一种羊X、Y精子分选液、分选浮游体系及分选方法

技术领域

本发明涉及哺乳动物X、Y精子分选技术，具体涉及羊X、Y精子分选液、分选体系及分选方法。

技术背景

在畜牧业生产中，性别控制技术就是通过一定的干预使雌性动物按照人们的意愿生产特定性别的后代。通过性别控制，可以提高畜牧业的经济效益；通过人工授精技术、胚胎移植技术等可避免系列繁殖疾病，从而加快畜禽育种以及繁育进程。羊，例如奶山羊的性别控制是人为控制奶山羊的繁殖过程，主要是对X、Y精子进行有效分离，并用分离后的精子对母羊进行人工授精，从而生产出符合需要性别的奶山羊后代。

流式细胞仪分离法在动物X、Y精子分离上的应用提高了精液的分离效率和分离的准确度，目前国际上基本利用流式细胞仪进行商业化生产动物性控精液。随着科学研究技术水平的发展，研究人员对仪器的喷嘴、电场等系统进行改良，并结合电压调整，在一定程度上提高了分离效率。然而，目前最大问题是利用流式细胞仪生产性控精液仅在奶牛上应用成功，在羊、猪等家畜上难以应用。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明首先提供了一种羊X、Y精子分选液。

为此，本发明所述羊X、Y精子分选液为包括葡萄糖、柠檬酸、番茄红素、柠檬酸钠、EDTA、碳酸氢钠、氯化钾、Tris、BSA和TLR7/8蛋白激动剂的水溶液。

进一步，所述TLR7/8激动剂选自瑞喹莫德R848。

进一步，1L水中含有葡萄糖27～31g/L、柠檬酸0.4～0.8g/L、番茄红素0.2～0.6g/L、柠檬酸钠1.9～2.3g/L、EDTA 0.3～0.7g/L、碳酸氢钠0.9～1.3g/L、氯化钾0.7～1.1g/L、Tris 5.6～6.0g/L、BSA 0.4～0.8g/L和瑞喹莫德R8480.3～1μM。

本发明同时提供了一种羊X、Y精子分选浮游体系。为此，所提供的羊X、Y精子分选浮游体系包括精液稀释洗涤液和权利要求1-3任一权利要求所述的羊X、Y精子分选液，且精液稀释洗涤液和羊X、Y精子分选液各自独立包装。

进一步，所述精液稀释洗涤液是包含Tris、柠檬酸和果糖的水溶液。

进一步，所述精液稀释洗涤液的配方为：100mL水中含Tris 200～300mM，柠檬酸80～90mM和果糖65～75mM。

本发明还提供了一种羊X、Y精子分选方法。为此，所提供的分选方法包括：

采用精液稀释洗涤液对羊精液进行洗涤，离心去上清后得到精液样品；

将精液样品与权利要求1所述分选液混合，合适条件下孵育，得到上下分层的孵育后体系，其中上层液体为含Y精子液体，下层液体为含X精子液体。

进一步还包括，利用精液稀释洗涤液分别对上层液体和下层液体进行洗涤，离心去上清后用精液稀释洗涤液重悬得到Y精子体系和X精子体系。

进一步，所述合适条件为35～38.5℃，孵育15～30min。

本发明能够在羊X、Y精子分选过程中很好地避免因流式细胞仪分离法操作过程繁琐、对精子造成损伤程度较大的不足，能够有效分离奶山羊X、Y精子，且分离效率高，分离准确率高，分离成本低，结果良好、稳定、可靠。

本发明利用羊X、Y精子特异蛋白TLR7/8激动剂R848的“浮游体系”分选羊X、Y精子，分选后的X精子主要集中在浮游体系下方，其中X精子和Y精子的比例分别是80.3％和15.7％；Y精子主要集中在浮游体系上方，其中Y精子和X精子的比例分别是90.5％和9.28％。因此，本发明分选后的X精子比例可达80.3％，Y精子比例可达90.5％。采用本发明分选后的X精子进行体外受精，雌性胚胎比例达到80.52％；采用本发明分选后的X精子进行人工授精，雌性胚胎比例达到88.89％。

附图说明

图1是奶山羊X、Y精子特异蛋白TLR7/8激活分选“浮游体系”示意图。

图2是TLR7在奶山羊睾丸、附睾和精子中的比例与定位，其中a图为TLR7在8月龄奶山羊睾丸中免疫荧光染色定位；b图为TLR7在8月龄奶山羊附睾中免疫荧光染色定位；c图为TLR7在奶山羊精子中免疫荧光染色定位，黄色箭头代表TLR7阳性精子(P)，白色箭头代表TLR7阴性精子(N)；d图为奶山羊睾丸中TLR7阳性/阴性细胞的百分比；e图为奶山羊附睾中TLR7阳性/阴性细胞的百分比；f图为奶山羊精子中TLR7阳性/阴性细胞的百分比。

图3是TLR8在奶山羊睾丸、附睾和精子中的比例与定位，其中a图为TLR8在8月龄奶山羊睾丸中免疫荧光染色定位；b图为TLR8在8月龄奶山羊附睾中免疫荧光染色定位；c图为TLR8在奶山羊精子中免疫荧光染色定位，黄色箭头代表TLR8阳性精子(P)，白色箭头代表TLR8阴性精子(N)；d图为奶山羊睾丸中TLR8阳性/阴性细胞的百分比；e图为奶山羊附睾中TLR8阳性/阴性细胞的百分比；f图为奶山羊精子中TLR8阳性/阴性细胞的百分比。

图4是TLR7/8激动剂抑制奶山羊精子的运动参数，其中a图为精子在R848分选液中37℃孵育1h上层精子的百分比；b图为精子在R848分选液中37℃分别孵育0min、15min、30min、60min、120min上层精子的百分比；c图为CASA检测精子在1μM R848分选液37℃孵育1h的精子运动轨迹，白色箭头表示精子向前运动，黄色箭头表示精子绕圈运动；d图为CASA检测精子活力；e图为CASA检测精子运动平均路径速度(VAP)；f图为CASA检测精子运动平均直线速度(VSL)；g图为CASA检测精子平均曲线速度(VCL)。

图5是TLR7/8激动剂处理后，上层和下层精子中X、Y精子的百分比，其中a图为精子在1μM R848分选液中孵育30min，“浮游体系”上、下层精子的活力、质膜完整性和顶体完整性；b图为SYBR-14/PI双染法检测精子质膜完整性，白色箭头表示质膜完整的精子(即活精子)，黄色箭头表示质膜破损的精子(即死精子)；c图为FITC-PNA染色检测精子顶体完整性，白色箭头表示顶体完整的精子，黄色箭头表示顶体破损的精子；d图为精子在1μM R848分选液中孵育30min，精子特异蛋白TLR8在“浮游体系”上、下层精子中免疫荧光染色定位；e图为流式细胞仪检测“浮游体系”上、下层精子中X、Y精子的百分比。

图6是TLR7/8激动剂通过GSK3α/β-己糖激酶途径抑制糖酵解过程中ATP的产生，其中a图为精子在1μM R848分选液中孵育60min后精子ATP水平；b图为精子在1μM R848分选液中孵育30min“浮游体系”上、下层精子ATP水平；c图为精子在1μM R848分选液中孵育60min后精子线粒体活性；d图为精子在1μM R848分选液中孵育30min“浮游体系”上、下层精子线粒体活性；e图为Western blot检测精子在1μM R848分选液中孵育0min、15min、30min AKT磷酸化、NFκB磷酸化、GSK3α/β磷酸化、总AKT、总NFκB和总GSK3α/β蛋白表达；f图为Westernblot检测精子在1μM R848分选液中孵育30min“浮游体系”上、下层精子AKT磷酸化、NFκB磷酸化、GSK3α/β磷酸化、总AKT、总NFκB和总GSK3α/β表达；g图为精子在1μM R848分选液中孵育0min、15min、30min检测总AKT、总NFκB和总GSK3α/β表达；h图为精子在1μM R848分选液中孵育30min“浮游体系”上、下层精子总AKT、总NFκB和总GSK3α/β表达。

图7是TLR7/8激动剂抑制X精子运动参数，并使体外受精(IVF)和人工授精(AI)的性别预选成为可能，其中a图为分选后X精子体外受精后胚胎性别鉴定，使用SRY-1引物和B-ACTIN-2引物从胚胎中提取DNA双链PCR产物凝胶，Male(Ma)为雄性奶山羊DNA，Female(Fe)是雌性奶山羊DNA；第1、2、3、5、6、7、8和11泳道是雌性胚胎，第4、9和10泳道是雄性胚胎；b图为分选后X精子人工授精后胚胎性别鉴定，第1、2、3、4、5、6、7和9泳道是雌性胚胎，泳道8是雄性胚胎。

图8是TLR7/8信号机制分别影响奶山羊X和Y精子中ATP的产生。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。

除非有特殊说明，本文中的术语根据本领域技术人员常规认识理解。

本发明的分选液是借助TLR7/8蛋白激动剂与合理组分的分选液及分选体系对羊精液中的X、Y精子进行分选。本文中以TLR7/8蛋白的特异性激动剂瑞喹莫德R848为例展开说明，R848(Resiquimod)是一种免疫系统修饰剂，作为Toll-like receptor 7/8(Toll样受体7和Toll样受体8，本文表述为TLR7/8)激动剂，在分选过程中，TLR7/8激动剂R848通过GSK3α/β-己糖激酶途径抑制糖酵解过程中ATP的产生，使X精子运动能力受到抑制，进而使X精子沉积在“浮游体系”下方，而Y精子悬浮于“浮游体系”上方，从而使羊X、Y精子因运动能力不同而得到有效分离。

本发明所述“浮游体系”是指在羊精液分选液基础上，利用X、Y精子特异蛋白TLR7/8激动剂R848，使X精子的运动能力受到抑制而沉积于“浮游体系”下方，而Y精子悬浮于“浮游体系”上方，从而使得奶山羊X、Y精子因运动能力的不同而得到有效分离。

以下是发明人结合附图、具体试验和使用方法，对奶山羊X、Y精子特异蛋白TLR7/8激活分选技术的实施例。

除非另有说明，否则本研究中使用的所有化学药品和试剂均购自Sigma-AldrichChina，R848(TLR7/8配体)购自Novus Biologicals(Littleton,CO,USA)。

实施例1：

该实施例的X、Y精子分选液配方为：葡萄糖27g/L、柠檬酸0.45g/L、番茄红素0.2g/L、柠檬酸钠1.9g/L、EDTA 0.3g/L、碳酸氢钠0.9g/L、氯化钾0.7g/L、Tris 5.6g/L、BSA0.8g/L，超纯水1L。

精液稀释洗涤液配方为：Tris 200mM，柠檬酸80mM，果糖65mM，超纯水100mL。

实施例2：

该实施例的X、Y精子分选液配方为：葡萄糖31g/L、柠檬酸0.8g/L、番茄红素0.6g/L、柠檬酸钠2.3g/L、EDTA 0.7g/L、碳酸氢钠1.3g/L、氯化钾1.1g/L、Tris 6.0g/L、BSA0.5g/L，超纯水1L。

精液稀释洗涤液配方为：Tris 300mM，柠檬酸90mM，果糖75mM，超纯水100mL。

实施例3：

该实施例利用分选浮游体系对奶山羊X、Y精子进行分选，所用羊精液稀释洗涤液配方为：Tris 250mM，柠檬酸85mM，果糖70mM，超纯水100mL；

所用X、Y精子分选液配方为：葡萄糖27.5g/L、柠檬酸0.45g/L、番茄红素0.4g/L、柠檬酸钠2.1g/L、EDTA 0.4g/L、碳酸氢钠1.2g/L、氯化钾0.9g/L、Tris 5.8g/L、BSA 0.4g/L，超纯水1L。

具体分选方法如下：

(1)将精液用3mL精液稀释洗涤液清洗3次(800rpm，5min/次)；之后取3mL精液洗涤液，首先稀释洗涤后的精子样品，其浓度约为1×10

(2)将精子样品沉淀重悬于含0.3μM R848的3mL精液分选液中，随后将精子样品在37℃条件下孵育15～30min；孵育后的体系呈上下分层状，上层液体为含Y精子液体，下层液体为含X精子液体，参考图1所示。

实施例4：

在上述实施例3分选方法基础上，可进一步选择操作的是：在收集上方精子即上层液体(1～1.5mL，图1)后，添加3mL精液稀释洗涤液离心2次(800rpm，5min/次)，去上清后，用精液洗涤液重悬后获得Y精子体系；

并且收集下方的精子即下层液体(1～1.5mL，图1)后，转移至新管，再添加3mL精液稀释洗涤液离心2次(800rpm，5min/次)，去上清后，用精液洗涤液重悬后获得X精子体系。

需要解释说明的是，本发明的上述实施例中的精液稀释洗涤液为发明人提供的相关具体示例，但本发明不限于此，在不违背本发明构思及效果基础上，本领域技术人员在已知的精液稀释洗涤液范围内采用常规的实验手段可选择其他合理的功能液，以与本发明的分选液配合使用对相关羊精液的X、Y精子进行有效分离。

还需要解释说明的是，上述实施例中各组分用量、精液量、精子分选液用量、精液稀释洗涤液所用量、稀释浓度、离心转数、次数和时间等配方量或操作参数为本发明的相关具体示例，但本发明不限于此，本领域技术人员在本发明构思及所公开的内容基础上采用常规的实验手段可选择其他合理的配比关系和操作参数，以对相关羊精液的X、Y精子进行有效分离。

对上述实施例4的分选精子进行如下评价：

采用奶山羊X、Y精子特异蛋白TLR7/8(Toll样受体7和Toll样受体8)激活分选技术，将分选出的精液置于37℃恒温水浴锅孵育，用于奶山羊X、Y精子分选评定。

1.TLR7/8在奶山羊睾丸、附睾和精子中的定位及比例测定

(1)睾丸和附睾收集：手术法收集成年奶山羊睾丸和附睾，并在4％多聚甲醛中固定过夜，然后包埋在石蜡中制作切片；

(2)精液样品收集：精液采集使用假阴道法，采精前确保假阴道内腔适宜的压力和温度；

(3)将精液样品用PBS清洗3次，5min/次，调整精子浓度约为1×10

(4)取30μL精液样品涂抹于多聚赖氨酸处理的玻片，自然干燥，然后放入4％多聚甲醛中固定10min；玻片在通风橱中自然干燥，PBS清洗3次，5min/次；

(5)将用PBS清洗的精液样品置于200μL 0.5％Triton X-100细胞通透溶液中30min；通透完的精液样品再用PBS清洗3次，5min/次；在37℃条件下用5％BSA溶液中封闭30min；

(6)一抗孵育：一抗(TLR7/8)1:100稀释；每个样品添加100μL的稀释抗体，并置于4℃中过夜孵育；孵育完样品PBS清洗3次，5min/次；

(7)二抗孵育：1:200稀释相关荧光二抗(羊抗兔IgG)，并在37℃避光孵育1h；孵育完样品PBS清洗3次，5min/次；

(8)用DAPI进行精子细胞核染色，室温避光孵育1min，PBS清洗3次，5min/次；

(9)使用荧光显微镜对已染色的精子样品进行观察其定位；

(10)通过ImageJ软件进行荧光强度定量分析，计算精子特异蛋白TLR7/8在样品中的百分比。

结果如图2和3所示，图示结果说明：在睾丸、附睾和精子中进行特异蛋白TLR7/8免疫荧光染色，结果显示睾丸、附睾和精子中均能够检测到TLR7和TLR8阳性信号，TLR7阳性率分别为47.57％±1.79％、43.95％±1.02％、46.99％±1.83％；TLR8阳性率分别为47.53％±6.54％、47.54％±1.87％、47.51％±0.33。

2.奶山羊精子运动参数的测定

使用CASA对精子运动参数进行检测分析，操作如下：

(1)取10μL精液样品滴加于预热的载玻片上；

(2)将玻片置于37℃恒温加热板上，使用CASA捕捉精子运动轨迹，0.5s连续拍照45张照片进行追踪精子的运动，通过软件分析其运动数据，从而评估精子运动平均路径速度(VAP)、平均直线速度(VSL)和平均曲线速度(VCL)等指标；

(3)随机选择5个视野进行分析，至少观察分析1000个精子。

图4所示结果说明，精子在0.3～4μM R848分选液中的运动能力显著低于对照组，降低了精子游向“浮游系统”上层。精子在1μM R848分选液中孵育15min后，降低了精子游向“浮游系统”上层。使用CASA分析精子运动参数，表明精子在1μM R848分选液中孵育30min后，精子活力、VAP、VSL和VCL均显著低于对照组。

3.TLR7/8激动剂处理后X、Y精子在上层和下层精子中的百分比测定

(1)分选精液孵育测定精子活率后，采用流式细胞仪重分析法测定X、Y精子在上层和下层精子中的百分比；

(2)取5mL分离管，首先加入12μL荧光染料，然后加入1mL Tris鞘液(pH 8.0)，最后取20μL精液(分选后上下层精液)加入管内，轻轻摇晃后置于37℃水浴锅孵育50min；

(3)孵育完成后，采用超声波处理分离后精子(脉冲设为6，时间为1s)，调整好仪器进行再分离，根据软件要求计算出X/Y精子在上层和下层精液中的百分比。

图5所示结果说明，精子在1μM R848分选液中孵育30min，“浮游系统”下层精子活力显著低于上层精子，而上层和下层精子的质膜完整性和顶体完整性差异不显著。通过免疫荧光染色检测发现，“浮游系统”下层精子TLR8阳性信号高于上层精子。使用流式细胞仪检测X、Y精子在“浮游系统”上层和下层精子中的百分比，结果表明“浮游系统”上层精子(Y精子)的百分比为90.50％±2.86％，下层精子(X精子)的百分比为80.30％±2.91％。

4.ATP水平检测

精子ATP水平检测参考北京索莱宝科技有限公司的ATP水平检测试剂盒(BC0305)的操作方法，具体步骤如下：

(1)ATP标准液配制：将10μmol/mL的ATP标准品溶液用蒸馏水稀释16倍，即0.625μmol/mL标准溶液；

(2)工作液配制：临用前请按试剂二:试剂三:试剂四:试剂五:试剂六＝1:1:0.1:0.4:0.1的比例配制，现配现用；

(3)取约0.1mL精液，加入1mL提取液，充分震荡，10000g、4℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g、4℃离心3min，取上清，置冰上待测；

(4)取20μL样品、52μL标准品、128μL试剂一充分混合后，立即测定340nm下10s的吸光值A1，然后将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中反应3min，拿出擦拭干净立即测定其在3min、10s时的吸光值A2。用96孔板则放入37℃培养箱中(酶标仪若自带控温功能，则将温度调至37℃)。分别计算ΔA测定＝A2测定管-A1测定管，ΔA标准＝A2标准管-A1标准管；

(5)ATP含量(μmol/mL)＝ΔA测定÷(ΔA标准÷C标准)×(V提取+V血清)÷V血清＝6.875×ΔA测定÷ΔA标准。

图6所示结果说明，在1μM R848分选液中孵育30min后，精子ATP水平均显著低于对照组，其中“浮游系统”上层精子ATP水平显著高于下层精子(图6a和图6b)。

5.线粒体活性检测

使用荧光染料JC-1对精子的线粒体膜电位进行检测，精子线粒体活性越高，其红色荧光强度越强。操作如下：

(1)取300μL的精液样品，800g离心5min，收集沉淀；

(2)用400μL新配置的JC-1染色工作液重悬精子，37℃避光孵育30min；

(3)孵育结束后，800g离心5min，弃上清，加入JC-1染色缓冲液洗涤2～3遍；

(4)用JC-1染色缓冲液重悬后沉淀，调整精子密度为1×10

结果如图6所示，说明精子在1μM R848分选液中孵育15min后，精子线粒体活性显著低于对照组，其中“浮游系统”上层精子线粒体活性显著高于下层精子(图6c和图6d)。

6.Western blotting检测

(1)精液在含250μL RIPA和2.5μL PMSF的细胞裂解缓冲液中冰浴30min，获得总蛋白裂解物，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。蛋白样品中加入5×SDS Loading Buffer，100℃煮沸10min变性；

(2)变形后的蛋白质样品(每孔20μg蛋白)在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。蛋白经SDS-PAGE分离后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，经5％脱脂奶或5％BSA封闭1h后，与指定的一抗孵育(按说明书稀释比例进行稀释)；

(3)一抗：AKT磷酸化、NFκB磷酸化、GSK3α/β磷酸化、总AKT、总NFκB和总GSK3α/β。PVDF膜与一抗在4℃孵育过夜。一抗过夜孵育后，取出PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10min；

(4)洗涤后的PVDF膜与二抗稀释液(相应的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗与TBST按1:10000稀释)在37℃下孵育1h。二抗孵育后，取出PVDF膜用TBST洗涤5次，每次6min；

(5)用ECL化学发光检测目的蛋白，并用Image J软件定量。以Tubulin蛋白作为内参。

结果如图6所示，说明精子在R848分选液中孵育15min和30min，精子中NFκB和GSK3α/β磷酸化表达量显著高于对照组，但AKT磷酸化与对照组差异不显著(图6e和6g)。精子在1μM R848分选液中孵育30min，“浮游系统”下层精子(X精子)显著高于上层精子(Y精子)(图6f和6h)。以上结果表明，精子特异蛋白TLR7/8激动剂R848通过NFκB和GSK3α/β磷酸化途径调节ATP水平和线粒体活性，从而影响X精子运动。

7.体外受精胚胎性别检测

(1)取3mL精液于灭菌的离心管内离心(800rpm离心5min)，加入精子获能液(IVFBioscience)置于37℃培养箱孵育30min；

(2)收集卵巢放置于37℃生理盐水中带回实验室，抽取卵泡液置于试管，静置15min后弃上清，将沉淀物用2mL的卵母细胞清洗液(IVF Bioscience)重悬。然后铺洒在培养皿，置于体视显微镜下挑选完整的COC复合物。随后置于山羊卵母细胞清洗液中清洗3次，然后置于山羊卵母细胞成熟液(IVF Bioscience)中培养24h至成熟。在体视显微镜下挑选成熟的卵母细胞，用于后续体外受精；

(3)将受精卵在培养液中清洗3次，然后将受精卵置于50μL的微滴中，覆盖上矿物油置于38.5℃培养箱中培养。在培养168h后置于体视显微镜下观察囊胚，将培养成熟的囊胚进行性别鉴定；

(4)将培养成熟的囊胚转移至PBS(含0.01％BSA)中洗涤，首先置于0.2mL无酶离心管，其中含2.5μL基因组提取物(1mg/mL蛋白酶K，0.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH＝8.0)，然后在65℃孵育3h，95℃孵育10min，最后使用KOD FX Neo(TOYOBO Life Science)进行PCR分析，产生识别X染色体或Y染色体的特异性引物，将其用于PCR反应。PCR产物用2％(w/v)琼脂糖凝胶进行分离，在100V电压下电泳25min，凝胶成像仪观察扩增产物电泳结果。

山羊SRY和β-ACTIN基因的扩增PCR引物序列见表1。

表1奶山羊SRY和β-ACTIN基因的PCR扩增引物序列

结果如图7所示，所示结果说明使用分选后X精子进行IVF获得了43枚胚胎，其中35枚是XX胚胎(80.52％±6.75％)，8枚是XY胚胎(19.48％±6.75％)(图7a)。

8.人工授精胚胎性别检测

(1)将选取的母羊进行同期发情、超数排卵处理，待发情后用分选后的X精子进行人工授精，隔12h再进行人工授精一次；

(2)采用手术法进行胚胎采集，采集新鲜胚胎置于体视显微镜下观察，将成熟的囊胚转移至PBS(含0.01％BSA)中洗涤，置于0.2mL无酶离心管，其中含2.5μL基因组提取物(1mg/mL蛋白酶K，0.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH＝8.0)，然后在65℃孵育3h，95℃孵育10min，使用KOD FX Neo(TOYOBO Life Science)进行PCR分析。产生识别X染色体或Y染色体的特异性引物，将其用于PCR反应。PCR产物用2％(w/v)琼脂糖凝胶进行分离，在100V电压下电泳25min，凝胶成像仪观察扩增产物电泳结果。

结果如图7所示，在6只超数排卵处理的奶山羊中，其中5只奶山羊发情并利用分选后的X精子进行人工授精，手术法采集获得9枚胚胎，其中8枚是XX胚胎(88.89％)，1枚是XY胚胎(11.11％)(图7b)。