用于停滞棒杆菌的高效转化方法，最优参数为：停滞棒杆菌菌株活化培养基为BHISG、感受态培养基为含甘氨酸36g/L、吐温80 1mL/L的基本培养基、恢复培养基为LBHIS。感受态细胞的OD

与现有技术相比，本发明的适用于停滞棒杆菌的高效转化方法，重点对感受态培养基中甘氨酸、吐温80的浓度进行优化，确定最适的感受态培养基。同时对电转缓冲液、电转参数、电场强度、点击时间和电击次数进行优化，从而提高停滞棒杆菌的转化效率。即本发明主要对停滞棒杆菌电转化条件进行系统优化，通过对培养基、电场强度等因素的系统优化，提高转化效率，从而实现对停滞棒杆菌基因组的编辑，达到构建目标工程菌的目的。培养基的组成及菌株的生长状态是影响工业菌株感受态性能的关键因素，也是影响电转化效率的主要方面。其中培养基中使用的甘氨酸是目前普遍用于细胞培养过程细胞壁弱化成分，这可能是由于用甘氨酸代替I-丙氨酸和D-丙氨酸以整合到四肤中，从而减少细胞壁结构的肤聚糖层的交联。其他细胞壁形成抑制剂吐温、异烟肼等，则一定程度上促使细胞壁的合成部分受阻，增加细胞质膜的流动性(异烟肼影响的是棒杆菌属特有的分支酸层，对其他没有分支酸的菌株来说不一定有效)，从而提高其电转化效率。当OD

附图说明

说明书附图

图1是不同质粒用量，停滞棒杆菌所得转化率曲线图；

图2是不同电击时间，停滞棒杆菌所得转化率曲线图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下操作中，未做详细说明的，均可按照分子生物学实验手册进行。

实施案例1

不同质粒用量的转化实验

(1)取OD

(2)取相应质量的Peftu-mcherry质粒(分别为0.1μg、0.3μg、0.6 μg、1μg、1.3μg、1.6μg、2μg、2.3μg、2.6μg、3μg)加入含90μL上述感受态细胞的1.5mL离心管中，轻轻混匀，冰浴6min；

(3)将上述冰浴后的感受态细胞与Peftu-mcherry质粒的混合物物转移预冷的1cm电击杯中，1.8KV、5ms、连续电击3次后，转移至含1mL无抗生素液体的恢复培养基LBHIS的2mL离心管内，46℃热水浴6-8min；

(4)32℃，250rpm震荡培养3h；

(5)将得到的全部菌液涂布于LBHIS+Kan的固体平板上，32℃，震荡培养5-6天左右获得转化细胞；统计并计算转化率。

(6)转化率(cfu/μg)＝菌落数(cfu)/质粒用量(μg)；

(7)每一实验水平重复三次。

不同质粒用量所得转化率结果如图1所示，分别为：40cfu/μg、68cfu/ μg、163cfu/μg、331cfu/μg、280cfu/μg、271cfu/μg、220cfu/μg、160cfu/ μg、150cfu/μg、145cfu/μg，其中质粒用量达到1μg时转化率最高为331cfu/ μg。

实施案例2

电转化条件摸索的转化实验

(1)取OD

(2)取1μg Peftu-mcherry质粒加入含90μL上述感受态细胞的1.5mL 离心管中，轻轻混匀，冰浴6min；

(3)将上述冰浴后的感受态细胞与Peftu-mcherry质粒的混合物物转移预冷的1cm电击杯中，在电击强度1.8kv、电击时间分别为1ms、3ms、5ms、 7ms、9ms下连续电击5次，转移至含1mL无抗生素液体的恢复培养基LBHIS的 2mL离心管内，46℃，热水浴6-8min；

(4)32℃，250rpm震荡培养3h；

(5)将得到的全部菌液涂布于LBHIS+Kan的固体平板上，32℃，震荡培养5-6天左右获得转化细胞；统计并计算转化率。

(6)转化率(cfu/μg)＝菌落数(cfu)/质粒用量(μg)；

(7)每一实验水平重复三次。

不同电击时间(1ms、3ms、5ms、7ms、9ms)所得转化率结果如图2所示，分别为：107cfu/μg、198cfu/μg、331cfu/μg、295cfu/μg、86cfu/μg，其中质粒用量1μg、电击强度1.8kv、电击时间5ms、连续电击3次时转化率最高为331cfu/μg。

显然，本发明实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。