人Circ-DNAH14在非小细胞肺癌中的应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及人Circ-DNAH14在非小细胞肺癌中的应用及试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

肺癌是我国最常见、且在癌症总发病率和死亡率位居第一的癌症，肺癌的总体生存率不足20％，尤其是中晚期肺癌患者5年生存率不足5％。而早期肺癌经过手术治疗效果较好，IA期肺癌手术治疗后5年生存率可达到77％-92％，更早期的原位腺癌或微浸润腺癌5年生存率接近100％。因此，早诊断、早治疗是提高肺癌治愈率的有效手段，肺癌在组织学类型上可分为非小细胞肺癌(约占85％)和小细胞肺癌(约占15％)。

环状RNA(CircRNA)是一种新类型的广泛存在且具有组织特异性、较线性RNA更稳定和高表达的内源性非编码RNA，一些环状RNA作为竞争性内源RNA吸附miRNA，可调节RNA结合蛋白，并且可调控靶基因可变剪切和转录过程。大量研究证实了CircRNA在多种疾病中发挥重要作用，且与肿瘤的增殖、侵袭和转移相关，CircRNAs有巨大潜力成为新的疾病诊断标志物和治疗靶点，CircRNAs在多种人类癌症中表达失调，包括喉鳞状细胞癌，胃癌，肝癌，结直肠癌，胰腺癌，非小细胞肺癌等。CircRNAs已被证明是一种潜在的新型生物标志物，有望应用于多种癌症的早期检测和筛查。

发明内容

针对现有技术中环状RNA在疾病诊断中的重要作用，本发明提供了人Circ-DNAH14在非小细胞肺癌中的应用及试剂盒。

本发明的技术方案如下：

人Circ-DNAH14在制备非小细胞肺癌诊断产品中的应用。

根据本发明优选的，所述应用中Circ-DNAH14为非小细胞肺癌的生物标志物。

根据本发明优选的，所述Circ-DNAH14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌诊断产品用于非小细胞肺癌的诊断，或鉴别非小细胞肺癌的良恶性。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌诊断产品包括特异性识别Circ-DNAH14的物质。

进一步优选的，所述特异性识别Circ-DNAH14的物质选自特异性扩增Circ-DNAH14的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增Circ-DNAH14的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌诊断产品的检测样本选自组织、或血浆。

特异性识别Circ-DNAH14的物质在制备非小细胞肺癌诊断产品中的应用。

根据本发明优选的，所述特异性识别Circ-DNAH14的物质选自特异性扩增Circ-DNAH14的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增Circ-DNAH14的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

一种非小细胞肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别Circ-DNAH14的物质。

根据本发明优选的，所述特异性识别Circ-DNAH14的物质选自特异性扩增Circ-DNAH14的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增Circ-DNAH14的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。

本发明有益效果有：

1.本发明研究发现，Circ-DNAH14是在非小细胞肺癌组织中较癌旁正常组织表达量明显升高，本发明以Circ-DNAH14为非小细胞肺癌的生物标志物，提出了Circ-DNAH14在非小细胞肺癌中的用途，尤其是在制备非小细胞肺癌诊断产品中的应用。本发明研究表明，较高的Circ-DNAH14表达量可能提示所述对象患非小细胞肺癌的可能性增加，或者可能提示非小细胞肺癌预后不佳。

2.本发明设计了特异性扩增Circ-DNAH14的引物对，可特异性有效检测Circ-DNAH14。

附图说明

图1为特异性扩增Circ-DNAH14的引物对与Circ-DNAH14的相对位置示意图；

图2为特异性扩增Circ-DNAH14引物对的PCR产物凝胶电泳图(左图)及PCR产物测序结果图(右图)；

图3为非小细胞肺癌组织(Tumor)和癌旁正常组织(Normal)中Circ-DNAH14的相对表达量柱状图；

图4为肺部正常上皮细胞和非小细胞肺癌细胞系中Circ-DNAH14的相对表达量柱状图；

图5为正常人(Normal)与非小细胞肺癌患者(Tumor)血浆中Circ-DNAH14的ΔCT值对比图；

图6为正常人与非小细胞肺癌患者血浆中Circ-DNAH14的ROC曲线。

具体实施方法

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例内容是经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。

试剂：Circ-DNAH14筛查引物由生工生物工程(上海)股份有限公司青岛项目部合成；Trizol试剂(货号DP424)、lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR202)、Nuclease-FreeWater(货号251D)、荧光定量检测试剂盒(货号FP402)购自TIANGEN；氯仿(货号20100927)购自北京化工；异丙醇(货号120503D)购自西陇化工；乙醇(货号101860)购自北化经销。

本发明人利用RNA-seq(Ribo-free)对非小细胞肺癌组织及癌旁正常组织(各7例)中CircRNA表达谱检测，非小细胞肺癌组织与癌旁正常组织相比，发现29个差异表达基因(Log2Fold change>2，Pvalue<0.05)，其中17个基因表达上调，12个基因表达下调，提示发现的表达差异的CircRNAs在非小细胞肺癌发生过程中可能具有潜在的生物学功能。其中Circ-DNAH14是在非小细胞肺癌组织中表达升高变化最明显的CircRNA。通过数据库和文献(circBase)发现Circ-DNAH14为起源于DNAH14基因的CircRNA。

Circ-DNAH14长863bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，位于人类一号染色体225140371-225161855，DNAH14是其母基因。

实施例1.特异性扩增Circ-DNAH14的引物对

特异性扩增Circ-DNAH14的引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司青岛项目部合成，引物对的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-GCATTTGTTACCTGGAAATTGA-3’(SEQ ID NO.2)，

下游引物R：5’-GTCTTGGTTTTGTCTTGGTTTC-3’(SEQ ID NO.3)，

其中，上述引物对与Circ-DNAH14的相对位置示意图如图1所示。

以Circ-DNAH14为模板，采用上游引物F和下游引物R进行PCR扩增，验证引物对的准确性，实验方法如下：

1)RNA提取

将A549细胞接种于2cm细胞培养皿中，加入1mL Trizol试剂室温混匀后静置裂解5-10min。收集于1.5mLRNase-Free离心管中，加入200μL氯仿试剂，涡旋振荡15-30s，静置2-3min。13000rpm、4℃离心15min。小心移取上清400μL转移至新的RNase-Free 1.5mL离心管中并加入400μL异丙醇，室温沉淀10min。13000rpm、4℃离心15min，小心弃掉上清，保留沉淀。预冷的75％乙醇洗涤沉淀，5000rpm离心5min，重复75％乙醇洗涤一遍，弃洗涤液，通风橱晾干10-15min，30μLRNase-free水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入5×gDNA buffer 2μL到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)PCR获取Circ-DNAH14扩增产物

PCR的反应体系如下：

PCR程序如下：

94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min；4℃保持。

4)琼脂糖凝胶电泳及核酸胶回收

配置2％琼脂糖凝胶于TAE缓冲液中，取5μL上述PCR产物样品加入DNA上样缓冲液，120V进行电泳，在紫外切胶仪上进行切割，目的片段长度165bp，之后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGENDP219-02)进行胶回收，所得核酸产物于通风橱晾干10-15min，无酶水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。送由公司测序鉴定，测序引物为SEQ IDNO.3。

琼脂糖凝胶电泳及桑格尔测序结果如图2所示，由实施例1中SEQ ID NO.2以及SEQID NO.3引物对PCR所得核酸片段测序结果与circBankCirc-DNAH14序列一致。

实施例2.检测Circ-DNAH14基因在非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中的表达

本实施例取7例非小细胞肺癌病人的肺癌组织和癌旁正常组织，由山大二院胸外科提供。

1)RNA提取

称取1g冷冻新鲜组织，液氮研磨后，转移至1.5mL RNase-free的离心管中，加入1mL Trizol试剂室温混匀后静置裂解5-10min。加入200μL氯仿试剂，涡旋振荡15-30s，静置2-3min。13000rpm、4℃离心15min。小心移取上清400μL转移至新的RNase-Free 1.5mL离心管中并加入400μL异丙醇，室温沉淀10min。13000rpm、4℃离心15min，小心弃掉上清，保留沉淀。预冷的75％乙醇洗涤沉淀，5000rpm离心5min，重复75％乙醇洗涤一遍，弃洗涤液，通风橱晾干10-15min，RNase-free水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入5×gDNA buffer 2μL到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)qRT-PCR检测Circ-DNAH14基因表达量

采用荧光定量检测试剂盒进行qRT-PCR，检测Circ-DNAH14基因表达量，qRT-PCR的反应体系如下：

离心机1000rpm离心1min；将样品放置入qRT-PCR仪(QuantStudio 3)中运行，qRT-PCR程序如下：

95℃3min；95℃15s，55℃30s，72℃30s，40个循环。

检测结果如图3所示，实验结果表明Circ-DNAH14在非小细胞肺癌病人的肺癌组织和癌旁正常组织中的表达差异较大，其中肺癌组织相对于癌旁正常组织上调两倍以上的病人为6/7，其中5/7的病人上调倍数在5倍以上，4/7的病人上调在10倍以上。

实施例3.检测Circ-DNAH14基因在肺部正常细胞和非小细胞肺癌细胞系中的表达

本实施例取人正常肺上皮细胞系BEAS-2B，非小细胞肺癌细胞系A549、1299、460细胞。

1)RNA提取

将四株细胞分别接种于2cm细胞培养皿中，加入1mL Trizol试剂室温混匀后于冰上静置裂解5-10min。收集于1.5mLRNase-Free离心管中，加入200μL氯仿试剂，涡旋振荡15-30s，静置2-3min。13000rpm、4℃离心15min。小心移取上清400μL转移至新的RNase-Free1.5mL离心管中并加入400μL异丙醇，室温沉淀10min。13000rpm、4℃离心15min，小心弃掉上清，保留沉淀。预冷的75％乙醇洗涤沉淀，5000rpm离心5min，重复75％乙醇洗涤一遍，弃洗涤液，通风橱晾干10-15min，RNase-free水溶解。Nanodrop测算所得粗提液的OD值以及浓度。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入5×gDNA buffer 2μL到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)qRT-PCR检测Circ-DNAH14基因表达量

采用荧光定量检测试剂盒进行qRT-PCR，检测Circ-DNAH14基因表达量，qRT-PCR的反应体系如下：

离心机1000rpm离心1min；将样品放置入qRT-PCR仪(QuantStudio 3)中运行，qRT-PCR程序如下：

95℃3min；95℃15s，55℃30s，72℃30s，40个循环。

检测结果如图4所示，实验结果表明由实施例1中SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3引物对进行qRT-PCR，与正常肺上皮细胞系相比，非小细胞肺癌细胞系中Circ-DNAH14显著增加。

实施例4.检测Circ-DNAH14基因在正常人与非小细胞肺癌患者血浆中的表达

本实施例取12例非小细胞肺癌患者术前和14例正常人全血，由山大二院提供，使用EDTA抗凝血或柠檬酸盐抗凝血采血管采取2-3mL全血，混匀后放于4℃、3000rpm离心10min，小心吸取上层血浆到新的尖底离心管，4℃、4000rpm离心15min，小心吸取上清到新的离心管中。

1)RNA提取

取上述血浆500μL按照TIANGEN(DP501)total RNA提取分离试剂盒说明书提取RNA。

2)cDNA逆转录

首先，配制DNA去除体系混合物：1μg RNA加入5×gDNA buffer 2μL到0.2mLPCR管中，加入RNase-freeWater补充至10μL，彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min，快速放在冰上2min。

采用lncRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA逆转录，反应体系如下：

42℃孵育15min，95℃孵育3min，4℃保温，得cDNA。

3)qRT-PCR检测Circ-DNAH14基因表达量

采用荧光定量检测试剂盒进行qRT-PCR，检测Circ-DNAH14基因表达量，qRT-PCR的反应体系如下：

离心机1000rpm离心1min；将样品放置入qRT-PCR仪(QuantStudio 3)中运行，qRT-PCR程序如下：

95℃3min；95℃15s，55℃30s，72℃30s，40个循环。

检测结果如图5所示，实验结果表明Circ-DNAH14在非小细胞肺癌患者与正常人血浆含量相比，ΔCT值显示显著降低，说明Circ-DNAH14在非小细胞肺癌患者血浆中含量显著升高。

对上述图5实验结果进行ROC分析，结果如图6所示，AUC为0.875，特异性为75％，敏感性85.71％，曲线结果表明在对非小细胞肺癌患者血浆中Circ-DNAH14具有较好的诊断价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 人Circ-DNAH14在非小细胞肺癌中的应用及试剂盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 863

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ccagttcctt tatagttttg ttcagaaaaa catatggaga cgtttatacc cattgatttg 60

acaactgaaa atcaagagat ggacaaggag gaaaccaaga caaaaccaag acttttaaga 120

tatgaagaga aaaaatatga agatgtgaaa ccattagaga ctcaaccagc tgaaatagca 180

gaaaaggaaa cattggaata taaaacagtt agaacattct ctgaatcttt gaagtcagag 240

aaaacagaag attaccttag agaaagtata attcaacaac atatggtttc tccagagcca 300

gcttccctta aggagaaagg gaagtcaagg agaaaaaagg atcaaactca tgcttgtcca 360

aatgttagga aagccaggcc tgtgtcctat gatagaacag aaccaaaaga tgatgatgtg 420

ataagaaata ttattaggct acgagaaaag cttggttggc aaactatatt accgcagcac 480

agtttgaaat acggaagctc caaaattgca attcagaaga ttactttaaa gaaacctttg 540

gaagatgatg gagaatttgt ttattgcctt cctcggaaaa gtcctaaatc cctttacaat 600

ccatatgatc ttcaggtagt atcggctcat actgctaaac attgcaaaga attttgggtt 660

attactgctt catttatctc aaaggttatt aatatagttg gtagtgtaaa ggaagtagaa 720

ctcataccta ctttggaatg gctatcagaa agaagacatt actatttatt acggcaattc 780

aagatatttt ctgatttccg aatgaataaa gcatttgtta cctggaaatt gaatgttaaa 840

agaattaaga cagagaagag cag 863

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcatttgtta cctggaaatt ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcttggttt tgtcttggtt tc 22